细胞工程动物细胞培养工程.pptx

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1、45 动物细胞培养过程的 放大与优化451 动物细胞培养工艺的研究第1页/共43页A、开发重要性：真核细胞表达产物糖基化，有疗效；动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白药物，2.6g/人、年6154美元/g=16000美元，2002年，销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优化生产工艺，提高产量。B、主要内容：生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。C、初步研究：首先必须

2、较快建立一个基本（不要求是最优）的细胞培养工艺。第2页/共43页452 动物细胞培养工艺的优化A、影响蛋白质产量的关键参数，营养物耗尽；B、决定细胞浓度 有毒废物的积累 的关键参数 培养物理条件的恶化 提高蛋白质表达水平C、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制 优化策略 流加工艺的优化第3页/共43页453 动物细胞培养工艺的放大A、生物反应器尺寸放大 鼓泡B、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法 搅拌速率和搅拌器的设计C、混合 剪切力和细胞损伤D、工业生产中的动物细胞培养 第4页/共43页46 动物细胞代谢工程461 概述 A、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化

3、的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳，需要对细胞代谢途径进行修饰；第5页/共43页B、代谢控制发酵（metabolic control fermentetion）是指利用遗传学或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵；C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出和形成了“代谢工程”概念；第6页/共43页D、代谢工程（也称途径工程，pathway engineering）是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功

4、能，甚至改变产能系统的功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络有目的地被修饰。第7页/共43页462 基本原理A、代谢网络理论细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又互相协调；代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔性节点；柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；第8页/共43页 生物合成相关代谢调节和调节网络理论代谢工程 代谢流及节点分析 理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设

5、计 主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析B、代谢流及中间产物分析静态分析C、代谢控制分析动态分析第9页/共43页463 代谢调节的基本类型及其机制A、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制 合作反馈控制 累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制第10页/共43页B、酶合成及酶活性的调节机制 末端代谢产物阻遏酶的阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏和酶的诱导 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工 多功能酶 第11页/共43页464 代谢工程的研究方法 A、设计思路改变代谢流 扩展代谢途径和构建新的代谢途径 常规方法分子生物、生化、物化 代谢通量分析（MFA）静态B、研究

6、代谢控制分析（MCA）动态 方法 代谢网络 生化系统理论（BST）最优化原理 定量分析 控制论模型（CM）非线性 途径分析途径定位 第12页/共43页 细胞代谢模型C、代谢模型的 发展与优化 神经网络 计算生物学方法 遗传算法 D、逆代谢工程 第13页/共43页47 动物细胞工程产品制备及质控 471 动物细胞工程产品制备 A、初级分离离心、过滤、吸附 B、纯化色谱法 C、制剂与冷冻干燥第14页/共43页472 动物细胞工程产品的质量控制 PAGE 纯度 SDS-PAGE 液相色谱 A、物化指标测定 含量 B、安全性评介 分子量 C、稳定性 第15页/共43页48 动物细胞工程表达产品的应用

7、481 重组蛋白药物 第16页/共43页第17页/共43页第18页/共43页 A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体 Tenecteplase，商 品 名 TNKaseTM，急性心肌梗死病人溶栓治疗，人t-PA基因位于8号染色体p12-q11.2，全长36594bp，14个外显子，13个内含子，t-PA由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始 酵母表达，不能分离纯化 t-PA突变体，由双链糖蛋白，现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）第19页/共43页第20页/共43页B、-干扰素（IFN-）最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱

8、发，现为一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，第21页/共43页 天然IFN-刺激体外培养人成纤维细胞，大肠杆菌表达，活性低，不稳定，Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化 重组IFN-点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸，如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化，分离简单。第22页/共43页C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）D、血友病缺少凝血因子（F）或含量过低疾病第23页/共43页第24页/共43页482 MAb药物（参见下图）因为体内同一抗原具多个表位，刺 激机体产生不同抗体（多克隆抗体）杂交瘤技术

9、能将多克隆抗体纯化为具 有高度均一性，抗原识别专一性的MAb，降低抗原识别交叉反应；第25页/共43页第26页/共43页第27页/共43页第28页/共43页483基因工程与亚单位疫苗 第29页/共43页A、乙肝疫苗（参见下图）衣壳衣壳表面抗原（HBsAg），核心抗原 核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸 第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应，81-82年，美法，85年，中国 第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，81年，法美，91、92年，中国 第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO细胞表达 第30页/共43页第31页/共43页B、艾滋病疫苗（参见下图）CHO表

10、达疫苗理论上，有致瘤性昆虫细胞表达疫苗昆虫细胞-杆状病毒表达系统 （安全性好，容量大，表达效率高）第32页/共43页第33页/共43页C、肿瘤疫苗 灭活自体肿瘤细胞 对细胞因子基因修饰，主动 加强疫苗免疫原性 免疫 同种异体的肿瘤细胞 树突状细胞（抗原提呈细胞）体内外诱导CTL生成 （细胞毒性T淋巴细胞）激发特异性抗肿瘤免疫功能第34页/共43页（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名:赫赛汀）第35页/共43页（Zevalin泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，2002年在美国上市，被批准用于难治复发B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗。）第36页/共43页484 基因治疗产品 基因治疗（gene

11、 therapy）是指把外界的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导，还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行细胞治疗。第37页/共43页A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：第38页/共43页第39页/共43页B、造血干细胞治疗癌症 HSC基因（参见下图）第40页/共43页 胰岛素依赖型（I）C、细胞、基因 代谢 治疗糖尿病 紊乱 非胰岛素依赖型（II）第41页/共43页【习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系：单抗与疫苗单抗与疫苗 悬浮培养与贴壁培养悬浮培养与贴壁培养 流加工艺与灌流工艺流加工艺与灌流工艺 CHOCHO与与HNKHNK tPA tPA与与EPOEPO（NESPNESP）艾滋病疫苗与肿瘤疫）艾滋病疫苗与肿瘤疫苗苗基因治疗与细胞治疗基因治疗与细胞治疗 CNTFCNTF与与HSCHSC2 2、简述乙肝疫苗发展历程？试规划肝癌疫苗的发展策略？第42页/共43页感谢您的观看！第43页/共43页