餐饮具的微生物检验技术课件.ppt

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1、餐饮具的微生物检验餐饮具的微生物检验技术技术第1页，此课件共47页哦 饮食业食饮具消毒是控制肠道传染病发生和流行的重要环节之一，现行有效的国家标准为GB 14934-94食（饮）具消毒卫生标准。该标准适用于宾馆、饭店、餐厅、食堂等饮食企业的食（饮）具，也适用于个体摊点的食（饮）具。第2页，此课件共47页哦一、餐饮具消毒指标(感官指标、理化指标、细菌指标)1 感官指标1.1物理消毒（包括蒸汽、煮沸等热消毒）：食（饮）具必须表面光洁、无油渍、无水渍、无异味。1.2化学消毒：食（饮）具表面必须无泡沫、无洗消剂的味道，无不溶性附着物。第3页，此课件共47页哦2 2理化指理化指标标 采用化学消毒的食（采

2、用化学消毒的食（饮饮）具，必）具，必须须用用洁净洁净水清水清洗，消除残留的洗，消除残留的药药物。用含物。用含氯氯洗消洗消剂剂消毒的食（消毒的食（饮饮）具表面残留量，具表面残留量，应应符合表符合表1 1的要求。的要求。表表1 1 理化指理化指标标项 目指 标游离性余氯，mg/L 0.3烷基（苯）磺酸钠，mg/100cm2 0.1第4页，此课件共47页哦3 3 细菌指标细菌指标 采用物理或化学消毒的食（饮）具均必须达到表采用物理或化学消毒的食（饮）具均必须达到表2 2的要求。的要求。（发酵法与纸片法任何一法的检验结果均可作为判定依（发酵法与纸片法任何一法的检验结果均可作为判定依据。据。）表表2 2

3、 细菌指标细菌指标项 目指 标大肠菌群发酵法,个/100cm2 3纸片法,个/50cm2不得检出致病菌不得检出第5页，此课件共47页哦二采样与检验方法二采样与检验方法1 1发酵法检测大肠菌群发酵法检测大肠菌群1.11.1采样方法采样方法食（饮）具抽检碗、盘、口杯，将食（饮）具抽检碗、盘、口杯，将2.0cm2.5cm2.0cm2.5cm（5cm5cm2 2）灭菌滤纸片紧贴内面各灭菌滤纸片紧贴内面各1010张（总面积张（总面积50 cm50 cm2 2、）、碟、匙、）、碟、匙、酒杯以每酒杯以每5 5件为件为1 1份，每件内面紧贴灭菌滤纸片各份，每件内面紧贴灭菌滤纸片各2 2张（总张（总面积面积50

4、 cm50 cm2 2/份）份）,经经1min1min，按序取置入，按序取置入50 mL50 mL灭菌盐水试管灭菌盐水试管中，充分振荡后，制成原液。中，充分振荡后，制成原液。筷：取每双的下段筷：取每双的下段12 cm12 cm处约处约50 cm50 cm2 2（l2cm2cm2cml2cm2cm2cm），置入），置入50 mL 50 mL 灭菌盐水试管中，充分振荡灭菌盐水试管中，充分振荡2020次，制成原次，制成原液。液。第6页，此课件共47页哦第7页，此课件共47页哦1.2操作步骤1.2.1 1.2.1 初发酵试验初发酵试验 选择选择3 3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品个适宜的连续稀

5、释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种可以选择原液），每个稀释度接种3 3管月桂基硫酸盐胰蛋管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（白胨（LSTLST）肉汤，每管接种）肉汤，每管接种1mL1mL，36361 1 培养培养24 h2 h24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h24 h2 h产气者进行复发酵产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至试验，如未产气则继续培养至48 h2 h48 h2 h，产气者进行复发酵，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。试验。未产气者为大肠菌群阴性。第8页，此课件共47页哦1.2.2 复发酵试验 用接种环从产气

6、的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。第9页，此课件共47页哦1.2.3 大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按1.2.2 确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见GB4789.3-2010附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。第10页，此课件共47页哦1.2.4 MPN表(GB4789.3-2010附录B)表B 大肠菌群最可能数.doc第11页，此课件共47页哦2 2纸片法检测大肠菌群纸片法检测大肠菌群食（饮）具消毒采用专用的大肠菌群快速检验纸片。食（饮）具消毒采用专用

7、的大肠菌群快速检验纸片。2.12.1采样方法采样方法随机抽取消毒后准备使用的各类食具（碗、盘、杯等），取随机抽取消毒后准备使用的各类食具（碗、盘、杯等），取样量可根据大、中、小不同饮食行业样量可根据大、中、小不同饮食行业,每次采样每次采样6 61010件件,每件贴纸每件贴纸片两张片两张,每张纸片面积每张纸片面积25cm25cm2 2（5cm5cm5cm5cm）用无菌生理盐水湿）用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，润大肠菌群检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s30s后取后取下，置于无菌塑料袋内。下，置于无菌塑料袋内。筷子以筷子以5 5只为一件样品，用毛细吸管吸取无

8、菌生理盐水湿只为一件样品，用毛细吸管吸取无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm5cm）抹拭纸片，每件样品抹）抹拭纸片，每件样品抹拭两张，放入无菌塑料袋内。拭两张，放入无菌塑料袋内。第12页，此课件共47页哦2.2检验方法将已采样的纸片置37培养1618 h，若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。第13页，此课件共47页哦3 致病菌检验 GB 4789.4-2010 沙门氏菌检验.mht GB 4789.10-2010金黄色葡萄球菌检验.mht GB/T 4789.5-2003 志贺氏菌检验.mht GB

9、/T 4789.11-2003溶血性链球菌检验.mht 3.1 沙门氏菌检验第14页，此课件共47页哦沙 门 氏 菌 属 简 介 沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现抗原结构复杂，现已发现抗原结构复杂，现已发现抗原结构复杂

10、，现已发现3000300030003000多个血清型，我国已发现血多个血清型，我国已发现血多个血清型，我国已发现血多个血清型，我国已发现血清型近清型近清型近清型近200200200200个。个。个。个。形态特征：形态特征：革革革革兰兰兰兰氏氏氏氏阴阴阴阴性性性性，大大大大小小小小为为为为130.40.9m130.40.9m130.40.9m130.40.9m的的的的两两两两端端端端钝钝钝钝圆圆圆圆的的的的短短短短杆杆杆杆菌菌菌菌，无无无无芽芽芽芽孢孢孢孢，一一一一般般般般无无无无荚荚荚荚膜膜膜膜，除除除除鸡鸡鸡鸡沙沙沙沙门门门门氏氏氏氏菌菌菌菌和和和和雏雏雏雏沙沙沙沙门门门门氏氏氏氏菌菌菌菌以

11、外，都有周身鞭毛，运动力强。以外，都有周身鞭毛，运动力强。以外，都有周身鞭毛，运动力强。以外，都有周身鞭毛，运动力强。第15页，此课件共47页哦伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌 沙沙沙沙门门门门氏氏氏氏菌菌菌菌典典典典型型型型群群群群落落落落第16页，此课件共47页哦检检检检 样样样样25g(ml)25g(ml)25g(ml)25g(ml)样品样品样品样品+225mlBPW+225mlBPW+225mlBPW+225mlBPW1ml+TTB10ml1ml+TTB10ml1ml+SC10ml1ml+SC10ml361 361 361 361，8h-18h8h-18h8h-18h8

12、h-18hBSBSXLD(XLD(或或或或HEHE、显色培养基、显色培养基、显色培养基、显色培养基)挑取可疑菌落挑取可疑菌落挑取可疑菌落挑取可疑菌落 42 1 42 1 42 1 42 1，18h24h18h24h18h24h18h24h 36 1 36 1 36 1 36 1，18h24h18h24h18h24h18h24h36 1 36 1 36 1 36 1，40h48h40h48h40h48h40h48h36 1 36 1 36 1 36 1，18h24h18h24h18h24h18h24h沙门氏菌检验程序第17页，此课件共47页哦生化鉴定生化鉴定生化鉴定生化鉴定试剂盒试剂盒试剂盒试剂

13、盒或全自动或全自动或全自动或全自动微生物微生物微生物微生物生化鉴定生化鉴定生化鉴定生化鉴定系统系统系统系统+A1A1A2A2A3A3反应反应反应反应结果结果结果结果与左侧与左侧与左侧与左侧描述描述描述描述不符不符不符不符 甘露醇甘露醇甘露醇甘露醇+、山梨醇、山梨醇、山梨醇、山梨醇+ONPG-ONPG-ONPG-ONPG-沙门氏菌，血清学试验沙门氏菌，血清学试验沙门氏菌，血清学试验沙门氏菌，血清学试验 非沙门氏菌非沙门氏菌非沙门氏菌非沙门氏菌 报报报报 告告告告TSITSI，赖氨酸，赖氨酸，赖氨酸，赖氨酸，NANA，靛基质，尿素（，靛基质，尿素（，靛基质，尿素（，靛基质，尿素（pH7.2pH7.

14、2），），），），KCNKCN第18页，此课件共47页哦3.2.2 3.2.2 操作步骤操作步骤(1)(1)前增菌前增菌无菌操作将样品转至无菌操作将样品转至 500 mL 500 mL 锥形瓶中，于锥形瓶中，于 36 36 1 1 培养培养 8 h8 h 18h18h。(2)(2)增菌增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL1 mL，转种于，转种于 10 mL TTB 10 mL TTB 内，于内，于 42 42 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h。同时，另取。同时，另取 1 mL1 mL，转种于，转种于 10 mL SC 10 mL SC

15、 内，内，于于 36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h。(3)(3)分离培养分离培养分别用接种环取增菌液分别用接种环取增菌液 1 1 环，划线接种于一个环，划线接种于一个 BS BS 琼脂平板和一个琼脂平板和一个 XLD XLD 琼脂平板（或琼脂平板（或 HE HE 琼脂琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于于 36 36 1 1 分别培养分别培养 18 h18 h24 h 24 h（XLD XLD 琼脂平板、琼脂平板、HE HE 琼脂琼脂 平板、平板、沙门氏菌属显色培养基平板）沙门氏菌属显色培养基平板）或或 40 h40 h48

16、h 48 h（BS BS 琼脂平板），观琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表各个平板上的菌落特征见表 1 1。第19页，此课件共47页哦表表1 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS 琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE 琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD 琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全

17、部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。第20页，此课件共47页哦(4)(4)生化试验生化试验 接种三糖铁琼脂接种三糖铁琼脂 自选择性琼脂平板上分别挑取自选择性琼脂平板上分别挑取 2 2 个以上典型或个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于试验培养基和营养琼脂平板，于 36 36 1 1 培养培养 18 18 h h24 h24 h，必要时可延长至，必要时可

18、延长至 48 h48 h。在三糖铁琼脂和赖氨。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属 的反应结果见表的反应结果见表 2 2。第21页，此课件共47页哦表表 22沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA（）（）可疑沙门氏菌属KA（）（）可疑沙门氏菌属AA（）（）可疑沙门氏菌属AA/非沙门氏菌KK/非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸；：阳性，：阴性；（）：多数阳性，少数阴性；/：阳性或阴性第22页，此课件共47页哦其他生

19、化试验其他生化试验:接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试（供做靛基质试 验）、尿素琼脂验）、尿素琼脂 （pH7.2pH7.2）、氰化钾）、氰化钾 （KCNKCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑 取可疑菌落取可疑菌落接种。于接种。于 36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h，必要时可延长至，必要时可延长至 48 h48 h，按表，按表 3 3 判判定结果。将已挑菌定结果。将已挑菌 落的平板储存于落的平板储存于

20、 2 2 5 5 或室温至少保留或室温至少保留 24 h24 h，以备必要时复查。以备必要时复查。表表 3 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号 硫化氢（H2S）靛基质 pH7.2尿素 氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶 A1 A2 A3 /注：阳性；阴性；/阳性或阴性。注：阳性；阴性；注：阳性；阴性；/阳性或阴性。阳性或阴性。第23页，此课件共47页哦结果判定结果判定:反应序号反应序号 A1A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCNKCN和赖氨和赖氨酸脱羧酶酸脱羧酶 33项中有项中有 11项异常，按表项异常，按表 44可判定为

21、沙门氏菌。可判定为沙门氏菌。如有如有 22项异常为项异常为非沙门氏菌。非沙门氏菌。表表 44沙门氏菌属生化反应初步鉴别表沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：表示阳性；表示阴性。注：表示阳性；表示阴性注：表示阳性；表示阴性第24页，此课件共47页哦反应序号反应序号 A2A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合

22、血清学鉴定结果进行判定。定结果进行判定。反应序号反应序号 A3A3：补做：补做 ONPGONPG。ONPG ONPG 阴性为沙门氏菌，阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒甲型副伤寒 沙门氏菌为赖氨酸沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。脱羧酶阴性。第25页，此课件共47页哦a a）抗原的准备抗原的准备抗原的准备抗原的准备 一般采用一般采用一般采用一般采用 1.21.21.51.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如血

23、清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2 2 3 3）培养培养培养培养基上再检查；如果是由于基上再检查；如果是由于基上再检查；如果是由于基上再检查；如果是由于Vi Vi 抗原的存在而阻止了抗原的存在而阻止了抗原的存在而阻止了抗原的存在而阻止了O O 凝集反应时，可凝集反应时，可凝集反应时，可凝集反应时，可挑取菌苔于挑取菌苔于挑取菌苔于挑取菌苔于 1 mL 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再生理盐水中做成

24、浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。检查。检查。检查。H H 抗原发育不良时，将菌株接种在抗原发育不良时，将菌株接种在抗原发育不良时，将菌株接种在抗原发育不良时，将菌株接种在0.550.550.650.65半固体琼脂平板半固体琼脂平板半固体琼脂平板半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.30.30.40.4半固体琼脂的小玻管半固体琼脂的小玻管半固体琼脂的小玻管半固

25、体琼脂的小玻管1 1次次次次2 2 次次次次,自远端取菌培养后再检查。自远端取菌培养后再检查。自远端取菌培养后再检查。自远端取菌培养后再检查。(5)(5)血清学鉴定血清学鉴定 返回返回第26页，此课件共47页哦 b b）多价菌体抗原（）多价菌体抗原（）多价菌体抗原（）多价菌体抗原（OO）鉴定）鉴定）鉴定）鉴定 在玻片上划出在玻片上划出在玻片上划出在玻片上划出2 2 个约个约个约个约 1 cm2 cm 1 cm2 cm 的区域，挑取的区域，挑取的区域，挑取的区域，挑取1 1 环待测菌，各环待测菌，各环待测菌，各环待测菌，各放放放放 1/2 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加环

26、于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加 1 1 滴多滴多滴多滴多价菌体（价菌体（价菌体（价菌体（OO）抗血清，在另一区域下部加入）抗血清，在另一区域下部加入）抗血清，在另一区域下部加入）抗血清，在另一区域下部加入1 1 滴生理盐水，作滴生理盐水，作滴生理盐水，作滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将

27、玻片倾斜摇动混合乳状液。将玻片倾斜摇动混合乳状液。将玻片倾斜摇动混合乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min1 min，并对着黑暗背景进行观察，并对着黑暗背景进行观察，并对着黑暗背景进行观察，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。任何程度的凝集现象皆为阳性反应。任何程度的凝集现象皆为阳性反应。任何程度的凝集现象皆为阳性反应。c c）多价鞭毛抗原（）多价鞭毛抗原（）多价鞭毛抗原（）多价鞭毛抗原（HH）鉴定）鉴定）鉴定）鉴定 同同同同b b）。）。）。）。返回返回第27页，此课件共47页哦3.2 金黄色葡萄球菌检验3.2.1 检验程序第28页，此课件共47页哦金黄色葡萄球菌定性检验

28、程序见图金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1 1。第29页，此课件共47页哦3.2.2 3.2.2 增菌和分离培养增菌和分离培养(1)(1)增菌增菌:将上述样品匀液于将上述样品匀液于 36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h。金黄色葡。金黄色葡萄球菌在萄球菌在 7.5%7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生氯化钠肉汤中呈混浊生 长。长。(2)(2)分离培养分离培养:将上述培养物，分别划线接种到将上述培养物，分别划线接种到 Baird-Parker Baird-Parker 平板和平板和血平板，血平板血平板，血平板 36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h。Bair

29、d-Parker Baird-Parker 平板平板 36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h 24 h 或或 45 h45 h48 h48 h。(3)(3)菌落特征菌落特征:金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker Baird-Parker 平板上，菌落直径为平板上，菌落直径为 2 2 mmmm3 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为，颜色呈灰色到黑色，边缘为 淡色，周围为一混浊淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。在血平板上，形成菌落较大，圆形、带，在其外层有一透明圈。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色）

30、，菌落周围可见完全金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固 酶酶试验。试验。第30页，此课件共47页哦3.2.3 3.2.3 鉴定鉴定 (1)(1)染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为无芽胞，无荚膜，直径约为0.5m0.5m1m1m。(2)(2)血浆凝固酶试验：挑取、血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落 1 1

31、 个或以上，分别接种到个或以上，分别接种到 5 mL BHI 5 mL BHI 和营养琼脂小斜面，和营养琼脂小斜面，36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h。取新鲜配置兔血浆取新鲜配置兔血浆 0.5 mL0.5 mL，放入小试管中，再加入，放入小试管中，再加入 BHI BHI 培培养物养物 0.2 mL0.2 mL0.3 mL0.3 mL，振荡摇匀，置，振荡摇匀，置 36 36 1 1 温箱或水浴箱内，温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察每半小时观察一次，观察 6 h6 h，如呈现凝固或凝固体积大于原体，如呈现凝固或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆

32、凝固酶试验阳性积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌和阴性葡萄球菌菌 株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI5 mL BHI，36 36 1 1 培养培养 18 h18 h48 h48 h，重复试验。，重复试验。第31页，此课件共47页哦3.3 3.3 溶血性链球菌检验溶血性链球菌检验 3.3.1 3.3.1 检验程序检验程序 第32页，此课件共47页哦3

33、.3.2 3.3.2 操作步骤操作步骤(1)(1)增菌培养增菌培养 将样液吸取将样液吸取5 mL5 mL，接种于，接种于50 mL50 mL葡萄糖肉浸液肉汤，或葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种子血平板。如检样污染严重，可同时按直接划线接种子血平板。如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经上述量接种匹克氏肉汤，经3636士士l l培养培养24 h24 h，接种，接种血平板。血平板。（2 2）形态与染色）形态与染色 血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约滑，有乳光，直径约0.5mm0.5mm0.75 mm0.75 mm，为

34、圆形突起的细，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有小菌落，乙型溶血链球菌周围有2 mm2 mm4 mm4 mm界限分明、界限分明、无色透明的溶血圈。无色透明的溶血圈。为革兰氏阳性球菌。为革兰氏阳性球菌。第33页，此课件共47页哦（3 3）生化试验）生化试验链激酶试验：吸取草酸钾血浆链激酶试验：吸取草酸钾血浆0.2 ml0.2 ml，加，加0.8 mL0.8 mL灭菌灭菌生理盐水，混匀，再加入生理盐水，混匀，再加入18 h18 h24 h24 h、3636士士1 1培养的培养的链球菌培养物链球菌培养物0.5mL0.5mL及及0.25%0.25%氯化钙氯化钙0.25 ml0.25 ml（如氯

35、化钙已（如氯化钙已潮解，可适当加大至潮解，可适当加大至0.3%0.3%0.35%0.35%），振荡摇匀，置于），振荡摇匀，置于3636士士1 1水浴中水浴中10 min10 min，血浆混合物自行凝固（凝固，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动），然后观察凝固块重程度至试管倒置，内容物不流动），然后观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24 h24 h后不溶解后不溶解即为阴性。即为阴性。第34页，此课件共47页哦杆菌肽敏感试验挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于3

36、6士1培养18 h24 h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。第35页，此课件共47页哦3.4 3.4 志贺氏菌检验志贺氏菌检验GBT 4789.5-2003 GBT 4789.5-2003 食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验志贺氏菌检验.pdf.pdf（1 1）增菌）增菌 吸取检样吸取检样25mL25mL，加入装有，加入装有225mLGN225mLGN增菌液的增菌液的500mL500mL广口瓶内，于广口瓶内，于3636培养培养68h68h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即

37、应中止培养。（2 2）分离培养和初步生化试验）分离培养和初步生化试验 取增菌液取增菌液1 1环，划线接种于环，划线接种于HEHE琼脂平板或琼脂平板或SSSS琼脂平板琼脂平板1 1个；另取个；另取1 1环划线接种于麦环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1 1个，于个，于3636培养培养1824h1824h。志贺氏菌在这些培志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。第36页，此课件共47页哦HEHE平板照片平板照片发酵乳糖的某种肠杆菌发酵乳糖的某种肠杆菌不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌不发酵

38、乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌 不发酵乳糖，呈蓝绿色或蓝色不发酵乳糖，呈蓝绿色或蓝色,可能就是志贺氏菌可能就是志贺氏菌第37页，此课件共47页哦沙门氏菌有黑色中心沙门氏菌有黑色中心,如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了 。SSSS平板照片平板照片第38页，此课件共47页哦不发酵乳糖不发酵乳糖 发酵乳糖发酵乳糖麦康凯平板照片麦康凯平板照片菌落为粉红色，半透明的，菌落为粉红色，半透明的，可能为志贺氏菌。可能为志贺氏菌。第39页，此课件共47页哦EMB平板照片平板照片菌落为无色半透明状，可能为志贺氏菌。菌落为无色半透明状，可能为志贺氏菌。第4

39、0页，此课件共47页哦 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各固体各1 1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经3636培培养养1824h1824h，分别观察结果。，分别观察结果。2 2志贺氏菌志贺氏菌志贺氏菌志贺氏菌3 3沙门氏菌沙门氏菌沙门氏菌沙门氏菌4 4大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌志贺氏菌志贺氏菌TSITSI斜面仍为斜面仍为红色；底层产酸不产红色；底层产酸不产气，变黄色；不产气，变黄色；不产H2SH2S，不出现黑色。，不出现黑色。第41页，此课件共47页哦下述培养物可以弃去：下述培养物可以

40、弃去：a.a.在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b.b.在在1824h1824h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c.c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d.d.产气的培养物；产气的培养物；e.e.有动力的培养物；有动力的培养物；f.f.产生硫化氢的培养物。产生硫化氢的培养物。凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏福氏志贺氏菌志贺氏菌6 6型可产生少量气体型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做，无动力的菌株，可做进一步的生化试验和血清学分型

41、。进一步的生化试验和血清学分型。第42页，此课件共47页哦(3)(3)进一步的生化试验进一步的生化试验 葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、pH7.2pH7.2尿素、尿素、KCNKCN生长、生长、水杨苷和七叶苷的分解。水杨苷和七叶苷的分解。志贺氏菌属的培养物均为阴性结果志贺氏菌属的培养物均为阴性结果(除宋内氏菌和鲍氏除宋内氏菌和鲍氏1313型为型为鸟氨酸阳性外鸟氨酸阳性外)。葡萄糖铵葡萄糖铵:阳性者斜面上有正常大小的菌落阳性者斜面上有正常大小的菌落,阴性者不生长或生阴性者不生长或生 长长极微小的菌落。极微小的菌落。西蒙氏柠檬酸盐：阳性

42、者斜面上菌落生长，培养基由绿色转为蓝色，阴西蒙氏柠檬酸盐：阳性者斜面上菌落生长，培养基由绿色转为蓝色，阴性者不生长。性者不生长。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶：阳性者为紫色，阴性者为黄色。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶：阳性者为紫色，阴性者为黄色。pH7.2pH7.2尿素：阳性者为红色，阴性者为黄色。尿素：阳性者为红色，阴性者为黄色。KCNKCN：阳性者细菌生长，阴性者细菌不生长。：阳性者细菌生长，阴性者细菌不生长。水杨苷和七叶苷：阳性者产气。水杨苷和七叶苷：阳性者产气。第43页，此课件共47页哦 生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。已判定为志贺氏菌属的培养

43、物，应进一步做5%乳糖发酵、甘露醇、棉子糖、甘油的发酵、靛基质试验。志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。第44页，此课件共47页哦志志贺贺氏菌四个群的生化特性氏菌四个群的生化特性生化群5%乳糖甘露醇棉子糖甘油靛基质A群：痢疾志贺氏菌-（+）-/+B群：福氏志贺氏菌-+-（+）C群：鲍氏志贺氏菌-+-（+）-/+D群：宋内氏志贺氏菌+（+）+d-注：注：+阳性；阳性；-阴性；阴性；-/+-/+多数阴性，少数阳性多数阴性，少数阳性 第45页，此课件共47页哦(4)(4)血清学分型血清学分型 挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。挑取三糖铁琼

44、脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用先用4 4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K K抗原的存在而不抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用如果呈现凝集，则用A1A1、A2A2、B B群多价和群多价和DD群血清分别试验。群血清分别试验。如系如系B B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1 1。可先用群因子血清检查，。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血

45、清检查。再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1 1、2 2、3 3分别检分别检查，并进一步用查，并进一步用115115各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌，可用痢疾志贺氏菌312312型多价血清及各型因子血清检查。型多价血清及各型因子血清检查。(5)(5)结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。第46页，此课件共47页哦三、细菌实验室配置 1.细菌检验操作室（细菌检验操作室是细菌培养与检验主要操作室，主要设施是实验台）；2.培养基制作室（培养基室是制作、配制微生物培养所需培养基及检验用试剂的场所）；3.洗涮消毒室（洗涮消毒室用以消毒洗涮待用与已用之玻璃器皿，培养基及污物）。第47页，此课件共47页哦