常用生物化学检验技术3693.pptx

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1、第五章第五章 常用生物化学检常用生物化学检验技术验技术第一节第一节光谱分析技术光谱分析技术第二节第二节电化学分析电化学分析第三节第三节电泳技术电泳技术第四节第四节层析技术层析技术第五节第五节自动生化分析自动生化分析技术技术 光谱分析技术是根据物质吸收或发光谱分析技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法，射辐射能而建立起来的一类分析方法，因不同分子的原子和原子团，其发射光因不同分子的原子和原子团，其发射光谱和吸收光谱不同，而相同的物质在一谱和吸收光谱不同，而相同的物质在一定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系。因此可度与该物质

2、的含量成正比关系。因此可对物质进行定性和定量分析，此类技术对物质进行定性和定量分析，此类技术称为光谱分析技术。称为光谱分析技术。光光谱谱分分析析技技术术是是一一种种最最常常用用的的生生化化检检验技术，它主要包括：验技术，它主要包括：吸吸收收光光谱谱分分析析：可可见见、紫紫外外、红红外外分分光光度法和原子吸收分光光度法光光度法和原子吸收分光光度法散散射射光光谱谱分分析析：散散射射比比浊浊法法和和透透射射比比浊法浊法发发射射光光谱谱分分析析：火火焰焰光光度度法法、原原子子发发射光谱法和荧光光谱法射光谱法和荧光光谱法 光光是是一一种种高高速速传传播播的的电电磁磁波波，光光的的波波长长（）的的常常用用

3、单单位位是是纳纳米米（nm），可可见见光光波波长长400 760nm，400nm称称 为为 紫紫 外外 光光，760nm称为红外光，波长愈短，能量愈大。称为红外光，波长愈短，能量愈大。可可见见、紫紫外外吸吸收收光光谱谱是是由由于于多多原原子子分分子子的的价价电电子子在在电电磁磁辐辐射射的的作作用用下下，由由基基态态跃跃迁迁到到激激发发态态，这这种种因因物物质质分分子子对对辐辐射射能能的的选选择择性性吸吸收收而得到的光谱称为而得到的光谱称为吸收光谱吸收光谱。第一节第一节 吸收光谱分析吸收光谱分析吸收光谱分析法包括吸收光谱分析法包括可见、紫外、红可见、紫外、红外和原子吸收分析法。其中最常用的是可外

4、和原子吸收分析法。其中最常用的是可见光分析法，也被不严格地称为比色分析见光分析法，也被不严格地称为比色分析法，准确的名称应是可见光分光光度法。法，准确的名称应是可见光分光光度法。用于比色分析的光源与被测溶液的颜用于比色分析的光源与被测溶液的颜色应为互补色。色应为互补色。可可见见、紫紫外外吸吸收收光光谱谱用用于于定定量量分分析析的的依依据据是是光光吸吸收收定定律律，即即Lambert-Beer定定律律，它它是吸收光谱法的基本定律。是吸收光谱法的基本定律。一、一、Lambert-Beer定律定律1.Lambert定定律律当当一一束束强强度度为为Io的的单单色色光光透透过过某某种种吸吸光光溶溶液液后

5、后，由由于于溶溶液液吸吸收收了了一一部部分分光光，则则透透过过的的光光线线为为It。当当溶溶液液浓浓度度不不变变时时，透透过过的的液层愈厚，则光线强度的减弱愈显著。液层愈厚，则光线强度的减弱愈显著。ItI0 用数学式表示为：用数学式表示为：透光度随溶液厚度增加而减少，其关系透光度随溶液厚度增加而减少，其关系是是透光度的负对数（透光度的负对数（lgT，吸光度，吸光度A）与溶）与溶液厚度成正比液厚度成正比，即，即2.Beer定定律律当当一一束束强强度度为为Io的的单单色色光光透透过过某某种种吸吸光光溶溶液液后后，若若液液层层厚厚度度不不变变，而而浓浓度度不不同同时时，溶溶液液的的浓浓度度愈愈大大，

6、则则透透过过光的强度愈弱，其定量关系光的强度愈弱，其定量关系A=KC。当当液液层层厚厚度度不不变变时时，吸吸光光度度与与溶溶液液浓浓度成正比，这就是度成正比，这就是Beer定律。定律。3.Lambert-Beer定律定律合并合并Lambert定律与定律与Beer定律可得定律可得A=KLC说说明明吸吸光光物物质质对对单单色色光光吸吸收收的的强强度度与与物物质质的的浓度和液层厚度成正比。浓度和液层厚度成正比。吸吸光光系系数数K的的物物理理意意义义是是吸吸光光物物质质在在单单位位浓浓度度及及单单位位厚厚度度时时的的吸吸光光度度，在在给给定定条条件件下下（波波长长、溶溶液液性性质质、浓浓度度）吸吸光光

7、系系数数是是物物质质的的特特征征常常数数，K值愈大，能测定的浓度值愈大，能测定的浓度C愈小，则灵敏度愈高。愈小，则灵敏度愈高。二、比色分析仪器二、比色分析仪器 即即可可见见光光分分光光光光度度计计，各各类类分分光光光光度度计计的的结结构构和和原原理理基基本本相相同同，一一般般包包括括光光源源、单单色色器、吸收池、检测器和显色器五大部分。器、吸收池、检测器和显色器五大部分。1.光光源源可可见见光光常常用用钨钨灯灯，现现用用卤卤钨钨灯灯；紫外光常用氢灯。紫外光常用氢灯。2.单色器单色器可用滤光片、棱镜、光栅。可用滤光片、棱镜、光栅。3.吸收池吸收池(比色杯比色杯)4.检测器检测器光电管或光电倍增管

8、光电管或光电倍增管5.显示器显示器指针式或数字式指针式或数字式三、比色分析的特点三、比色分析的特点1.灵敏度高灵敏度高被测定物质的最低浓度被测定物质的最低浓度一般为一般为105106mol/L。2.测定快速、简便。测定快速、简便。3.应用范围广应用范围广一些无色物质在一定一些无色物质在一定条件下与显色剂反应，可生成有色物质。条件下与显色剂反应，可生成有色物质。四、比色分析的定量方法四、比色分析的定量方法（一）对比法（一）对比法又称标准对比法，通常在测定未知浓又称标准对比法，通常在测定未知浓度样品的同时，测定一已知浓度的标准液度样品的同时，测定一已知浓度的标准液作比较，然后分别测定两者的吸光度。

9、作比较，然后分别测定两者的吸光度。AS=KLSCSAR=KLRCR因因测测定定成成分分相相同同，故故K值值相相同同，比比色色时时用用同同样样规规格格的的比比色色皿皿故故LS=LR，所所以以比比色色分分析析中中测测定定标标准准液液与与未未知知液液吸吸光光度度的的比比值值也也就就等等于于其其浓度的比值，即浓度的比值，即若标准液与样品用量不等时，则再乘若标准液与样品用量不等时，则再乘。用用对对比比法法进进行行定定量量时时，为为了了减减少少误误差差，选选用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度。用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度。（二）标准曲线法（二）标准曲线法配配制制一一系系列列浓浓度度不不同同的的标

10、标准准液液，按按一一定定操操作作方方法法显显色色后后，用用选选定定的的波波长长分分别别测测定定它它们们的的吸吸光光度度，然然后后以以吸吸光光度度为为纵纵坐坐标标，标标准准液液浓浓度度为为横横坐坐标标，在在坐坐标标纸纸上上标标出出各各坐坐标标点点，通通过过连连接接各各点点，使使其其成成一一直直线线，即即A-C曲线。曲线。A0.60.50.40.30.20.124681012C注意事项注意事项1.测定条件发生变化时（如更换标准品测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。和试剂等），应重新绘制。2.标准品应有高的纯度，标准液的配制标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。应准确。3.当待

11、测液吸光度超过线性范围时，应当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。将标本稀释后再测定。4.标本测定的条件应和标准曲线制作时标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。的条件完全一致。用用波波长长200400nm的的紫紫外外光光谱谱测测定定无无色色物物质质的的方方法法称称为为紫紫外外分分光光光光度度法法。芳芳香香族族类类及及含含有有共共轭轭双双键键的的烯烯烃烃、炔炔烃烃等等不不饱饱和和烃烃类类，在在200400nm波波长长范范围围具具备备光光吸吸收收特特性性，故故不不需需经经显显色色反反应应就就能能直直接接利利用用紫紫外外分分光光光光度度法法测测定定，其其选选择择性性和和灵灵敏

12、敏度度均均高高于于比比色色分分析法。析法。五、紫外分光光度法五、紫外分光光度法（一）单组分测定原理（一）单组分测定原理其其基基本本原原理理与与可可见见分分光光光光度度法法相相同同，除除可可采用前述的标准曲线法和对比法外，还可采用：采用前述的标准曲线法和对比法外，还可采用：1.吸吸光光系系数数法法对对于于单单一一组组分分的的纯纯物物质质，只只要要已已知知其其摩摩尔尔吸吸光光系系数数，测测得得吸吸光光度度（A）后，可直接按下列公式计算物质的浓度。后，可直接按下列公式计算物质的浓度。例例：已已知知维维生生素素B12的的水水溶溶液液在在361nm波波长长处处的的为为28056，2ml维维生生素素B12

13、的的水水溶溶液液用用蒸蒸馏馏水水稀稀释释到到4ml，用用1cm比比色色杯杯测测得得溶溶液液的的吸吸光度为光度为0.414，求该维生素，求该维生素B12水溶液的浓度。水溶液的浓度。（二）多组分混合物的测定原理（二）多组分混合物的测定原理多组分指同一试样中含两种或两种以多组分指同一试样中含两种或两种以上待测组分，测定时可根据各组分吸收光上待测组分，测定时可根据各组分吸收光谱的重叠程度来确定定量方法。谱的重叠程度来确定定量方法。1.各组分吸收峰不相互重叠各组分吸收峰不相互重叠按单组分测定方法按单组分测定方法2.各组分吸收峰相互重叠各组分吸收峰相互重叠可采用解联立方程法，等收吸双波长可采用解联立方程法

14、，等收吸双波长法、系数光谱法。法、系数光谱法。（一）火焰光度法（一）火焰光度法是利用火焰使金属元素激发，能发射出是利用火焰使金属元素激发，能发射出特征谱线的特点进行测定的一种方法。特征谱线的特点进行测定的一种方法。1.基本原理基本原理某些金属元素的基态原子某些金属元素的基态原子受到火焰激发后，其外层电子获得能量而从受到火焰激发后，其外层电子获得能量而从基点跃迁到激发态，接着它们又以发射光谱基点跃迁到激发态，接着它们又以发射光谱的形式释放出所获得的能量，而返回基态，的形式释放出所获得的能量，而返回基态，在相同条件下，同一元素所释放的单位能量在相同条件下，同一元素所释放的单位能量相同，故能形成固定

15、光谱。相同，故能形成固定光谱。六、其它光谱分析技术六、其它光谱分析技术如如钠钠发发射射光光谱谱波波长长589nm，钾钾发发射射光光谱谱波波长长767nm。由由于于火火焰焰供供给给的的能能量量不不强强，只只能能激激发发碱碱金金属属和和碱碱土土金金属属元元素素，生生化化检检验验中中常常用用于于钾钾、钠的测定。钠的测定。元元素素的的发发射射谱谱线线强强度度与与该该元元素素浓浓度度的的关关系可表示为系可表示为I=acba是是与与试试样样组组成成，激激发发温温度度，激激发发电电位位有有关关的的常常数数，b为为自自吸吸收收系系数数，当当浓浓度度很很低低时时，b1，所所以以上上式式可可写写成成I=ac，即即

16、发发射射谱谱线线强强度度与测定元素浓度成正比。与测定元素浓度成正比。2.干扰因素干扰因素（1）共存元素的干扰）共存元素的干扰共存元素产生的辐射干扰共存元素产生的辐射干扰由于火焰由于火焰使标本中其他元素激发，当发射时光谱接近，使标本中其他元素激发，当发射时光谱接近，甚至重叠时，可产生干扰，引起误差，如钙甚至重叠时，可产生干扰，引起误差，如钙对锂、钠的测定干扰明显。对锂、钠的测定干扰明显。阳离子的干扰阳离子的干扰主要是通过对待测阳主要是通过对待测阳离子的电离度产生影响，造成发射时强度的离子的电离度产生影响，造成发射时强度的改变。改变。阴离子的干扰阴离子的干扰因阴离子可与某些因阴离子可与某些被测阳离

17、子在火焰温度下形成仅能缓慢蒸被测阳离子在火焰温度下形成仅能缓慢蒸发的化合物而抑制了原子激发，一般用释发的化合物而抑制了原子激发，一般用释放剂来消除干扰，与干扰阴离子牢固结合。放剂来消除干扰，与干扰阴离子牢固结合。（2）火焰对测定的影响）火焰对测定的影响火焰是激发光源，火焰的纯度和燃烧火焰是激发光源，火焰的纯度和燃烧状态，稳定性，可直接影响分析结果的准状态，稳定性，可直接影响分析结果的准确度，因此，要求所用燃料燃烧时火焰背确度，因此，要求所用燃料燃烧时火焰背景色浅，温度高，无杂色。景色浅，温度高，无杂色。（3 3）标准品的影响标准品的影响由于生物样品中成分复杂，定量测由于生物样品中成分复杂，定量

18、测定中会互相干扰影响测定的准确性，所定中会互相干扰影响测定的准确性，所以，如果以单纯的被测物质预制标准液以，如果以单纯的被测物质预制标准液则与血清样品的结果相差甚远，故应使则与血清样品的结果相差甚远，故应使用血清作为标准以消除影响。用血清作为标准以消除影响。（二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法1.基本原理基本原理待测元素经原子蒸气发生待测元素经原子蒸气发生器转化成气态原子（处于基态），由空心阴极器转化成气态原子（处于基态），由空心阴极灯提供的待测元素的共振线经过待测元素的蒸灯提供的待测元素的共振线经过待测元素的蒸气，共振辐射强度被蒸气中待测元素的基态原气，共振辐射强度被蒸气中待测元

19、素的基态原子吸收而减弱，其吸收规律遵循子吸收而减弱，其吸收规律遵循Beer定律。定律。共振线：共振线：电子从基态跃迁至第一电子激发电子从基态跃迁至第一电子激发态的最低振动能级所吸收的谱线为共振吸收线态的最低振动能级所吸收的谱线为共振吸收线。简称为共振线。简称为共振线。2.应应用用在在医医学学检检验验中中主主要要用用于于体体液液、毛毛发发、指指甲甲等等组组织织钙钙、镁镁、铁铁、钠钠、锌锌、铝铝、汞、铅、砷等多种元素的测定。汞、铅、砷等多种元素的测定。优点：优点：选选择择性性好好受受干干扰扰少少，原原子子吸吸收收是是光光的的窄窄带带吸吸收收，仅仅0.0010.01nm，而而分分子子对对光光的的吸吸

20、收是宽带吸收，达几个收是宽带吸收，达几个nm。灵敏度高灵敏度高能测定能测定109106g的元素。的元素。测定快速、简便测定快速、简便应应用用范范围围广广只只需需更更换换不不同同空空心心阴阴极极灯灯，仪器昂贵。仪器昂贵。（三）荧光分析法（三）荧光分析法利利用用某某些些物物质质光光致致发发光光的的特特性性，籍籍此此对对物物质进行定性，定量分析的方法。质进行定性，定量分析的方法。1.基基本本原原理理某某些些物物质质的的分分子子吸吸收收了了光光能能，从从基基态态跃跃迁迁至至某某一一电电子子激激发发态态中中的的某某一一振振动动能能级级，处处于于激激发发态态的的振振动动能能级级中中的的分分子子通通过过运运

21、动动或或与与其其他他分分子子的的碰碰撞撞而而将将吸吸收收过过多多的的能能量量输输给给其其他他分分子子，并并返返回回到到第第一一激激发发态态的的最最低低振振动动能能级级，同同时时发发射射荧荧光光，跃跃迁迁到到基基态态发发射射荧荧光光，在在一一定定浓浓度度范范围围内内，其其荧荧光光强强度度与与溶溶液液浓浓度度呈呈线性关系。线性关系。2.影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素（1）溶剂）溶剂增大溶剂的极性，可时电子增大溶剂的极性，可时电子跃迁的能量降低，荧光增强。跃迁的能量降低，荧光增强。（2）温度、）温度、pHT分子碰撞频率分子碰撞频率，因此荧光强度随温度升高而减弱。因此荧光强度随温度升高而减弱。p

22、H可影可影响化合物电离或使荧光物质水解，如苯胺响化合物电离或使荧光物质水解，如苯胺在在pH712溶液中主要以分子形式存在，产溶液中主要以分子形式存在，产生蓝色荧光，而在生蓝色荧光，而在pH13的溶液中以的溶液中以离子形式存在，不能产生荧光。离子形式存在，不能产生荧光。（3）激发光和发射光）激发光和发射光在定量测定时，在定量测定时，一般应选择荧光物质的一般应选择荧光物质的最大激发波长最大激发波长（ex）和和最大荧光波长最大荧光波长（em），但有些荧，但有些荧光物质化学性质不稳定，受激发光照射后易光物质化学性质不稳定，受激发光照射后易分解，缩短样品照射时间，改变激发光波长。分解，缩短样品照射时间，

23、改变激发光波长。（4）物质浓度的影响）物质浓度的影响荧光分析品适合荧光分析品适合稀溶液，因稀溶液，因荧光物质浓度高，分子间碰撞增荧光物质浓度高，分子间碰撞增加，使荧光强度减弱，这种现象称为自熄灭加，使荧光强度减弱，这种现象称为自熄灭，自熄灭现象随浓度增加而增强。自熄灭现象随浓度增加而增强。3.仪器与测定方法仪器与测定方法作为荧光分析的作为荧光分析的仪器有光电荧光计和荧光分光光度计仪器有光电荧光计和荧光分光光度计光电荧光计的结构与光电比色计很相光电荧光计的结构与光电比色计很相似，不同之处是检测器与光线成直角，并似，不同之处是检测器与光线成直角，并多一块滤光片。多一块滤光片。如滤光片改为棱镜或光珊

24、作单色器，如滤光片改为棱镜或光珊作单色器，就和可见紫外发光光度计相似而成荧光分就和可见紫外发光光度计相似而成荧光分光光度计。光光度计。仪器的组成部件的比仪器的组成部件的比 光源光源单色器单色器测定池测定池光敏元件光敏元件检测器检测器光电比色计光电比色计钨灯钨灯滤光片滤光片玻璃玻璃光电池光电池检流计检流计(二面透光二面透光)光电管光电管光电荧光计光电荧光计卤钨灯卤钨灯滤光片滤光片玻璃玻璃光电管光电管检流计检流计(300700nm)两块两块(四面透光四面透光)检流计检流计可见紫外可见紫外钨灯钨灯光栅或棱镜光栅或棱镜分光光度计分光光度计(400760nm)玻璃玻璃光电管光电管检流计检流计氢灯氢灯石英

25、石英光电倍增管光电倍增管自动记录自动记录(200400nm)荧光分光荧光分光氙弧灯氙弧灯光栅或棱镜光栅或棱镜玻璃玻璃光电倍增管光电倍增管自动记录自动记录光度计光度计(200700nm)石英石英氙弧灯发射的强烈紫外线对人眼有害。氙弧灯发射的强烈紫外线对人眼有害。荧光分析优点：荧光分析优点：灵敏度高灵敏度高比可见紫外吸收光谱高比可见紫外吸收光谱高103104倍。倍。特异性强特异性强通过选择合适的激发光通过选择合适的激发光波长和荧光波长可避开其它物质干扰。波长和荧光波长可避开其它物质干扰。操作简便、快速、重现性好操作简便、快速、重现性好样品用量少样品用量少不足之处：不足之处：应用范围有一定局限性应用

26、范围有一定局限性，因许多物，因许多物质不能产生荧光。质不能产生荧光。对测定条件要求严格对测定条件要求严格，如试剂、溶，如试剂、溶剂不应含有荧光物质。剂不应含有荧光物质。仪器价格较贵仪器价格较贵荧光分析法在医学检验中可用于测定荧光分析法在医学检验中可用于测定类固醇激素（肾上腺皮质激素）及代谢产类固醇激素（肾上腺皮质激素）及代谢产物，单胺类神经递质（儿茶酚胺，物，单胺类神经递质（儿茶酚胺，5-HT）某些维生素（某些维生素（VitA，B族）。族）。电化学分析是一种以溶液电化学性质为电化学分析是一种以溶液电化学性质为基础测定物质含量的分析方法。基础测定物质含量的分析方法。按测定量的按测定量的电化学参数

27、的不同，可分为电化学参数的不同，可分为电位法电位法、电导法电导法、库仑法、极谱法和库仑法、极谱法和伏安法伏安法等，下面主要介绍等，下面主要介绍电位法中的离子选择电极法。电位法中的离子选择电极法。第二节第二节 电化学分析电化学分析是一种电化学敏感器，它的是一种电化学敏感器，它的电势与溶液电势与溶液中给定离子的浓度的对数成线性关系中给定离子的浓度的对数成线性关系，故可，故可以通过简单的电位测量，直接测以通过简单的电位测量，直接测定溶液中离定溶液中离子活度。子活度。离子浓度与离子活度的关系离子浓度与离子活度的关系a=f.c在稀在稀溶液中（溶液中（104mol/L以下）活度系数接近以下）活度系数接近1

28、。离子选择电极离子选择电极（ionselectiveelectodeISE）ISE分析法的优点：分析法的优点：1.是一种直接的非破坏性分析方法是一种直接的非破坏性分析方法，可，可反复进行，不受样品溶液颜色、浑浊等因素的反复进行，不受样品溶液颜色、浑浊等因素的干扰。干扰。2.分析速度快分析速度快，单次分析通常只，单次分析通常只12min3.测量范围宽测量范围宽，45个数量级个数量级4.操作简便操作简便5.测量特定离子活度测量特定离子活度，对临床医学和基，对临床医学和基础医学更有实用意义础医学更有实用意义ISE大都大都属于膜电极属于膜电极，膜中含有与待测，膜中含有与待测离子相同的离子。膜的内表面与

29、具有相同离离子相同的离子。膜的内表面与具有相同离子的固定浓度溶液接触，其中插入一内参比子的固定浓度溶液接触，其中插入一内参比电极，当膜的外表面与待测离子溶液接触时，电极，当膜的外表面与待测离子溶液接触时，引起膜电位的改变。由于电极膜材料、制备引起膜电位的改变。由于电极膜材料、制备方法不同，使电板的稳定性、选择性和灵敏方法不同，使电板的稳定性、选择性和灵敏度也不同。度也不同。一、一、ISE分析法的基本原理分析法的基本原理一、一、ISE分析法的基本原理分析法的基本原理 膜电位的产生：膜电位的产生：将电极插入待测离子溶将电极插入待测离子溶液中时，由于离子的交换和扩散作用，改变液中时，由于离子的交换和

30、扩散作用，改变了两相中原有的电荷分布，因而存在一定的了两相中原有的电荷分布，因而存在一定的电位差，因为内充溶液中有关离子的浓度恒电位差，因为内充溶液中有关离子的浓度恒定，内参比电极的电位固定，所以定，内参比电极的电位固定，所以ISE的电的电位（位（E）只随离子活度不同而改变，其电位）只随离子活度不同而改变，其电位可用可用Nernst方程式表示。方程式表示。ISE的的E值不能直接测定，必须将值不能直接测定，必须将ISE与参比电极浸入被测溶液中组成原电池，然与参比电极浸入被测溶液中组成原电池，然后通过电动势来测定后通过电动势来测定E值。值。参比电极：参比电极：是指在温度、压力恒定的条是指在温度、压

31、力恒定的条件下，当被测溶液离子浓度有所改变时，电件下，当被测溶液离子浓度有所改变时，电极电位保持不变的电极。极电位保持不变的电极。离子选择电极离子选择电极晶体膜电极晶体膜电极均相膜电极均相膜电极非均相膜电极非均相膜电极刚性基质电极刚性基质电极流动载体电极流动载体电极非晶体膜电极非晶体膜电极基本电极基本电极气敏电极气敏电极敏化电极敏化电极酶电极酶电极二、离子选择电极的分类二、离子选择电极的分类（一）晶体膜电极（一）晶体膜电极其敏感膜为金属微溶盐，经加压成片，其敏感膜为金属微溶盐，经加压成片，制成单晶、多晶或混晶体电极敏感膜，如氟制成单晶、多晶或混晶体电极敏感膜，如氟电极，其敏感膜为电极，其敏感膜

32、为LaF3单晶片。单晶片。（二）非晶体膜电极（二）非晶体膜电极1.刚性基质电极刚性基质电极其其敏感膜为玻璃敏感膜为玻璃，故，故称为玻璃电极。成分一般为称为玻璃电极。成分一般为Na2O-AI2O3-SiO2改变这三种成分的配合比例，分别制出对改变这三种成分的配合比例，分别制出对Li+、Na+、K+、Ag+的离子选择电极。的离子选择电极。2.流流动动载载体体电电极极其其敏敏感感膜膜是是由由溶溶解解在在与与水水不不相相混混溶溶的的有有机机溶溶剂剂中中的的离离子子缔缔合合剂剂或或混混合合剂剂作作为为离离子子交交换换体体，再再将将此此溶溶液液渗渗透透在在具具有有惰惰性，微孔性和疏水性的塑料薄膜内。性，微

33、孔性和疏水性的塑料薄膜内。（三）气敏电极（三）气敏电极是是基基于于界界面面化化学学反反应应对对气气体体敏敏感感的的电电极极，它它是是在在一一般般的的离离子子选选择择电电极极的的基基础础上上，再再覆覆盖盖一一层层疏疏水水的的透透气气膜膜（如如聚聚四四氟氟乙乙烯烯），如如CO2、NH3电极。电极。（四）酶电极（四）酶电极它由离子敏感膜和覆盖在表面含有酶的它由离子敏感膜和覆盖在表面含有酶的酶涂层胶组成，敏感膜对待测物的酶促反应酶涂层胶组成，敏感膜对待测物的酶促反应有选择性响应，如尿素酶电极。有选择性响应，如尿素酶电极。1.响响应应范范围围及及检检测测下下限限：响响应应范范围围是是指指电电极极对对待待

34、测测离离子子的的响响应应符符合合Nernst式式的的线线性性区区，此此范范围围越越宽宽越越好好，一一般般在在47个个数数量量级级之之间间，检检测测F限限是是指指能能够够检检测测被被检检离离子子的的最低浓度一般在最低浓度一般在10-510-7mol/L。2.选选择择性性是是指指电电极极对对待待测测离离子子和和共共存存干干扰扰离离子子的的响响应应程程度度的的差差异异。常常用用选选择择性性系系数数或或选选择择比比系系描描述述，选选择择性性系系数数越越小小，表表示示电极选择性越强。电极选择性越强。三、离子选择电极的性能三、离子选择电极的性能3.响响应应斜斜率率和和转转换换系系数数ISE在在Nevnet

35、响响应应范范围围内内被被测测离离子子活活度度变变化化10倍倍所所引引起起的的电电报报电位变化的数值，即响应斜率（电位变化的数值，即响应斜率（S）。）。从理论上说，从理论上说，但但对对某某一一ISE来来说说，实实际际S值值与与理理论论S值值并并不不完完全全相相符符，其其偏偏差差用用转转换换系系数数表表示示，一一般般转转换换系系数达到理论值数达到理论值90以上的电极性能较好。以上的电极性能较好。4.电电极极寿寿命命取取决决于于电电极极制制作作材材料料，结结构构和使用保管情况。和使用保管情况。1.标准曲线法标准曲线法配制一系列不同浓度配制一系列不同浓度标准溶液，测定其电位值标准溶液，测定其电位值Es

36、，绘制，绘制Es-lgc标准曲线，在相同条件下测定样品溶液电标准曲线，在相同条件下测定样品溶液电位值位值Ex。2.电极校正法电极校正法用标准溶液校正用标准溶液校正ISE，制成直读式电仪表。，制成直读式电仪表。四、四、IES的分析定量方法的分析定量方法1.电动势测量电动势测量，对于，对于一价离子一价离子的响应，的响应，电势测量每差电势测量每差1mV引起浓度的相对误差为引起浓度的相对误差为4，对于，对于二价离子二价离子则为则为8，因此对于测量，因此对于测量电势的仪器精度要求达到电势的仪器精度要求达到0.1mV。2.温度温度Nernst公试中的斜率，内参比公试中的斜率，内参比电极的电信号，以及离子活

37、度等都与温度有电极的电信号，以及离子活度等都与温度有关，因此在整个测量过程中应保持温度恒定。关，因此在整个测量过程中应保持温度恒定。五、五、ISE分析方法的误差分析方法的误差3.pH溶液溶液pH值可影响被测离子在溶值可影响被测离子在溶液中的存在形式，从而影响相应离子的活度，液中的存在形式，从而影响相应离子的活度，如如LaF3电极测定电极测定F时，如时，如pH5，F则会则会生成生成HF，使结果偏低。，使结果偏低。4.滞后效应滞后效应使用使用ISE若先测浓溶液后，若先测浓溶液后，再测稀溶液时电位平衡缓慢并出现误差，这再测稀溶液时电位平衡缓慢并出现误差，这一现象称为一现象称为“滞后效应滞后效应”。一

38、、电泳的基本原理一、电泳的基本原理（一）（一）电泳的概念电泳的概念溶溶液液中中带带电电颗颗粒粒在在直直流流电电场场中中向向电电荷荷相相反反方方向向移移动动的的现现象象称称为为电电泳泳。利利用用电电泳泳现现象象对对物物质进行分离的技术叫电泳技术。质进行分离的技术叫电泳技术。第三节第三节电泳技术电泳技术电电泳泳技技术术的的应应用用始始于于1937年年，瑞瑞典典Tiselius利用界面电泳将血清蛋白质分离成五种成分。利用界面电泳将血清蛋白质分离成五种成分。1948年年Wieland发发明明纸纸电电泳泳，使使电电泳泳技技术术大大为为简简化化。此此后后，电电泳泳技技术术发发展展迅迅速速，特特别别是是电电

39、泳泳技技术术与与层层析析法法，免免疫疫学学方方法法的的结结合合，使使其其分分辨辨率率达达到到mg/ml水水平平，成成为为医医学学检检验验的的一一种种重重要分析技术。要分析技术。（二）（二）溶液中粒子的带电状态溶液中粒子的带电状态蛋蛋白白质质分分子子电电离离时时有有带带正正电电荷荷的的氨氨基基，也也有有电电离离带带负负电电荷荷的的羧羧基基，故故蛋蛋白白质质是是一一种种两两性性电解质。电解质。在在酸酸性性条条件件下下，羧羧基基电电离离受受抑抑制制，NH2-NH3+带带正电正电在在碱碱性性条条件件下下，羧羧基基电电离离增增强强，COOHCOO带带负电负电。（三）（三）电泳迁移率电泳迁移率指指带带电电

40、粒粒子子在在单单位位电电场场强强度度作作用用下下的的电泳速度电泳速度，通常用，通常用表示表示=V/EV为为粒粒子子移移动动速速度度（cm/s）E为为电电场场强强度（度（V/cm）迁迁移移率率取取决决于于带带电电粒粒子子的的性性质质（粒粒子子所所带带电电量量Q，粒粒子子大大小小r形形状状）介介质质粘粘度度，对于球状分子，根据，对于球状分子，根据Stoke定律定律V=QE/6rU=Q/6r在实际测定中，电泳速度在实际测定中，电泳速度V以单位时间以单位时间t（秒）（秒）内移动的距离内移动的距离d（厘米）表示（厘米）表示V=d/t（cm/s）电场强度电场强度E以单位长度以单位长度I（厘米）上所施加（厘

41、米）上所施加的电势差的电势差V（伏特）表示（伏特）表示E=V/I（V/cm）故故u=V/E=（d/t）/（V/I）=dI/Vt（cm2/v.s）通过测量通过测量d,l,v,t便可计算出颗粒的迁移率。便可计算出颗粒的迁移率。由于不同的带电粒子其迁移率的不同，因由于不同的带电粒子其迁移率的不同，因此在同一电场中的移动距离不同，故能将其分此在同一电场中的移动距离不同，故能将其分离，根据公式离，根据公式dA=V.t/lAdB=V.t/lBA、B移动距离差为移动距离差为d=(dAdB)=（dAdB）V.t/l分离距离与电压和电泳时间成正比，与支分离距离与电压和电泳时间成正比，与支持物长度成正比。持物长度

42、成正比。二、二、电泳的分类和电泳仪电泳的分类和电泳仪（一）（一）电泳的分类电泳的分类1.根据被分离样品的多少根据被分离样品的多少分析电泳，制分析电泳，制备电泳。备电泳。2.根据电泳电压的高低根据电泳电压的高低常压电泳，高压常压电泳，高压电泳。电泳。3.根据是否使用支持介质根据是否使用支持介质自由电泳，区自由电泳，区带电泳。带电泳。4.根据电泳系统的组成是否均一根据电泳系统的组成是否均一连续电连续电泳，不连续电泳。泳，不连续电泳。（二）电泳仪（二）电泳仪由直流电源和电泳槽两部分组成。由直流电源和电泳槽两部分组成。1、直直流流电电源源将将交交流流电电源源经经整整流流，滤滤波波后获得。分为后获得。分

43、为（1）恒恒压压电电源源电电泳泳过过程程中中的的电电压压恒恒定定不不变变。但但电电泳泳过过程程中中的的热热效效应应，降降低低外外周周电电路路的的电阻，使电流慢慢增大。电阻，使电流慢慢增大。（2）恒恒流流电电泳泳电电泳泳过过程程中中的的电电流流恒恒定定不不变变。用用这这种种电电流流的的输输出出电电压压可可随随外外周周阻阻力力减减少少而减少，从而保持电流恒定。而减少，从而保持电流恒定。（3）恒恒功功率率电电源源电电泳泳中中输输出出功功率率恒恒定定不不变。主要用于等电聚焦电泳。变。主要用于等电聚焦电泳。2.电泳槽电泳槽盛装缓冲液和进行电泳分析的盛装缓冲液和进行电泳分析的场所，一般用塑料和有机玻璃制成

44、，它包括电场所，一般用塑料和有机玻璃制成，它包括电极，缓冲液槽，电泳支架，透明盖组成。电泳极，缓冲液槽，电泳支架，透明盖组成。电泳槽的外形有水平式，垂直式，圆盘式等多种。槽的外形有水平式，垂直式，圆盘式等多种。电极应具有良好的导电性，抗腐蚀性和抗电极应具有良好的导电性，抗腐蚀性和抗电解作用。以铂金材料最为理想，最好贯穿整电解作用。以铂金材料最为理想，最好贯穿整个缓冲液槽。个缓冲液槽。三、影响电泳的因素三、影响电泳的因素（一一）缓缓冲冲液液维维持持电电泳泳介介质质pH恒恒定定，并并起导电作用。起导电作用。1.组组成成由由弱弱酸酸和和弱弱酸酸盐盐组组成成，常常用用的的有有磷磷酸酸盐盐，硼硼酸酸盐盐

45、，巴巴比比妥妥盐盐和和三三羟羟甲甲基基氨氨基基甲甲烷烷（Tris）等等，其其中中巴巴比比妥妥缓缓冲冲液液用用的的最最多多，由巴比妥钠和巴比妥组成。由巴比妥钠和巴比妥组成。选择缓冲液时应考虑的因素：选择缓冲液时应考虑的因素：（1）化学性能稳定，不易水解。）化学性能稳定，不易水解。（2）缓缓冲冲液液的的pH应应与与弱弱酸酸的的pK值值接接近近，有有较强缓冲能力。较强缓冲能力。（3）缓缓冲冲液液中中正正负负离离子子应应有有相相近近的的迁迁移移率率，避免电晕出现正负离子分布不均。避免电晕出现正负离子分布不均。（4）缓缓冲冲液液的的离离子子应应该该是是一一价价的的，多多价价离离子子有较厚的双电层，移动性

46、差。有较厚的双电层，移动性差。（5）缓缓冲冲液液的的电电导导率率要要低低，避避免免通通电电时时产产生生较多的热。较多的热。2.pH缓缓冲冲液液pH决决定定了了蛋蛋白白质质的的带带电电状状态态，电电泳泳时时应应选选择择一一个个合合适适pH，使使各各种种蛋蛋白白质质在在这这一一pH时时净净电电荷荷差差别别最最大大以以利利于于分分离离。血血清清蛋蛋白白醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜电电晕晕常常用用pH8.6的的巴巴比比妥妥缓缓冲冲液液。各各种种蛋蛋白质均带负电荷，电泳时向正极移动。白质均带负电荷，电泳时向正极移动。缓冲液缓冲液pH的计算的计算pH=pKa+lg(盐盐/酸酸)电泳过程水会发生电离。电泳过程水

47、会发生电离。正极：正极：2OHH2O1/2O22epH负极：负极：2H2eH2pH故故电电泳泳24次次后后应应将将缓缓冲冲液液正正极极交交换换，减减少少这种影响。这种影响。3.离离子子强强度度是是指指溶溶液液中中各各种种离离子子的的摩摩尔尔浓浓度度（Ci）与与其其电电荷荷数数平平方方（Zi2）乘乘积积总总和和的的1/2。即即I=1/2CiZi2I的单位是的单位是mol/L。如如0.1mol/LNaCLI=0.1mol/L0.2mol/LMgCL2I=0.6mol/L对于缓冲液对于缓冲液I计算，由于弱酸的电离度很低，计算，由于弱酸的电离度很低，一般只计算盐的。一般只计算盐的。I愈愈大大，缓缓冲冲

48、能能力力越越大大，pH越越稳稳定定，但但缓缓冲冲液液所所载载分分电电流流增增加加，样样品品所所栽栽的的电电流流减减少少，电泳速度减慢，导电能力增加，产热增加。电泳速度减慢，导电能力增加，产热增加。I过过小小，缓缓冲冲能能力力小小，pH不不稳稳定定，缓缓冲冲液液所所载载分分电电流流减减少少，样样品品所所载载分分电电流流增增加加，缓缓冲冲液液粘粘度度系系数数降降低低，电电泳泳速速度度加加快快。但但样样品品在在支支持物上扩散严重，分辨率降低。持物上扩散严重，分辨率降低。兼兼 顾顾 两两 方方 面面 的的 影影 响响，一一 般般 在在 0.050.1mol/L。（二二）支支持持介介质质对对支支持持介介

49、质质的的基基本本要要求求是是具具有有化化学学惰惰性性，不不与与被被分分离离的的样样品品或或缓缓冲冲液液起起化学反应，并具有一定的坚韧度。化学反应，并具有一定的坚韧度。1.吸吸附附使使被被分分离离样样品品滞滞留留，而而降降低低电电泳泳速度，造成拖尾而使分辨率降低。速度，造成拖尾而使分辨率降低。2.电电渗渗电电泳泳过过程程中中液液体体对对固固体体支支持持物物的的相相对对移移动动称称为为电电渗渗。实实际际上上是是电电泳泳材材料料表表面面的的电荷引起水的定向移动。电荷引起水的定向移动。当当电电渗渗作作用用方方向向与与电电泳泳方方向向一一致致，电电泳泳速速度加快，顺水行舟。度加快，顺水行舟。当当电电渗渗

50、作作用用方方向向与与电电泳泳方方向向相相反反，电电泳泳速速度减慢，逆水行舟。度减慢，逆水行舟。四、常用电泳技术四、常用电泳技术区区带带电电泳泳是是目目前前应应用用最最广广泛泛的的一一种种电电泳泳技技术术，区区带带电电泳泳的的支支持持介介质质常常用用的的有有滤滤纸纸，醋酸纤维薄膜，凝胶等。醋酸纤维薄膜，凝胶等。（一）（一）滤纸电泳（滤纸电泳（PE）是是应应用用最最早早的的支支持持介介质质。优优点点：材材料料价价廉廉易易得得，有有一一定定机机械械强强度度。缺缺点点：电电泳泳时时间间长长，810h，吸吸附附作作用用大大，造造成成拖拖尾尾而而降降低低了分辨率，目前已淘汰。了分辨率，目前已淘汰。（二）（