基因重组与基因工程57425.pptx

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1、第十四章基因重组与基因工程基因重组：genomic recombination重组DNA：recombinant DNA第一节、自然界的基因重组 转化：transformation 整合：integration 转导：transduction 转位：transposition转化 转化：由外来DNA 引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化转化 病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。细胞的转化整合 整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA 注入菌体中。此 DNA 可与细菌染色体重组，

2、成为细菌染色体的一部分。溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步 DNA 利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将细菌涨破。整合 溶原和裂解可以相互转变。转导 溶原菌中 DNA 可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA 在切离时带走一部分。后者称转导。带有宿主DNA 的噬菌体称转导噬菌体。来源于宿主的基因称转导基因。转位 转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。这些游动的基因称为转位子(transposon)。转位第二节、基因工程 基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA 在体外与载体DNA 结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛

3、选出能表达重组DNA 的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或重组DNA 技术。分子水平上操作，细胞水平上表达。赋予重组DNA 以新的生命力。基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。已经证实GnT-与转移有关。转入GnT-基因肝癌细胞株SMMC7721观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为转入反义GnT-基因转移转移基因克隆分切接转筛载体和目的基因 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA 分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。常用的载体有：质粒、噬菌体、M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA 载体

4、与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。质粒 质粒：plasmid 环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。质粒的性质：易于从一个细菌转移入另一个细菌。有两三个抗药性基因。有一个限制性内切酶切口。质粒 pBR322：常用的质粒噬菌体载体 噬菌体、M13 噬菌体 易于感染大肠杆菌 噬菌体DNA 比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。一个切口：插入型载体。二个切口：置换型载体。噬菌体载体目的基因的来源 直接从染色体DNA 中分离：原核生物 人工合成：简单的多肽 从mRNA 合成cDNA：真核生物 基因文库：(gene l

5、ibrary）G 文库：用基因组的全部DNA 制备。c 文库：用细胞的全部mRNA 制备出全套cDNA 后建库。从mRNA 合成cDNA限制性内切酶的应用 限制性内切酶可辨认46 个核苷酸：回文结构 回文结构：palindrome DNA 双链具有方向相反顺序一致的结构。平端：blunt end 在同一水平上切断两条链。(钝型末端)粘性末端：sticky end 碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。限制性内切酶的应用 Alu I.AGCT.AG CT.平端.TCGA.TC GA.BamH I GGATCC.G GATTC 粘性.CCTAGG CCTAAG G 末端 限制性内切酶的应用切载体

6、切目的基因限制性内切酶相同粘性末端两者相连要点：避免切断目的基因载体和目的基因的连接 人工连接器：linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。DNA 连接酶：可用于连接碱基互补的二段核酸链。连接方式：粘端连接方式 尾接法粘端连接尾接法重组体的转化 基因的转移：重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法 物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法 生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体重组体的转化 转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。基因工程的表达体系的发展DNA 重组体的筛选与鉴定 根据重组载体的

7、表型进行筛选：如质粒的抗药性、营养素的依赖型 DNA 限制酶切图谱分析：提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内切酶切割后与原来载体比较。利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主DNA 是否重组体。DNA 重组体的筛选与鉴定 灭活法筛选重组体。提取转化细胞DNA限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳与原来载体及重组体比较DNA 重组体的筛选与鉴定DNA 重组体的筛选与鉴定菌落硝酸纤维素滤膜 探针X 线底片显影平板基因工程策略第三节、基因工程的应用 生命科学研究趋势 基因诊断和基因治疗 基因工程产品的开发和应用生命科学研究趋势 基因的结构与功能研究 基因表达的调控 各种生物大分子之间的识别及结合 了解生命的奥秘基因诊断和基因治疗基因工程产品的开发和应用 基因工程疫苗：安全廉价 乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、基因工程生产激素类：胰岛素、生长激素 细胞因子：生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、干扰素第五节、聚合酶链反应 聚合酶链反应：PCR polymerase chain reaction 耐热细菌：DNA 聚合酶能耐高温，在7080 有很高的催化力。原理：以目的DNA 为模板，快速合成大量的DNA，用于检测、制备、研究。第五节、聚合酶链反应 变性：95、15s 引物粘合：55、30s 引物延伸：72、1.5m演讲完毕，谢谢观看！