免疫组化的原理与操作.pptx

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1、会计学1免疫组化的原理与操作免疫组化的原理与操作概念：概念：概念：概念：免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)(Immunohistochemistry,IHC)是是是是利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织和细胞中某种化学成分的一门技术和细胞中某种化学成分的一门技术和细胞中某种化学成分的一门技术和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫是传统的免疫是传统的免疫是传统的免疫学和组织化学相结合而发

2、展起来的一门新兴学科，学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也叫原位免疫学（也叫原位免疫学（也叫原位免疫学（也叫原位免疫学（In situ immunologyIn situ immunology）。）。）。）。特点或优点：特点或优点：特点或优点：特点或优点：（1 1）特异性强、灵敏度高；）特异性强、灵敏度高；）特异性强、灵敏度高；）特异性强、灵敏度高；（2 2）可定性、定位、定量观察；）可定性、定位、定量观察；）可定性、定位、定量观察；）可定性、定位、定量观察；（3 3）将形态学改变与功能和代谢变化

3、结）将形态学改变与功能和代谢变化结）将形态学改变与功能和代谢变化结）将形态学改变与功能和代谢变化结 合起来；合起来；合起来；合起来；免疫组化概述免疫组化概述第1页/共39页 IHC IHC不仅具有传统形态学（包括不仅具有传统形态学（包括不仅具有传统形态学（包括不仅具有传统形态学（包括LMLM和和和和EMEM水平）水平）水平）水平）能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免是经

4、苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能定位的缺点。定位的缺点。定位的缺点。定位的缺点。IHCIHC则可在原位和固相对染色结果进则可在原位和固相对染色结果进则可在原位和固相对染色结果进则可在原位和固相对染色结果进行观察。目前行观察。目前行观察。目前行观察。目前IHCIHC的定位可精确到亚微结构水平。的定位可精确到亚微结构水平。的定位可精确到亚微结构水平。的定位可精确到亚微结构水

5、平。随着随着随着随着IHCIHC技术的发展和图象分析技术的发展，技术的发展和图象分析技术的发展，技术的发展和图象分析技术的发展，技术的发展和图象分析技术的发展，IHCIHC已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，使使使使IHCIHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于研究，也用于诊断。仅用于研究，也用于诊断。仅用于研究，也用于诊断。仅用于研究，也用于诊断。

6、IHCIHC与核酸分子杂交相与核酸分子杂交相与核酸分子杂交相与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术（结合形成的原位杂交技术（结合形成的原位杂交技术（结合形成的原位杂交技术（in situ hybridizationin situ hybridization，ISHISH）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。第2页/共39页 IHCIHC技术源于免疫荧光术（技术源于免疫荧光术（技术源于免疫荧光术（技术源于免疫荧光术（immunofluorescence,immunofluo

7、rescence,IF IF），从），从），从），从19411941年年年年19501950年年年年CoonsCoons等用了等用了等用了等用了1010年首创了年首创了年首创了年首创了 荧光素标记抗体技术荧光素标记抗体技术荧光素标记抗体技术荧光素标记抗体技术检测肺组织内的肺炎双检测肺组织内的肺炎双检测肺组织内的肺炎双检测肺组织内的肺炎双 球菌球菌球菌球菌，六、七十年代，六、七十年代，六、七十年代，六、七十年代IFIF在科研中占据着主导地位在科研中占据着主导地位在科研中占据着主导地位在科研中占据着主导地位1968 1968 年中根一穗（年中根一穗（年中根一穗（年中根一穗（NakaneNakane

8、）等创建了）等创建了）等创建了）等创建了酶标抗体技酶标抗体技酶标抗体技酶标抗体技 术术术术（immunoperoxidaseimmunoperoxidase，IPOIPO）铁蛋白标记铁蛋白标记铁蛋白标记铁蛋白标记 Ab Ab Ab Ab技术技术技术技术;19741974年年年年Stemberger Stemberger Stemberger Stemberger 改良上述技术，建立改良上述技术，建立改良上述技术，建立改良上述技术，建立辣根过氧辣根过氧辣根过氧辣根过氧 化物酶抗体过氧化物酶化物酶抗体过氧化物酶化物酶抗体过氧化物酶化物酶抗体过氧化物酶（PAPPAPPAPPAP）技术，使免疫）技术，

9、使免疫）技术，使免疫）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用细胞化学得到广泛应用细胞化学得到广泛应用细胞化学得到广泛应用；一、一、IHCIHC的发展简史的发展简史第3页/共39页8080年代年代年代年代HsuHsu等建立了等建立了等建立了等建立了ABCABCABCABC法法法法之后，免疫金之后，免疫金之后，免疫金之后，免疫金银染色银染色银染色银染色 法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。90909090年代年代年代年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细分子杂交技术、原位杂交技

10、术、免疫细分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法迅速发展；胞化学分类方法迅速发展；胞化学分类方法迅速发展；胞化学分类方法迅速发展；2000200020002000年年年年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功化技术成为当今生物医学中形态、功化技术成为当今生物医学中形态、功化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合能代谢综合能代谢综合能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个研究的一项有力工具。其应用范围

11、深达医学各个研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一；术之一；术之一；术之一；国内起步晚，从国内起步晚，从国内起步晚，从国内起步晚，从70s70s开始。开始。开始。开始。第4页/共39页（一）方法学（一）方法学（一）方法学（一）方法学1.1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）

12、亲和反应。新的亲亲和反应。新的亲亲和反应。新的亲亲和反应。新的亲和物质对有：和物质对有：和物质对有：和物质对有：生物素与卵白素生物素与卵白素生物素与卵白素生物素与卵白素（biotin&avidin)biotin&avidin)，葡萄球菌，葡萄球菌，葡萄球菌，葡萄球菌A A蛋白（蛋白（蛋白（蛋白（SPASPA）与）与）与）与IgGIgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲，凝集素与受体，激素与受体。这些亲，凝集素与受体，激素与受体。这些亲，凝集素与受体，激素与受体。这些亲和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、和对亲和力强，且可与多种

13、标记物（荧光素、酶、同位素、和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学（affinity histochemistryaffinity histochemistry），），），），这些方法这些方法这些方法这些方法特异性、敏感性、稳特异性、敏感性、稳特异性、敏感性、稳特异性、敏感性、稳定性高，更方便、适于某些特殊观察（如定性高，更方便、适于某些特殊观察（如定性高，更方便、适于某些特殊观察（如定性高，更方便

14、、适于某些特殊观察（如EMEM）。）。）。）。2.2.从单一显示某种物质（单标记）从单一显示某种物质（单标记）从单一显示某种物质（单标记）从单一显示某种物质（单标记）显示多种物质（双标记）。显示多种物质（双标记）。显示多种物质（双标记）。显示多种物质（双标记）。3.3.从从从从LMEMLMEM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。4.4.从定性从定性从定性从定性定量，图象分析（定量，图象分析（定量，图象分析（定量，图象分析（IAIA）、流式细胞术（）、流式细胞术（）

15、、流式细胞术（）、流式细胞术（FCMFCM）。）。）。）。5.IHC5.IHC与与与与ISHISH相结合，可在不同水平检测相结合，可在不同水平检测相结合，可在不同水平检测相结合，可在不同水平检测DNADNA、mRNAmRNA、proteinprotein。6.6.原位原位原位原位PCR+IHCPCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的可在组织原位通过扩增检测微量目的可在组织原位通过扩增检测微量目的可在组织原位通过扩增检测微量目的DNADNA。7.7.趋于标准化、自动化。趋于标准化、自动化。趋于标准化、自动化。趋于标准化、自动化。二、二、IHCIHC的现状和发展前景的现状和发展前景第5页/共

16、39页（二）技术分类（二）技术分类（二）技术分类（二）技术分类 1.1.根据染色方式分成：根据染色方式分成：根据染色方式分成：根据染色方式分成：贴片染色贴片染色贴片染色贴片染色 漂浮染色漂浮染色漂浮染色漂浮染色 2.2.根据根据根据根据Ag-AbAg-Ab结合方式分成：结合方式分成：结合方式分成：结合方式分成：直接法直接法直接法直接法 间接法间接法间接法间接法 多层法多层法多层法多层法 3.3.按标记物的性质分成：按标记物的性质分成：按标记物的性质分成：按标记物的性质分成：免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫酶技术（酶标抗

17、体法、桥法、免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PADPAD法、法、法、法、ABC ABC法）法）法）法）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色 法、蛋白法、蛋白法、蛋白法、蛋白A A金法）金法）金法）金法）第6页/共39页（三）标记物（三）标记物 1.1.必要性：组织细胞内必要性：组织细胞内必要性：组织细胞内必要性：组织细胞内Ag-AbAg-Ab结合反应一般是不可结合反应一般是不可结合反应一般是不可结合反应一般是不可 见的，若

18、在镜下检测，则必须具有可视性标记物。见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。2.2.常用标记物常用标记物常用标记物常用标记物 荧光素荧光素荧光素荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（：最常用的是异硫一氰酸荧光素（：最常用的是异硫一氰酸荧光素（：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanate，FITCFITC）-荧光显荧光显荧光显荧光显 微镜下呈绿色荧光微镜下呈绿色荧光微镜下呈绿色荧光微镜下呈绿色荧光;四乙基罗达明（四乙

19、基罗达明（四乙基罗达明（四乙基罗达明（rhodamine rhodamine RB200 RB200）-荧光显微镜下发橙红色荧光荧光显微镜下发橙红色荧光荧光显微镜下发橙红色荧光荧光显微镜下发橙红色荧光 酶酶酶酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。生物素生物素生物素生物素：（：（：（：（BiotinBiotin）铁蛋白金铁蛋白金铁蛋白金铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。等：主要应用于免疫电镜。等：主要应用于免疫电镜。等：主要应用于免疫电镜。其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）其他：如同位素（因涉及污染和防护

20、难一般不用）其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）第7页/共39页（四四）IHC的应用的应用1.1.只要是形态科学均可采用只要是形态科学均可采用只要是形态科学均可采用只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、包括病理学、神经科学、包括病理学、神经科学、包括病理学、神经科学、生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫等）、皮肤病学、器官移植等。等）、皮肤病学、器官移植等。等）、皮肤病学、器官移植等。等）、皮肤病

21、学、器官移植等。2.2.可用于多种材料：可用于多种材料：可用于多种材料：可用于多种材料：A.A.各种组织（冰冻组织、各种组织（冰冻组织、各种组织（冰冻组织、各种组织（冰冻组织、formalinformalin固定组织、石蜡包埋组织兼可）；固定组织、石蜡包埋组织兼可）；固定组织、石蜡包埋组织兼可）；固定组织、石蜡包埋组织兼可）；B.B.各种细胞各种细胞各种细胞各种细胞(穿刺、穿刺、穿刺、穿刺、体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。3.3.用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。用于诊断：肿瘤病理学等（大

22、中医院）。用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。4.4.用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研究生常用究生常用究生常用究生常用IHCIHC，或或或或IHC+IHC+分生技术分生技术分生技术分生技术；最近几年，分最近几年，分最近几年，分最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来

23、，用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。进而深入研究其功能。进而深入研究其功能。进而深入研究其功能。第8页/共39页（一）标本的收集与处理（一）标本的收集与处理 IHCIHC染色成功与否及其质量如何，除染色方法本染色成功与否及其质量如何，除染色方法本染色成功与否及其质量如何，除染色方法本染色成功与否及其质量如何，除染色方法本身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、身外，对材料的处理也至关重要

24、，它包括：取材、身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、固定、脱水、包埋、切片等。固定、脱水、包埋、切片等。固定、脱水、包埋、切片等。固定、脱水、包埋、切片等。目的：保存好目的：保存好目的：保存好目的：保存好AgAg的数的数的数的数量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。材料的材料的材料的材料的来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固定的。定的。

25、定的。定的。1 1、组织标本的取材与储存、组织标本的取材与储存、组织标本的取材与储存、组织标本的取材与储存 来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。要求：要快、要小（要求：要快、要小（要求：要快、要小（要求：要快、要小（110.4cm110.4cm），避免挤压。），避免挤压。），避免挤压。），避免挤压。处理：冰冻处理：冰冻处理：冰冻处理：冰冻即用或保存；固定即用或保存；固定即用或保存；固定即用或保存；固定即用或保存。即用或保存。即用或保存。即用或保存。三、样品的准备、

26、处理三、样品的准备、处理第9页/共39页 2、细胞标本的取材与储存、细胞标本的取材与储存来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；对于体外培养细胞：对于体外培养细

27、胞：对于体外培养细胞：对于体外培养细胞：贴壁生长贴壁生长贴壁生长贴壁生长细胞（内皮细胞（内皮细胞（内皮细胞（内皮C C、纤、纤、纤、纤维维维维C C、神经、神经、神经、神经C C等）在培养皿底置载玻片；等）在培养皿底置载玻片；等）在培养皿底置载玻片；等）在培养皿底置载玻片；悬浮生长悬浮生长悬浮生长悬浮生长细胞细胞细胞细胞需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。第10页/共39页 （二）固定（二）固定（二）固定（二）固定（fixationfixation）1 1、固定的

28、含义、固定的含义、固定的含义、固定的含义 固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性）固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性）固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性）固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免AgAg溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结构。溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结构。溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结构。溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结构。根据根据根据根据AgA

29、g对固定剂的耐受性，可将其分为：对固定剂的耐受性，可将其分为：对固定剂的耐受性，可将其分为：对固定剂的耐受性，可将其分为：不稳不稳不稳不稳定定定定AgAg（如细胞表面（如细胞表面（如细胞表面（如细胞表面AgAg，不耐甲醛，宜用丙酮）、，不耐甲醛，宜用丙酮）、，不耐甲醛，宜用丙酮）、，不耐甲醛，宜用丙酮）、半半半半稳定稳定稳定稳定AgAg及稳定及稳定及稳定及稳定AgAg，后二者多为蛋白、肽类、酶类物，后二者多为蛋白、肽类、酶类物，后二者多为蛋白、肽类、酶类物，后二者多为蛋白、肽类、酶类物质。质。质。质。固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联固定有时间

30、性，太短达不到固定目的，太长交联固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联过度，封闭过度，封闭过度，封闭过度，封闭AgAg。第11页/共39页 2、常用固定剂及其用途、常用固定剂及其用途1.10%1.10%的的的的formalinformalin（4%4%的甲醛的甲醛的甲醛的甲醛formaldehydeformaldehyde）：以）：以）：以）：以pH7.4pH7.4的的的的PBSPBS配制，配制，配制，配制，优点优点优点优点：穿透力强、固定快、组织收缩小；：穿透力强、固定快、组织收缩小；：穿透力强、固定快、组织收缩小；：穿透力强、固定快、组织收缩小；适于适于适于适于固定蛋固定蛋固定蛋固定蛋

31、白、肽类、酶、糖。白、肽类、酶、糖。白、肽类、酶、糖。白、肽类、酶、糖。IHCIHC常用常用常用常用4%4%多聚甲醛多聚甲醛多聚甲醛多聚甲醛polyformaldehydepolyformaldehyde灌注固定及后固定，灌注固定及后固定，灌注固定及后固定，灌注固定及后固定，时间时间时间时间46 h46 h。2.2.5%2.2.5%的戊二醛，同上。也可用的戊二醛，同上。也可用的戊二醛，同上。也可用的戊二醛，同上。也可用2%2%戊二醛与戊二醛与戊二醛与戊二醛与2%2%多聚甲醛混合液多聚甲醛混合液多聚甲醛混合液多聚甲醛混合液固定，尤对固定，尤对固定，尤对固定，尤对超微结构超微结构超微结构超微结构保

32、存好。醛类固定剂的缺点是易封闭抗保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭抗保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭抗保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭抗原，必要时需抗原修复。原，必要时需抗原修复。原，必要时需抗原修复。原，必要时需抗原修复。3.70%3.70%的酒精（乙醇），的酒精（乙醇），的酒精（乙醇），的酒精（乙醇），优点优点优点优点：固定蛋白好，：固定蛋白好，：固定蛋白好，：固定蛋白好，缺点缺点缺点缺点：组织收缩：组织收缩：组织收缩：组织收缩严重；严重；严重；严重；时间时间时间时间：2h2h。4.70%4.70%丙酮，丙酮，丙酮，丙酮，优点优点优点优点：渗透快；：渗透快；：渗透快；：渗透快；缺点缺点缺点缺

33、点：对形态保存不好；：对形态保存不好；：对形态保存不好；：对形态保存不好；用于用于用于用于对对对对冰冻切片和细胞涂片的固定；冰冻切片和细胞涂片的固定；冰冻切片和细胞涂片的固定；冰冻切片和细胞涂片的固定；时间时间时间时间：10min10min。5.5.混合固定液：混合固定液：混合固定液：混合固定液：BouinBouin液：液：液：液：40%PF250ml40%PF250ml、冰醋酸、冰醋酸、冰醋酸、冰醋酸50ml50ml、饱和苦、饱和苦、饱和苦、饱和苦味酸味酸味酸味酸250ml250ml；还有；还有；还有；还有PLPPLP固定液，较适合免疫组化。固定液，较适合免疫组化。固定液，较适合免疫组化。固

34、定液，较适合免疫组化。6.6.四氧化锇（四氧化锇（四氧化锇（四氧化锇（OsOOsO4 4 锇酸）：常用锇酸）：常用锇酸）：常用锇酸）：常用PBSPBS配制配制配制配制1%1%锇酸溶液后固定锇酸溶液后固定锇酸溶液后固定锇酸溶液后固定1h1h，用于免疫组化及电镜观察。，用于免疫组化及电镜观察。，用于免疫组化及电镜观察。，用于免疫组化及电镜观察。有强烈刺激，需在通风橱内操有强烈刺激，需在通风橱内操有强烈刺激，需在通风橱内操有强烈刺激，需在通风橱内操作作作作。第12页/共39页（三）（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和组织的脱水、浸蜡、包埋和切片切片 前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片前三步只用于石蜡

35、切片，冰冻切片和振动切片前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片不需此步骤。不需此步骤。不需此步骤。不需此步骤。切片可分为：切片可分为：切片可分为：切片可分为：石蜡切片石蜡切片石蜡切片石蜡切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片57m57m；冰冻切片冰冻切片冰冻切片冰冻切片：浸糖，：浸糖，：浸糖，：浸糖，20%30%20%30%蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖4 4o oC C过夜，减少冰过夜，减少冰过夜，减少冰过夜，减少冰 晶；晶；晶；晶；OCTOCT包埋；液氮速冻，减轻组织破包埋；液

36、氮速冻，减轻组织破包埋；液氮速冻，减轻组织破包埋；液氮速冻，减轻组织破 坏。病理切片要薄，坏。病理切片要薄，坏。病理切片要薄，坏。病理切片要薄，57 m57 m；脑片通常；脑片通常；脑片通常；脑片通常 3050 m3050 m厚。厚。厚。厚。振动切片振动切片振动切片振动切片：不需做任何包埋，固定后的组织可直接：不需做任何包埋，固定后的组织可直接：不需做任何包埋，固定后的组织可直接：不需做任何包埋，固定后的组织可直接 用振动切片机做各种厚度的切片，并在用振动切片机做各种厚度的切片，并在用振动切片机做各种厚度的切片，并在用振动切片机做各种厚度的切片，并在 染色后可进一步制作电镜标本观察。染色后可进

37、一步制作电镜标本观察。染色后可进一步制作电镜标本观察。染色后可进一步制作电镜标本观察。第13页/共39页 （四）防脱片剂（四）防脱片剂 （1）蛋白甘油，蛋清与甘油蛋白甘油，蛋清与甘油1：1搅拌、过滤、防腐；搅拌、过滤、防腐；（2）1%的铬矾明胶涂片；的铬矾明胶涂片；（3）0.1%的多聚赖氨酸涂片，晾干的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。备用。配制时用塑料配制时用塑料 瓶而不能用玻璃瓶瓶而不能用玻璃瓶；（4）购买商品化的进口购买商品化的进口硅化玻片硅化玻片；（5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷）（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮稀释，丙酮稀释，浸片浸片2030秒，晾干备用；秒，晾干备用；贴片时贴片时要一

38、步到位。要一步到位。第14页/共39页（五）抗原修复（五）抗原修复 近年兴起的新技术。目的：近年兴起的新技术。目的：近年兴起的新技术。目的：近年兴起的新技术。目的：暴露被交联封闭的暴露被交联封闭的暴露被交联封闭的暴露被交联封闭的AgAg。主要适用于经长期主要适用于经长期主要适用于经长期主要适用于经长期formalinformalin固定的标本、石蜡包埋固定的标本、石蜡包埋固定的标本、石蜡包埋固定的标本、石蜡包埋标本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：标本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：标本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：标本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：（1 1）微波加热微波加热微波加热

39、微波加热 切片煮沸切片煮沸切片煮沸切片煮沸1020min1020min，室温自然冷却，室温自然冷却，室温自然冷却，室温自然冷却，所用溶液有：所用溶液有：所用溶液有：所用溶液有：饱和饱和饱和饱和NaCLNaCL溶液；溶液；溶液；溶液；10mMpH 6.010mMpH 6.0的的的的枸橼酸钠缓冲液；枸橼酸钠缓冲液；枸橼酸钠缓冲液；枸橼酸钠缓冲液；4M4M的尿素等；的尿素等；的尿素等；的尿素等；pH8.0TBS;pH8.0TBS;（2 2）高压锅处理）高压锅处理）高压锅处理）高压锅处理 将切片放入将切片放入将切片放入将切片放入10mM10mM、pH 6.0pH 6.0的枸橼酸的枸橼酸的枸橼酸的枸橼酸

40、钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气310min310min，自然，自然，自然，自然冷却。冷却。冷却。冷却。（3 3）酶消化处理）酶消化处理）酶消化处理）酶消化处理 ：常用：常用：常用：常用0.1%0.1%的胰蛋白酶（含的胰蛋白酶（含的胰蛋白酶（含的胰蛋白酶（含0.1%CaCL0.1%CaCL2 2，pH 7.8pH 7.8）3737。C 10minC 10min。或。或。或。或0.4%0.4%胃蛋白胃蛋白胃蛋白胃蛋白酶酶酶酶3737。C 30min;C 30min;第15页/共39页 （一）基本染色方法（一）

41、基本染色方法（一）基本染色方法（一）基本染色方法 荧光素标记抗体：荧光素标记抗体：荧光素标记抗体：荧光素标记抗体：FITCFITC、直接法直接法直接法直接法 TRITCTRITC等等等等标记抗体法标记抗体法 酶标记抗体：酶标记抗体：酶标记抗体：酶标记抗体：HRPHRP、APAP等等等等 荧光素标记抗体荧光素标记抗体荧光素标记抗体荧光素标记抗体 间接法间接法间接法间接法 酶标记抗体（三步法）酶标记抗体（三步法）酶标记抗体（三步法）酶标记抗体（三步法）非标记抗体法：非标记抗体法：非标记抗体法：非标记抗体法：酶桥法、酶桥法、酶桥法、酶桥法、PAPPAP法法法法、APAAPAPAAP法法法法;亲和组化

42、法：亲和组化法：亲和组化法：亲和组化法：ABCABC法法法法、LABLAB法、法、法、法、LsABLsAB法、法、法、法、BRABBRAB法法法法;双重标记：双重标记：双重标记：双重标记：阻断法（酸洗阻断法（酸洗阻断法（酸洗阻断法（酸洗抗）、非阻断法（连续染）抗）、非阻断法（连续染）抗）、非阻断法（连续染）抗）、非阻断法（连续染）四、四、免疫组织化学技术免疫组织化学技术第16页/共39页1直接法直接法 荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微

43、镜下观察抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察检测抗原。检测抗原。检测抗原。检测抗原。优点优点：简单，时间短，：简单，时间短，特异性强。特异性强。缺点缺点：灵敏度低，所：灵敏度低，所 需抗体量大需抗体量大 （不经济）。（不经济）。应用应用：基本不用了！：基本不用了！第17页/共39页2间接法间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的抗动物的 IgG抗体）。抗体）。显色后镜检显色后镜检 特点：特点：1 1、敏感性较直接法高、敏感性较直接法高3-43-4倍，但倍，但特异

44、性较低特异性较低；2 2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；3 3、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用PBSPBS代替一抗做空白对照。代替一抗做空白对照。第18页/共39页3非标记非标记Ab桥法：桥法：“桥法桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。其二抗为未标记桥抗体。（1）单桥法）单桥法第19页/共39页(2)双桥法双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，重复一次，可增大染色强度。可增大染色强度。特别提示：注意动物种属关

45、系特别提示：注意动物种属关系 特点：特点：特点：特点：敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非特异性结合的酶不易洗去，背景染色重特异性结合的酶不易洗去，背景染色重特异性结合的酶不易洗去，背景染色重特异性结合的酶不易洗去，背景染色重。第20页/共39页4 4 4 4过氧化物酶过氧化物酶过氧化物酶过氧化物酶抗过氧化物酶法（抗过氧化物酶法（抗过氧化物酶法（抗过氧化物酶法（Peroxidase Peroxidase Peroxidase Peroxidase anti-anti-anti-anti-

46、peroxidase method peroxidase method peroxidase method peroxidase method，简称，简称，简称，简称PAPPAPPAPPAP法）法）法）法）是桥法的改良，用第二抗体作是桥法的改良，用第二抗体作是桥法的改良，用第二抗体作是桥法的改良，用第二抗体作“桥梁桥梁桥梁桥梁”，先与第一抗体结合，先与第一抗体结合，先与第一抗体结合，先与第一抗体结合，再与再与再与再与PAPPAPPAPPAP复合物联结，形成复合物联结，形成复合物联结，形成复合物联结，形成抗原抗原抗原抗原抗体抗体抗体抗体抗抗抗抗IgGIgGIgGIgG抗体抗体抗体抗体PAPPAP

47、PAPPAP复合物复合物复合物复合物，最后用底物显色剂显色。，最后用底物显色剂显色。，最后用底物显色剂显色。，最后用底物显色剂显色。特点：特点：特点：特点：灵敏度高，比间接荧光法敏感灵敏度高，比间接荧光法敏感灵敏度高，比间接荧光法敏感灵敏度高，比间接荧光法敏感20202020倍，比间接酶标记抗体倍，比间接酶标记抗体倍，比间接酶标记抗体倍，比间接酶标记抗体法敏感法敏感法敏感法敏感100100100100倍倍倍倍第21页/共39页 5 5亲和素亲和素亲和素亲和素-生物素生物素生物素生物素-过氧化物酶复合物法（过氧化物酶复合物法（过氧化物酶复合物法（过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-a

48、vidin-biotin-peroxidase complex technique peroxidase complex technique，简称，简称，简称，简称ABCABC法）。法）。法）。法）。关键的程序步骤为关键的程序步骤为关键的程序步骤为关键的程序步骤为3 3步：步：步：步：Ag+Ag+Ab1Ab1+（Ab2-BAb2-B）+ABABC C 复合物复合物复合物复合物 （Ab2-BAb2-B 为生物素标记的第二抗体）为生物素标记的第二抗体）为生物素标记的第二抗体）为生物素标记的第二抗体）（B B 为生物素标记的过氧化物酶）为生物素标记的过氧化物酶）为生物素标记的过氧化物酶）为生物素标记

49、的过氧化物酶）ABABC C复合物是复合物是复合物是复合物是avidinavidin与酶联与酶联与酶联与酶联biotin biotin 在使用前在使用前在使用前在使用前30min30min配置，混匀。配置，混匀。配置，混匀。配置，混匀。1 1个个个个avidinavidin分子结合了分子结合了分子结合了分子结合了3 3个个个个biotinbiotin分子，剩下分子，剩下分子，剩下分子，剩下1 1个结合点与个结合点与个结合点与个结合点与2 2抗的生物素结合，抗的生物素结合，抗的生物素结合，抗的生物素结合，avidinavidin起桥联作用。起桥联作用。起桥联作用。起桥联作用。第22页/共39页（

50、1 1）ABCABC复合物的制备：复合物的制备：复合物的制备：复合物的制备：（2）ABC法反应原理：法反应原理：特点：特点：ABC法敏感性更高，比法敏感性更高，比PAP法法敏感敏感2040倍，背景也更清晰。倍，背景也更清晰。第23页/共39页ABC法示法示意图意图第24页/共39页染色结果观察染色结果观察染色结果观察染色结果观察（BrdUBrdU）第25页/共39页 6、酶标亲和素、酶标亲和素-生物素技术（生物素技术（labelled avidin-biotin technique，简称简称LAB法）。法）。即用辣根过氧化物酶直接标记即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用，用biotin标