微生物检验技术基础知识课件ppt.ppt

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1、火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去微生物检验技术 基础知识 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去目目 录录?一、微生物基本介绍?二、培养基?三、菌种?四、微生物限度检查法 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去一、微生物基本介绍 1、微生物的定义 微生物是一些形体微小，以单细胞或简单多细胞、甚至是没有细胞结构的形式存在的低等生物的统称。2、微生物的分类 微生物的主要分类单位：域、界

2、、门、纲、目、科、属、种、变种、亚种（小种）、型、菌株（品系）“种种”是最本的分类单位，例：大肠埃希菌 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去一、微生物基本介绍 3、微生物的特点、微生物的特点?体形微小；?结构简单；?生长繁殖快；?种类繁多，分布广，适应性强。?包括：细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、立克次氏体、支原体和病毒等。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去一、微生物基本介绍 4、微生物形态结构?4.1细菌?4.2真菌（包括酵母菌和霉菌）火灾袭来时要迅速

3、疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去一、微生物基本介绍 5、微生物与我们、微生物与我们?每张人民币带细菌：900万个；?人体体表及体内存在大量的微生物；?皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米；?口腔“细菌种类超过500种；?肠道：微生物总量达100万亿；火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣

4、服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去二、培养基 配制时注意：配制时注意：?不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基；?常用的溶剂是纯化水、蒸馏水，避免使用自来水，因其中含有氯等抗菌物质；?脱水型培养基应完全溶解于水中，再分装灭菌；?加热助溶，注意不要过度加热；?如需要添加其它组分，加入后应充分混匀；?配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器；?配制培养基一般要在1小时内完成，如果室温高，配制时间过长，易使培养基受污染；火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去二、培养基 2、培养基的灭菌、培养基的灭菌?已配制好的培养基最好尽快灭菌；?

5、一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽菌，通常是12115分钟；?湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复高温灭菌；?高压蒸汽灭菌锅在使用时，内置物品不能太多，不要堆积形成死角。?要定期对压力表等进行检定，检定周期一般为半年；?定期对灭菌效果进行检验，可采用生物指示菌法、化学变色纸片（如湿热灭菌指示条）等进行验证。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去二、培养基 3、培养基的贮藏、培养基的贮藏?贮藏注意：?灭菌后的培养基应迅速取出，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌；?培养基保存前应标上名称和制备日期（或到期日期）；?琼

6、脂培养基不得在0或0以下存放；?琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，不超过一周；火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去二、培养基 4、培养的再融化方式、培养的再融化方式?水浴加热?微波炉 注意：?固体培养基灭菌后的再融化只允许一次?融化的培养基应置于4550的水浴中，不得超过8小时 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去二、培养基 5、培养基的性能评估、培养基的性能评估?所有购回的、配制好的培养基均应进行质量控制试验（培养基适应性检查）?理化指标（P55）

7、?微生物学指标（P55）火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 1、分类（概念）：、分类（概念）：标 准 菌 株 由国内或国际菌种保藏机构保藏的 标准储备菌株 由标准菌株经一次传代得到的培养物 商业派生菌株 由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株 工 作 菌 株 由标准储备菌株以传代得到的培养物 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 注意：注意：?标准储备菌株、工作菌株都应进行纯度和特性确认?工作菌株的传代次数不得超过

8、 5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第 0代）?“1代”是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养。?实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、贮藏、保存、确认试验及销毁的记录。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 标准菌株：?冻干粉（图P63）?甘油冻存管（图P64）火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 菌种保藏机构：?CMCC 中国医学微生物菌种保藏管理中心?GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中

9、心?ATCC 美国典型菌种保藏中心 例：CMCC（B）26003 菌种保藏机构 细菌 菌种编号（金黄葡萄球菌）火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 2、菌种的鉴定 金黄色葡萄菌 CMCC(B)26003?甘露醇平板上划线分纯，典型菌落 为黄色圆形突起，表面湿润光滑；?革兰氏染色：阳性，球菌。?血浆凝固霉酶实验：阳性 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 CMCC(B)10104?溴化十六烷基三甲

10、铵琼脂平板上划线分纯，典型菌落呈扁平，无定形、周边扩散，表面湿 灰白色，周围有蓝绿色素扩散。?氧化酶实验：阳性?绿脓菌素：阳性?革兰氏染色：阴性，杆菌；火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 白色念珠菌白色念珠菌 CMCC(B)98001?沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯，典型菌落乳白色，表面光滑有浓酵母气味。?革兰氏染色：阳性，菌体大，球菌。?芽管试验：阳性 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 3、菌种的保藏、菌种的保藏

11、A：甘油冷冻管保藏法?保藏温度：3080；保藏菌种有效期：12年?优点：保存期较长，反复传代导致菌种变异的风险较小；?缺点：操作相对复杂，成本较高。B：斜面低温保藏法?保藏温度4左右，保藏时间13个月，但铜绿假单胞菌不宜用本法保存。?优点：操作简便，成本低，比较容易掌握；?缺点：保存期比较短，反复传代有引起变异的可能。保藏温度 保藏 有效期 优点 缺点 甘油冷冻管 保藏法保藏法-3080 12年 保存期较长，反复传代导致菌种变异的风险较小 操作相对复杂，成本较高 斜面低温 保藏法 4左右 13个月 操作简便，成本低，比较容易掌握 保存期比较短，反复传代有引 起变异的可能；铜绿假单胞菌不宜用本法

12、保存。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去三、菌种三、菌种 4、菌种的使用和销毁、菌种的使用和销毁?过期菌种应及时销毁，销毁时应经 12130分钟的生物灭活处理。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 1、定义?微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。2、检查项目?定量检查细菌数、霉菌及酵母菌数?定性检查控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌）?检验环境：与无菌检查相同

13、火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 3、检验量?指一次检验用量；10g或10ml，膜剂为100cm2，贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。4、供试液的制备?根据供试品的理化特性与生物特性，采取适宜的方法制备供试液；?供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 制备原则：?简便、快速！?供试液从制备至加入检验用培养基，不得超

14、过 1小时。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 供试品分类?液体供试品?固体、半固体或黏稠性供试品?需用特殊供试液制备方法的供试品?非水溶性供试品?膜剂供试品?肠溶及结肠制剂供试品?气雾剂、喷雾剂供试品?贴膏剂供试品?具抑菌活性的供试品：具抑菌活性的供试品：培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 5、方法验证、方法验证?5.1验

15、证菌株?大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉?5.2计数方法的验证?当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。?若产品的组分或原检验条件发生改变可影响检验结果时，计数方法应重新验证。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 试验组?薄膜过滤法计数时：取规定量的供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。菌液组?测定所加的试

16、验菌数（50100cfu）供试品对照组?取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数 稀释对照组?用相应的稀释液替代供试品，加入50100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 验证方法：验证方法：验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算试验菌每次试验的回收率不低于 70%，若任一次试验中试验组的菌回收低于 70%，应采取适宜的方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行进行方法验证。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥

17、而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 5.3控制菌检查法验证控制菌检查法验证?当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。?采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌（10100cfu）应加在最后一次冲洗液中，依法操作。?若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；?若试验组未检出试验菌，应采用相应方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的

18、衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 5.4细菌、霉菌及酵母菌检查?检查方法：平皿法和薄膜过滤法?按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数检查 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 菌落报告规则：菌落报告规则：细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu；霉菌宜选取平均菌落小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（即两位有效数字）的依据。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍

19、数的值报告菌数。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 菌落报告规则示例 各稀释级（供试液1ml/皿）平均菌落计数（cfu）菌数报告数（cfu/ml.g）原液 1：10（-1）1：102（-2）1：103（-3）1 64 8 2 640 2 420 64 8 6400 3 不可计 420 64 64000 4 0 0.5 0 100 5 0 0 100 6 0 0 0 10 7 0 0 0 1 例：菌数报告规则表1 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿

20、的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 5.4.2薄膜过滤法 滤膜孔径不大于0.45m，直径一般为50mm，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml。?贴膜 菌面朝上于相应的琼脂培养基平板上培养，每种培养基至少制备一张滤膜。?阴性对照试验（不得有菌生长）?菌落报告规则 每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu，若滤膜上无菌生长，以1乘以稀释倍数的值报告菌数。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 5.

21、5控制菌检查 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。?阳性对照试验：加菌量为10100cfu，阳性对照试验应检出相应的控制菌。?阴性对照试验：取稀释液10ml代替供试液，阴性对照应无菌生长。?按照不同的给药途径，必检的控制菌不同。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 不同给药途径制剂应检控制菌汇总 药品给药途径 应检控制菌 说明 局部给药制剂 金黄色葡萄球菌 所有制剂 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 阴道给药 口服制剂 大肠埃希菌 所有品种 大

22、肠菌群 含中药原药粉、沙门菌 含动物组织（提取物）给药 多途径给药制剂 同时检查各给药途径应检的控制菌 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去四、微生物限度检查法四、微生物限度检查法 5.6微生物限度检查法结果判断微生物限度检查法结果判断?供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试；?供试品的细菌数、霉菌及酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数；?若供试品的细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定，反之判供试品不符合规定。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去谢谢大家！