动物细胞制药的培养需求4755.pptx

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1、基因工程动物细胞培养制药工艺基因工程动物细胞培养制药工艺药药用用蛋蛋白白质质的的合合成成复复杂杂，要要有有精精确确折折叠叠的的空空间间结结构构，要要有有糖糖基基化化，才才能能使使药药物物发发挥挥真真正正的的功功能能。细细菌菌和和酵酵母母等等产产品品要要么么是是包包涵涵体体，要要么么难难以以糖糖基基化化功功能能修修饰饰。动动物物细细胞胞的的培培养养技技术术来来生生产产有有功功能能的的蛋蛋白白质质，大大规规模模动动物物细细胞胞特特别别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。人人畜畜病病毒毒疫疫苗苗:口口蹄蹄疫疫苗苗、狂狂犬犬病病疫疫苗苗、牛牛

2、白白血血病病和和脊脊髓髓灰质炎、乙肝疫苗。灰质炎、乙肝疫苗。干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。组组织织型型血血纤纤蛋蛋白白溶溶酶酶原原激激活活剂剂、免免疫疫珠珠蛋蛋白白G、M、尿尿激激酶、人生长因子等。酶、人生长因子等。第一节第一节动物细胞制药的表达系统与特征动物细胞制药的表达系统与特征昆昆虫虫系系统统、哺哺乳乳动动物物细细胞胞系系统统，最最成成功功、重重要要表表达达活活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。一、哺乳动物细胞表达系统与特征一、哺乳动物细胞表达系统与特征1.动物细胞的特征动物细胞的特征

3、细胞膜、细胞质细胞膜、细胞质和细胞核和细胞核没有细胞壁。没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。亚细胞器，功能独特。2.动物细胞代谢动物细胞代谢动动物物细细胞胞的的不不同同代代谢谢途途径径及及其其相相应应的的酶酶体体系系定定位位于于特特定定的的亚亚细细胞胞区区域域。通通过过胞胞内内运运输输（囊囊泡泡包包裹裹）实实现现区区域域之之间间的的物物质质、信信息息和和能能量量流流动动，通通过过穿穿梭梭实实现现不不同同代代谢谢途途径径之之间的交换。间的交换。在在动动物物细细胞胞培培养养中中，葡葡萄萄糖糖和和谷谷氨氨酰酰胺胺提提供供能能量量并并作作为为合合成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。成代谢的前

4、体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。葡葡萄萄糖糖受受限限可可增增加加谷谷氨氨酰酰胺胺的的消消耗耗得得以以补补偿偿，反反之之亦亦然然。谷谷氨氨酰酰胺胺是是动动物物细细胞胞的的氮氮源源，谷谷氨氨酰酰胺胺受受限限时时，可可增增加加其其他氨基酸的消耗得以补偿。他氨基酸的消耗得以补偿。糖代谢特点：糖代谢特点：动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。在培养液中积累。丙酮酸还可转化为乙酰辅酶丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底

5、氧，进入三羧酸循环，彻底氧化产生化产生CO2和水。小部分（和水。小部分（48）葡萄糖进入戊糖）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。氨基酸代谢特点：氨基酸代谢特点：吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需

6、氨基酸。等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物-酮戊二酸，进酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰

7、乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。是主要的代谢途径。不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。来源于谷氨酰胺。在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和和NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨

8、酰氨，但二种的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。废物积累。3.蛋白质糖基化蛋白质糖基化蛋蛋白白质质合合成成是是以以mRNA为为模模板板，在在核核糖糖体体上上完完成成。而而蛋蛋白白质质的的糖糖基基化化无无需需模模板板指指导导，因因此此糖糖蛋蛋白白的的寡寡糖糖结结构构容容易易发发生变化。生变化。糖糖蛋蛋白白的的单单糖糖单单元元:-D-葡葡萄萄糖糖、-D-半半乳乳糖糖、-D-甘甘露露糖糖、-D-木木

9、糖糖、-D-岩岩藻藻糖糖、N-乙乙酰酰-D-葡葡萄萄糖糖胺胺、N-乙酰乙酰-D-半乳糖胺和半乳糖胺和-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。乙酰神经氨酸（或唾液酸）。糖糖基基化化类类型型：寡寡糖糖基基以以共共价价键键与与蛋蛋白白质质的的氮氮原原子子结结合合为为N-糖糖基基化化，或或与与氧氧原原子子结结合合为为O-糖糖基基化化。这这两两种种糖糖基基化化的的位位点和数量及糖的种类都不同。点和数量及糖的种类都不同。N-糖糖基基化化：聚聚糖糖部部分分连连接接在在天天门门冬冬酰酰胺胺的的氨氨基基上上，其其模模体体的的保保守守序序列列为为Asn-X-Thr/Ser(X为为除除脯脯氨氨酸酸以以外外的的任任意意氨氨基

10、基酸酸)。如如果果X为为Trp、Asp、Glu和和Leu，对对糖糖基基化化有有负负影影响，而第三位响，而第三位Thr能增强糖基化。能增强糖基化。N-糖糖基基化化分分为为高高甘甘露露糖糖型型、复复合合型型和和杂杂合合型型三三种种类类型型，共共同同核核心心是是3个个甘甘露露糖糖和和2个个N-乙乙酰酰葡葡萄萄糖糖胺胺组组成成的的5糖糖（Man3GluNAc2），其他糖形成支链。），其他糖形成支链。高甘露糖型的支链为甘露聚糖（高甘露糖型的支链为甘露聚糖（59聚体），无其他糖。聚体），无其他糖。复复合合型型含含有有2个个以以上上支支链链，如如乙乙酰酰半半乳乳糖糖胺胺、果果糖糖和和唾唾液液酸等。酸等。杂合

11、型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。O-聚糖连接在聚糖连接在Thr/Ser的羟基上，还没有发现保守序列。的羟基上，还没有发现保守序列。O-聚聚糖糖有有四四种种不不同同的的核核心心结结构构，都都含含有有N-乙乙酰酰半半乳乳糖糖胺胺基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。O-糖糖基基化化比比较较小小，一一般般为为16个个寡寡聚聚糖糖，但但比比N-糖糖基基化化变化更大。变化更大。O-糖糖基基化化只只在在高高尔尔基基体体上上进进行行，糖糖基基单单元元有有木木糖糖、葡葡萄萄糖。糖。糖糖基基化化磷磷脂脂酰酰肌肌醇醇锚锚着着

12、点点：它它在在膜膜与与蛋蛋白白质质之之间间形形成成稳稳定定的的相相互互作作用用，都都具具有有相相同同的的核核心心结结构构：胆胆胺胺-PO4-Man2-GlcHN2-肌醇肌醇-PO4-脂。脂。胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。在在细细胞胞培培养养生生产产重重组组蛋蛋白白时时，磷磷脂脂酶酶C可可切切割割此此类类蛋蛋白白，有利于纯化。有利于纯化。细细胞胞特特异异性性糖糖基基化化途途径径淋淋巴巴细细胞胞中中进进行行，它它不不依依赖赖于于内质网和高尔基体。内质网和高尔基体。IgG的的糖糖基基化化，等等分分GlcNAc残残基基连连接接在在核核心心甘甘露露糖糖上上，该该

13、糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。IgG蛋蛋白白的的铰铰链链区区，富富含含Ser、Thr和和Pro，5个个Ser全全部部糖糖基化。基化。促黄体激素、促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生。促黄体激素、促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生。尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞系，糖基化特征不同。系，糖基化特征不同。鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠杂交瘤或人鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。杂交瘤或人

14、鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。CHO细胞不能合成等分细胞不能合成等分N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。细胞系细胞系FucGal唾液酸唾液酸1,61,3Fuc1,3GalSO4-GalNAc2,32,6糖糖 基基化化等等分分GluNAcBHK+0+0+0-0CHO+-00+0+0鼠杂交瘤鼠杂交瘤+0+0+0+0C127+0+0J558L+0+-+0人淋巴细胞人淋巴细胞+000+0+人垂体人垂体+00+0+Namalwa+00

15、0+-人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤+000+02.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统基基因因工工程程哺哺乳乳动动物物细细胞胞系系：失失去去分分化化能能力力的的无无限限生生长长细细胞胞系系，即即永永久久性性细细胞胞。表表达达的的蛋蛋白白质质能能正正确确加加工工、修修饰饰并并折折叠形成具有生物活性的功能分子，接近或类似天然产物。叠形成具有生物活性的功能分子，接近或类似天然产物。糖糖基基化化等等修修饰饰是是糖糖蛋蛋白白行行使使功功能能所所必必需需的的，而而且且对对产产品品质质量量有有影影响响，如如生生物物活活性性、稳稳定定性性、免免疫疫原原性性等等。原原核核细细胞胞表表达达的的EPO无无糖糖基基化化，

16、在在体体内内表表现现无无活活性性。原原核核表表达达的的GMCSF虽有活性，但在体内产生抗体。虽有活性，但在体内产生抗体。动动物物细细胞胞表表达达产产物物分分泌泌到到培培养养液液，容容易易分分离离纯纯化化。约约有有70批批准准的的蛋蛋白白质质药药物物由由哺哺乳乳动动物物细细胞胞系系统统表表达达制制造造，而而且且数目还在不断增加。数目还在不断增加。表达系统表达系统O-糖基化糖基化寡聚甘露糖寡聚甘露糖高甘露糖高甘露糖复合体复合体大肠杆菌大肠杆菌0000酿酒酵母酿酒酵母0 昆虫昆虫Sf90仓鼠仓鼠CHO0仓鼠仓鼠BHK0鼠杂交瘤鼠杂交瘤0鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤0C1270J558L0人淋巴细胞人淋巴细胞00

17、Namalwa0人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤0大肠杆菌大肠杆菌酵母酵母哺乳动物细胞哺乳动物细胞产物浓度产物浓度高高高高低低分子量分子量低低高高高高二硫键二硫键有限有限不受限制不受限制不受限制不受限制分泌分泌无无有或无有或无有有形式形式包涵体包涵体单链，天然单链，天然单链，天然单链，天然折叠折叠不正确不正确正确正确正确正确糖基化糖基化无无可能可能完全完全逆转录病毒逆转录病毒无无无无可能可能热原热原可能可能无无无无培养特点培养特点容易容易容易容易较难，成本高较难，成本高分离纯化分离纯化复杂复杂复杂复杂简单简单细胞类型细胞类型表表 达达 水水 平平（g/ml）猴猴CV1110猴猴CV10.05猴猴COS1小

18、鼠成纤维细胞小鼠成纤维细胞C12715小鼠成纤维细胞小鼠成纤维细胞3T30.10.5CHO（dhfr）0.010.05CHO（dhfr）10动动物物细细胞胞表表达达系系统统的的不不足足是是细细胞胞生生长长缓缓慢慢，生生产产效效率率较较低低，产量远远落后于其他表达系统。产量远远落后于其他表达系统。骨骨髓髓细细胞胞MPG11生生产产IgG的的能能力力为为5pg/(细细胞胞.分分钟钟)，10L反应器，密度为反应器，密度为107/ml，生产能力不到，生产能力不到1g/d。连连续续细细胞胞系系增增加加了了生生长长和和代代谢谢速速率率，但但同同时时导导致致了了副副产产物物的增加。的增加。动动物物细细胞胞对

19、对培培养养条条件件要要求求苛苛刻刻和和敏敏感感，对对温温度度、pH、渗渗透透压压、剪剪切切力力等等忍忍受受能能力力差差。培培养养基基要要求求高高，需需要要添添加加氨氨基基酸酸、维维生生素素等等，往往往往需需要要附附加加血血清清，提提供供生生长长因因子子，费费用较高。同时可能有潜在的致病因子、免疫原性存在。用较高。同时可能有潜在的致病因子、免疫原性存在。表表达达载载体体的的改改进进和和宿宿主主细细胞胞的的改改造造是是动动物物细细胞胞表表达达系系统统的的研发重要内容。研发重要内容。3.昆虫细胞表达系统与特征昆虫细胞表达系统与特征表表达达载载体体为为昆昆虫虫病病毒毒，转转染染昆昆虫虫细细胞胞，表表达

20、达出出目目标标蛋蛋白白质质。昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒。昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒。苜苜蓿蓿尺尺蠖蠖核核多多角角体体病病毒毒秋秋黏黏虫虫细细胞胞表表达达系系统统，家家蚕蚕核核多多角体病毒家蚕幼虫表达系统。角体病毒家蚕幼虫表达系统。MicroGeneSys公公司司表表达达艾艾滋滋病病基基因因工工程程疫疫苗苗，随随后后猪猪生生长长素素、CD4膜膜蛋蛋白白及及疟疟疾疾疫疫苗苗、鸡鸡新新城城病病毒毒疫疫苗苗、血血吸吸虫虫GST疫疫苗苗、乙乙肝肝表表面面抗抗原原、重重组组人人GMCSF等等。日日本本批批准准用用家家蚕蚕系系统统生生产产干干扰扰素素已已上上市市。生生物物试试剂剂盒盒的的

21、标标准准品品大多用昆虫表达系统生产。大多用昆虫表达系统生产。至至少少有有600多多种种昆昆虫虫可可以以作作为为宿宿主主，每每年年有有数数百百个个基基因因利利用昆虫系统进行表达，越来越成为非常有用的表达宿主。用昆虫系统进行表达，越来越成为非常有用的表达宿主。优点优点1）安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受）安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受FDA认可。认可。2）易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快，）易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快，3）高高量量表表达达：用用强强启启动动子子，外外源源基基因因可可超超量量表表达达。表表达达产物在昆虫细胞内能结晶，对产物纯化非常有意义。产物在

22、昆虫细胞内能结晶，对产物纯化非常有意义。4）高高效效表表达达：可可容容纳纳较较大大的的外外源源基基因因（12kb），表表达达数数个个外外源源基基因因，并并且且正正确确装装配配成成有有功功能能的的分分子子。如如表表达达抗抗体体的重链和轻链，自主装配成有功能的抗体。的重链和轻链，自主装配成有功能的抗体。5）翻翻译译后后的的加加工工：昆昆虫虫细细胞胞能能进进行行一一系系列列翻翻译译后后的的加加工工，包包括括糖糖基基化化、脂脂肪肪酸酸酰酰基基化化、磷磷酸酸化化、氨氨基基酸酸的的乙乙酰酰化化、氨酰化等，大部分产物显示出良好的活性。氨酰化等，大部分产物显示出良好的活性。缺点：缺点：1）重组率低，筛选困难，

23、周期长，需要）重组率低，筛选困难，周期长，需要410天。天。2）外外源源基基因因的的表表达达在在转转染染的的晚晚期期，大大约约在在20h后后起起始始基基因因表表达达，在在7294h细细胞胞裂裂解解死死亡亡，基基因因表表达达时时间间约约3050h，高水平表达不连续且时间短，这对表达不利。，高水平表达不连续且时间短，这对表达不利。3）昆昆虫虫细细胞胞糖糖基基化化等等加加工工途途径径与与哺哺乳乳动动物物细细胞胞不不完完全全相相同同，它它不不提提供供复复杂杂的的N糖糖基基化化，如如添添加加半半乳乳糖糖和和唾唾液液酸酸残残基基，有有可可能能造造成成溶溶解解性性、稳稳定定性性、免免疫疫性性等等变变化化。表

24、表达达水水平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体；研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体；决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系。决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系。第二节第二节 基因工程动物细胞系的构建基因工程动物细胞系的构建构建高效表达载体构建高效表达载体转染动物细胞转染动物细胞筛选鉴定筛选鉴定获得生产用工程化细胞系获得生产用工程化细胞系动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。病毒载体：病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等

25、载体，对原逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原始病毒改造而来。始病毒改造而来。同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间较长。较长。痘病毒载体可插入痘病毒载体可插入2540kb外源基因，甚至是多个基因。外源基因，甚至是多个基因。无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。美国美国Genentech公司已用公司已用SV40载体生产乙肝疫苗，其他载载体生产乙肝疫苗，其他载体可用于基因治疗。体可用于基因治疗。质粒载体：质粒载体：微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制微生物的质粒

26、载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。子和抗性筛选标记基因。大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。抗生素抗性标记，原核细胞筛选。抗生素抗性标记，原核细胞筛选。动物细胞的复制子，动物细胞的复制子，在宿主细胞中稳定表达。在宿主细胞中稳定表达。还有丝状噬菌体复制子。还有丝状噬菌体复制子。启启动动子子序序列列：含含有有RNA聚聚合合酶酶识识别别和和结结合合位位点点，以以便便有有效效转录。转录。TATA盒，确定起始位置；盒，确定起始位置；GG盒，影响转录频率。盒，影响转录频率。来源于病毒、动物基因和噬菌体的启动子。来源于病毒、动物基因和噬菌体的启动子。动动物物

27、病病毒毒 启启 动动子子：逆逆 转转 录录病病 毒毒 的的 长长末末 端端 重重复复序序 列列（LTRS）、SV40病病毒毒的的早早期期和和晚晚期期启启动动子子、腺腺病病毒毒的的晚晚期启动子、人巨噬病毒（期启动子、人巨噬病毒（CMV）立即早期基因启动子。）立即早期基因启动子。动动物物基基因因的的启启动动子子：转转录录因因子子EF-1启启动动子子、泛泛素素蛋蛋白白启启动动子子、-肌肌动动蛋蛋白白启启动动子子、干干扰扰素素-启启动动子子、IgG启启动动子子、鼠金属硫蛋白基因启动子等。鼠金属硫蛋白基因启动子等。噬菌体噬菌体T7启动子比动物基因启动子表达水平高。启动子比动物基因启动子表达水平高。Pol

28、yA信信号号序序列列：保保持持mRNA的的稳稳定定性性，防防止止降降解解，保保证证了了转转录录产产物物的的加加工工和和正正确确性性，但但序序列列不不宜宜太太长长，避避免免能能量量过过度度消消耗耗。添添加加PolyA信信号号和和5端端转转录录暂暂停停位位点点，可可以以减减少上游序列转录通读造成的背景。少上游序列转录通读造成的背景。牛牛生生长长素素（BGH）基基因因的的PolyA信信号号比比SV40PolyA更更强强，常用于高效表达载体中。常用于高效表达载体中。终终止止序序列列：AAUAAA或或连连续续的的终终止止密密码码UGA、UAA和和UAG，能防止转录通读，使转录在正确的位点结束。，能防止转

29、录通读，使转录在正确的位点结束。在在转转录录起起始始点点上上游游或或下下游游使使用用相相同同类类型型的的增增强强子子，有有利利于于提高外源基因的转录水平。提高外源基因的转录水平。双顺反子表达载体：双顺反子表达载体：两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点使同一使同一mRNA中的第二个基因得到翻译。将中的第二个基因得到翻译。将dhfr与目标与目标基因串连，基因串连，dhfr的的cDNA插入内含子中，其转录产物被剪插入内含子中，其转录产物被剪切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。顺

30、反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有广泛应用前景。广泛应用前景。使筛选容易，而且能高效表达。使筛选容易，而且能高效表达。选择适宜的启动子，可实现定向表达。选择适宜的启动子，可实现定向表达。CMV启启动动子子和和人人EF-1启启动动子子，可可实实现现同同一一载载体体上上的的二二个个基因的独立表达。基因的独立表达。组组织织特特异异性性启启动动子子：如如鼠鼠、山山羊羊酪酪蛋蛋白白启启动动子子，可可使使基基因因主要在乳腺中表达。主要在乳腺中表达。N端端设设计计分分泌泌信信号号肽肽：如如Ig链链的的可可变变区区和和恒恒定定区区之之间间序序列，使外

31、源基因的表达产物向胞外分泌。列，使外源基因的表达产物向胞外分泌。C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。亚亚细细胞胞定定位位信信号号肽肽：目目标标基基因因产产物物将将转转运运到到细细胞胞核核、线线粒粒体、内质网或细胞质中，这对基因的功能研究非常合适。体、内质网或细胞质中，这对基因的功能研究非常合适。基因的扩增系统：基因的扩增系统：在逐渐提高选择压的情况下，使选择标记基因拷贝数增在逐渐提高选择压的情况下，使选择标记基因拷贝数增加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因水平。水平。最常用

32、二氢叶酸二氢叶酸还原酶（最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（DHFR）基因系统和）基因系统和谷氨酰氨合成酶（谷氨酰氨合成酶（GS）基因系统。）基因系统。氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使dhfr基因与目基因与目标基因大量增加，达到数千拷贝。标基因大量增加，达到数千拷贝。硫胺蛋氨酸使硫胺蛋氨酸使GS系统的基因得到大量扩增。系统的基因得到大量扩增。二、受体细胞二、受体细胞1人源细胞株系人源细胞株系Namalwa：类类淋淋巴巴母母细细胞胞，非非整整体体核核型型。表表达达IgM，悬悬浮浮生生长长。外外源源基基因因的的表表达达水水平平较较高高，可可用用无无血血清清培培

33、养养基基高高密密度度培培养养，已已成成功功地地表表达达了了rhEPO、rhG-CSF、tPA等等。英英国国Wellcome公公司司用用Namalwa细细胞胞的的反反应应器器达达8000L，用用Sendai病毒诱导，大规模生产病毒诱导，大规模生产干扰素，并批准上市。干扰素，并批准上市。WI-38：二二倍倍体体成成纤纤维维细细胞胞系系，2n=46，第第一一个个被被用用于于制制备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。MRC-5：二二倍倍体体成成纤纤维维细细胞胞系系，但但生生长长较较WI-38快快，对对逆逆境有一定抗性也用于制备疫苗。境有

34、一定抗性也用于制备疫苗。2哺乳动物细胞株系哺乳动物细胞株系CHO细细胞胞：中中国国仓仓鼠鼠卵卵巢巢中中分分离离的的上上皮皮样样细细胞胞系系，贴贴壁壁型型生生长长，是是目目前前使使用用最最为为普普遍遍和和成成熟熟的的表表达达糖糖基基化化蛋蛋白白药药物物的的宿宿主主细细胞胞。核核型型为为亚亚二二倍倍体体，分分泌泌表表达达外外源源蛋蛋白白，而而内内源源蛋蛋白白分分泌泌很很少少。贴贴壁壁型型生生长长细细胞胞，但但可可进进行行悬悬浮浮培培养养，对对剪剪切切力力和和渗渗透透压压有有较较高高的的忍忍受受能能力力。蛋蛋白白质质翻翻译译后后的的修修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。饰准确，表达产物

35、的结构、性质和生物活性接近天然。有有多多种种衍衍生生突突变变株株应应用用于于药药物物的的生生产产，培培养养时时需需要要添添加加脯脯氨氨酸酸。二二氢氢叶叶酸酸还还原原酶酶缺缺陷陷株株表表达达的的药药物物有有tPA、EPO、HBsAg疫苗、疫苗、G-CSF、凝血因子、凝血因子、DNA酶酶，已上市。，已上市。使使用用氨氨甲甲酰酰喋喋呤呤，增增加加外外源源基基因因的的拷拷贝贝数数，提提高高蛋蛋白白质质表表达水平。达水平。BHK21：幼幼仓仓鼠鼠肾肾脏脏中中分分离离的的成成纤纤维维样样细细胞胞，非非整整倍倍体体。用用于于增增殖殖病病毒毒、制制备备疫疫苗苗和和重重组组蛋蛋白白。BHK-21表表达达的重组凝

36、血因子的重组凝血因子已被获准上市。已被获准上市。C127：从从小小鼠鼠乳乳腺腺肿肿瘤瘤中中分分离离获获得得的的上上皮皮样样细细胞胞，贴贴壁壁型型生生长长。C127细细胞胞系系已已表表达达多多种种外外源源基基因因，其其中中EPO的的水平达水平达10mg/L，生产，生产rhGH已被批准上市。已被批准上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞：J558LJ558L是是小小鼠鼠BALB/cBALB/c骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞，分分泌泌I

37、gAIgA，用用于于转转染染研研究究。NSONSO和和SP2/OSP2/OAg14Ag14不不分分泌泌IgIg，与与淋淋巴巴细细胞胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。杂杂交交瘤瘤细细胞胞：从从小小鼠鼠脾脾细细胞胞与与骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞的的融融合合细细胞胞中中分分离离获获得得杂杂交交瘤瘤细细胞胞系系，能能在在无无血血清清培培养养基基中中高高密密度度悬悬浮浮生生长长，容容易易转转染染和和生生长长，能能进进行行糖糖基基化化等等加加工工修修饰饰，大大量量分分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。VeroVer

38、o：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用细胞系能用无血清培养。最为常用Vero E6Vero E6增殖多种病毒，增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。COSCOS：

39、是是从从SV40 SV40 DNADNA转转化化的的非非洲洲绿绿猴猴肾肾细细胞胞CV1CV1中中分分离离得得到到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。GH3GH3用于生长激素研究，用于生长激素研究，293293细胞系用于基因治疗的研究。细胞系用于基因治疗的研究。3昆虫细胞株系昆虫细胞株系Sf21：从从秋秋粘粘虫虫卵卵巢巢细细胞胞中中分分离离得得到到，细细胞胞较较大大，容容易易放大，高效表达外源基因。放大，高效表达外源基因。Sf9：从从秋秋粘粘虫虫的的卵卵巢巢细细胞胞（SF21）中中分分离离得得到到，是是最最常常用用的的昆昆虫虫表表达达细细胞胞。对对杆杆状状病病

40、毒毒高高度度敏敏感感，生生长长快快，能能高高效效表表达达外外源源基基因因。抗抗机机械械剪剪切切，能能在在无无血血清清培培养养基基的的搅拌反应器中生长。搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：从从粉粉纹纹夜夜蛾蛾卵卵细细胞胞匀匀浆浆中中分分离离得得到到，无无血血清清培培养养，快快速速倍倍增增。分分泌泌表表达达重重组组蛋蛋白白的的能能力力比比Sf9细细胞胞系系高高20多倍，能适应悬浮培养。多倍，能适应悬浮培养。三、细胞转染三、细胞转染转转染染（是是将将外外源源基基因因导导入入哺哺乳乳动动物物细细胞胞的的技技术术通通用用名名称称。基基因因导导入入真真核核细细胞胞的的方方法法很很多多，主主要要有有化化学学

41、转转染染、物物理理转转染和病毒介导的转化。染和病毒介导的转化。方法方法表表 达达 类类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点基因枪基因枪瞬瞬 时时，稳定稳定无无多多种种细细胞胞组组织，器官织，器官有有效效，仪仪器器操作操作显微注射显微注射瞬瞬 时时，稳定稳定无无多种细胞多种细胞有有效效，技技术术难度大难度大电穿孔电穿孔瞬瞬 时时，稳定稳定无无多种细胞多种细胞有有效效，仪仪器器操作操作冲击波冲击波瞬瞬 时时，稳定稳定无无多多种种细细胞胞，局部组织局部组织简简单单有有效效，仪器操作仪器操作方法方法表表达达类类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点逆逆 转转 录录 病病毒毒瞬瞬时时，稳定稳定无无对对应应

42、的的宿宿主主细胞细胞有效有效原原 生生 质质 体体融合融合瞬瞬时时，稳定稳定无无悬浮细胞悬浮细胞技术复杂技术复杂生物转染特点生物转染特点化学转染是最常用的转染方法。化学转染是最常用的转染方法。其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖）葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。磷酸钙与磷酸钙与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的形成不溶性沉淀，带正电荷的DEAE葡聚葡聚糖与带负电荷的糖与带负电荷的DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹

43、磷酸基团结合，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。形成脂质体。渗透性休克和渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进等化学试剂能促进DNA进入细胞。转进入细胞。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。影响因素：细胞培养物的密度、影响因素：细胞培养物的密度、DNA的大小、纯度与用量、的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。方法方法表表达达类类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点磷酸钙磷酸钙瞬瞬 时时、稳定稳定无无贴贴壁壁细细胞胞，悬浮细胞悬浮细胞简单简单DEAE-葡葡聚聚糖糖瞬时瞬时有

44、有CV1，COS简单简单阳离子树脂阳离子树脂瞬瞬 时时、稳定稳定有有或或无无贴贴壁壁、原原代代悬浮细胞悬浮细胞简单，有效简单，有效化学转染的特点化学转染的特点四、转染体筛选与分离四、转染体筛选与分离转转染染后后16天天收收获获细细胞胞，进进行行核核酸酸分分子子杂杂交交或或蛋蛋白白质质杂杂交，检测外源基因的瞬时表达。交，检测外源基因的瞬时表达。为为了了获获得得稳稳定定整整合合的的细细胞胞系系，先先在在非非选选择择性性培培养养基基上上培培养养2448小小时时，让让细细胞胞倍倍增增12代代，使使转转染染DNA表表达达。再再按按1：15比比例例转转移移到到选选择择性性培培养养基基上上，每每24天天更更

45、换换培培养养基基，持持续续23周周，促促进进抗抗性性细细胞胞生生长长，清清除除死死细细胞胞残残骸，最后得到独立的克隆。骸，最后得到独立的克隆。在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要显性选择标记来分离转染细胞。因此需要显性选择标记来分离转染细胞。哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。选择剂选择剂基因基因使用浓度使用浓度氨甲喋呤氨甲喋呤dhfr0.01300mol/L氨喋呤氨喋呤tk0.4mol/L5-溴脱氧尿苷溴脱氧尿苷tk30g/mlG418,Zeocinneo10080

46、0g/ml潮霉素潮霉素Bhyg10400g/ml杀瘟稻菌素杀瘟稻菌素bsd210g/ml霉酚酸霉酚酸gpt25g/ml嘌呤霉素嘌呤霉素乙酰基转移酶乙酰基转移酶0.510g/mlXyl-Aada4mol/L报告基因报告基因特点特点使用与分析方法使用与分析方法cat内内源源活活性性低低，蛋蛋白白稳稳定，线性范围窄，定，线性范围窄，体外，荧光或免疫分析体外，荧光或免疫分析lacZ有有内内源源活活性性，X-gal染染色，线性范围宽色，线性范围宽体体内内外外，染染色色，比比色色、化学发光或荧光分析化学发光或荧光分析碱碱性性磷磷酸酸酶酶分分泌泌型型，线线性性范范围围宽宽，受到细胞类型限制受到细胞类型限制体

47、体外外，比比色色、化化学学发发光光或荧光分析或荧光分析gus蛋蛋白白质质稳稳定定，线线性性范范围宽，围宽，X-Gluc染色染色体体内内外外，染染色色，比比色色、化学发光或荧光分析化学发光或荧光分析gfp无无内内源源活活性性，分分子子量量小小，稳稳定定，无无需需底底物物，紫紫外外线线激发激发体内外，荧光分析体内外，荧光分析第三节第三节动物细胞培养的需求与培养基的制备动物细胞培养的需求与培养基的制备动动物物细细胞胞离离体体后后，失失去去了了消消化化等等系系统统，不不能能利利用用多多糖糖、蛋白质等聚合程度高的化合物。蛋白质等聚合程度高的化合物。只只能能利利用用简简单单的的单单体体化化合合物物如如单单

48、糖糖、氨氨基基酸酸等等，为为了了维维持持细细胞胞正正常常生生长长，还还必必须须添添加加维维生生素素、无无机机盐盐类类、生生长长类类因因子子及及激激素素、结结合合蛋蛋白白质质、贴贴附附与与伸伸展展因因子子及及其它附加成分等。其它附加成分等。动动物物细细胞胞对对培培养养环环境境的的要要求求高高，不不同同细细胞胞系系的的要要求求也也不尽相同，培养基要尽可能与体内生活条件接近。不尽相同，培养基要尽可能与体内生活条件接近。一、动物细胞培养的营养需求一、动物细胞培养的营养需求1.糖类糖类糖类是细胞主要的营养物质，分解后释放出能量糖类是细胞主要的营养物质，分解后释放出能量ATP。培养基中都必须添加葡萄糖，有

49、时添加核糖等。培养基中都必须添加葡萄糖，有时添加核糖等。提高细胞生长的碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。提高细胞生长的碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。2.氨基酸氨基酸氨氨基基酸酸是是蛋蛋白白质质和和酶酶的的组组成成单单位位。氨氨基基酸酸还还参参与与合合成成一一些些含含氮氮化化合合物物，核核苷苷酸酸的的四四种种嘌嘌呤呤和和嘧嘧啶啶碱碱基基、儿儿茶茶酚酚胺胺等等含含氮氮激激素素及及神神经经递递质质等等。氨氨基基酸酸可可通通过过生生糖糖或或生生酮酮途途径径转转变为糖或脂肪酸，间接提供能量。变为糖或脂肪酸，间接提供能量。动物细胞：动物细胞：810种必须氨基酸。种必须氨基酸。离体容易失去，离体容易

50、失去，20种氨基酸中至少种氨基酸中至少12种是必需氨基酸：种是必需氨基酸：精精氨氨酸酸、半半胱胱氨氨酸酸、组组氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、亮亮氨氨酸酸、赖赖氨氨酸酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等。蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等。谷氨酰胺还可作为重要的碳源和能源而被利用。谷氨酰胺还可作为重要的碳源和能源而被利用。3.维生素维生素维维生生素素是是一一类类微微量量的的小小分分子子有有机机生生物物活活性性物物质质，对对代代谢谢和和生长起调节和控制作用。生长起调节和控制作用。水水溶溶性性维维生生素素包包括括B族族维维生生素素和和维维生生素素C。B族族维维生生素素