无菌检查法及其验证幻灯片.ppt

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1、无菌检查法及其验证第1页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查法概念 无菌检查是通过目检微生物在培养基中的生长来判断结果。无菌检验只能给出该批产品受污染的程度。无菌检验合格只能说明被测样品无菌，不能证明整批样品无菌。第2页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查的设施、环境、人员 检查环境应在洁净度10000级下的局部洁净度100级的单项流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。第3页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查的设施、环境、人员 规定应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮

2、游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度的验证。日常检验还需对试验环境进行监控。第4页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查的设施、环境、人员 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。第5页，共82页，编辑于2022 年，星期六 无菌隔离系统 无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独立环境系统。使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间,保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现假阳性结果,保证无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要求；保护操作人员免受实验过程

3、中的有害物质带来的污染；放置隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点。第6页，共82页，编辑于2022 年，星期六HTY无菌隔离系统第7页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查用培养基的种类及用途 硫乙醇酸盐流体培养基-培养好氧菌、厌氧菌 改良马丁培养基-培养真菌及好氧细菌 选择性培养基-按硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂。第8页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基的制备及装量 培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基

4、氧化层（粉红色）不超过培养基深度1/2。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。第9页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基的储存 制备好的培养基应该保存在2-25、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。应结合实际情况进行验证，以确定培养基有效期。第10页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基的适用性检查 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。无菌性检查 重要性：培养基无菌不合格将导致实验的假阳性结果。检查：每批

5、培养基随机抽取不少于5支或5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30-35培养，改良马丁培养基置23-28培养，培养14天，应无菌生长。第1 1页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基的适用性检查 灵敏度检查菌种 硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 改良马丁培养基 白色念珠菌 黑曲霉第12页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基的适用性检查菌种选择的原则 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭

6、菌（代表厌氧菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉菌）。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的菌种保藏方法保存，以保证菌种的生物学特性。加菌量:100cfu。第13页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基的适用性检查菌液制备 试验菌 培养基 培养温度 培养时间 金黄色葡萄球菌 营养肉汤 30-35 18-24铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 硫乙醇酸盐流体白色念珠球菌 改良马丁培养基 23-28 24-48黑曲霉 改良马丁琼脂斜面 5-7天第14页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基的适用性检查培养基接种 试验菌 培养基 每管装量 接种管数 接种量 培养时间金黄色葡萄球菌

7、 硫乙醇酸盐 12 ml 2 支 1 ml 3天铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌生孢梭菌 白色念珠球菌 改良马丁培养基 9 ml 2支 1 ml 5天黑曲霉 其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1支不接种作为空白接种量 100cfu（不能多）第15页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基的适用性检查结果判断 空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。试验同时应做空白对照第16页，共82页，编辑于2022 年，星期六培养基说明 无菌检验培养基所能支持生长的微生物是有限的。微生物种类繁多，这些微生物有广泛的生长要求，如：营养、温度和氧等。无菌检验培养基不可能支

8、持所有微生物的生长，选择了支持那些最有可能污染药品和在药品中生长的微生物的营养的培养基。第17页，共82页，编辑于2022 年，星期六供试品的无菌检查法 无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只要供试品性状允许，应优先采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率，特别是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消除供试品的抑菌性，提高检出率。第18页，共82页，编辑于2022 年，星期六供试品的无菌检查法-直接接种法 样品直接移入无菌培养基中。每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%。同时硫乙醇酸

9、盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。第19页，共82页，编辑于2022 年，星期六供试品的无菌检查法-薄膜过滤法 原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长），然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性，水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。供试液经薄膜过滤后，若

10、需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，且冲洗量不超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤），也可使用一般薄膜过滤器。滤膜孔径不大于0.45m，直径约为50mm。第20页，共82页，编辑于2022 年，星期六供试品的无菌检查法 检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数量 采用薄膜过滤法应增加1/2的最小检验数量作为阳性对照；采用直接接种法应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作为阳性对照。检验量 指一次试验所用供试品总量（g或ml），若每支（瓶）供试品装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基

11、。采用薄膜过滤法时，检验量不应少于直接接种法的供试品总量，只要供试品的特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤.第21页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查的稀释液、冲洗液 无菌检验所用稀释液、冲洗液种类应对微生物无毒、无抑制作用。稀释液用量、冲洗液冲洗次数及用量等应当与验证合格的方法一致。每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不宜过大（不超过1000ml），用量过多不仅容易破坏滤膜上截留的微生物，而且对滤膜造成损伤；但也不能太少，否则不能将供试品冲洗干净，无法消除抑菌性。0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液如需要可加入表面活性剂或中和剂,应经方法验证证明其有效性，

12、并对细菌存活无影响。第22页，共82页，编辑于2022 年，星期六供试品溶液的制备 水溶液供试品 取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如果采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用。第23页，共82页，编辑于2022 年，星期六 可溶于水的固体制剂供试品 取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶

13、，然后照水溶液供试品项下的方法操作。-内酰胺类抗生素供试品 取规定量，按水溶液或固体制剂供试品的处理法处理，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜。再用含适量-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基，必要时培养基中可加少量的-内酰胺酶；或将滤膜直接接入含适量-内酰胺酶的培养基中。接种培养基的方法照水溶液供试品项下的方法操作。供试品溶液的制备第24页，共82页，编辑于2022 年，星期六 非水溶性制剂供试品 取规定量，直接过滤或混合溶于含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。用含0.1%-1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基

14、中培养。培养基接种照水溶液供试品项下的方法操作。其他类供试品：可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品 无菌气（喷）雾剂供试品 装有药物的注射器供试品 具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品 供试品溶液的制备第25页，共82页，编辑于2022 年，星期六阳性对照试验 目的：验证供试品经灭活后或用其它方式（稀释、冲洗等）处理后是否仍有抑菌或杀菌的作用，确保检验条件符合要求，防止出现假阴性。培养条件是否符合要求。应根据供试品的特性选择阳性对照菌。无抑菌及抗革兰阳性-金黄色葡萄球菌 抗革兰阴性-大肠埃希菌 抗厌氧菌-生孢梭菌 抗真菌-白色念珠菌 阳性对照菌加量：100cfu 阳性对照培养48-

15、72h 应生长良好。第26页，共82页，编辑于2022 年，星期六阴性对照 不加样品的无菌检验 目的：确认无菌检验所用的稀释液、冲洗液、培养基、青霉素酶、集菌器等物品及人员操作、检验环境、仪器设备等是否有菌存在。应取相应溶剂和稀释剂同法操作。应与无菌检验同时做。阴性对照不得有菌生长。第27页，共82页，编辑于2022 年，星期六 培养及观察 供试品无菌检查培养温度和时间非常重要，只有在合适的温度和时间内微生物才能生长良好。培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至同种培养基或划线接种于斜面培养基上，培养细菌2天、真菌3天，观察有无菌生长，或镜检进行判

16、断。第28页，共82页，编辑于2022 年，星期六结果判断 前提:阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，无菌检验方有效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。若供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。除非能充分证明，生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：第29页，共82页，编辑于2022 年，星期六 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证有微生物生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。

17、第30页，共82页，编辑于2022 年，星期六试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定，若有菌生长判供试品不符合规定。第31页，共82页，编辑于2022 年，星期六 若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。所有供试品管均无菌生长，方可判供试品符合规定。以一次检出为准，除非有证据充分证明检出的微生物非供试品本身所致，原检验结果无效，应重试。第32页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检验的局限性 本版药典无菌检查法指出：若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。药品要

18、么是无菌的，要么就是非无菌的。药品是否无菌的结论一直是以药典规定的无菌检查抽样和试验方法的结果作为判断依据。无菌检查存在着很多局限性，最明显的是无菌检查方法本身。不管样品是否有好的代表性，它的结果总是存在不确定性。它是一个破坏性的试验，它与整个批的一个随机样品的统计选择性有关。第33页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检验的局限性 从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应对每个容器进行无菌检查。但是无菌试验对样品是破坏性的，因此不可能对每一最小包装的产品进行检查。统计概率的局限性：对于低污染水平的产品，其局限性在统计学上更为明显。检验条件的局限：样品中污染的微生物的检出受多种因数的影响

19、，只有在各检验条件符合污染微生物的修复和生长时，才能保证被检样品的无菌检验结果的准确性。污染的检出率要比实际产品的污染率低第34页，共82页，编辑于2022 年，星期六 无菌检查存在检查失误的可能性：这可能是因为污染菌浓度太低，或是污染菌生长太慢，或是因为培养基不良等原因，在培养期间污染菌根本就不生长。产品的染菌率愈小，错判合格的可能性就愈大。无菌检查的另外一个弊端，即当无菌检查发现阳性结果时，按照规定可以重新复查（这也是应该的）。复查时尽管已经适当地加大了样本数量，但再检出的几率就更低了。所以在评价某个无菌制品的某个批的无菌状态时，仅依靠最终产品的无菌检查是不充分的，局限性较大。对无菌制品来

20、说，生产最终产品的所有系统的工艺才是最重要的。第35页，共82页，编辑于2022 年，星期六抽样 由于无菌检查法的统计学局限性，对于同一批的无菌分装的产品，应尽量抽取批生产开始和结束或生产过程出现异常情况下的产品组成样本进行检验。对于采用最终灭菌的产品，应抽取每一灭菌柜中经验证过的可能存在灭菌不彻底的点的产品组成样本进行检验。如果试验结果判为无效，那么重试试验的样品应尽量取与初试同一时间分装或同一灭菌位置的样品进行检验。第36页，共82页，编辑于2022 年，星期六关于方法验证试验 为什么验证？验证什么？怎么验证？第37页，共82页，编辑于2022 年，星期六为什么验证 采用经过验证的方法，是

21、分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检查作为药品质量体系中的一个环节，应与其他检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结果的科学性，如鉴别、含量测定。验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多方面：无菌环境验证（尘埃粒子、浮游菌、沉降菌检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性对照、阳性对照等。第38页，共82页，编辑于2022 年，星期六为什么验证 药典充分借鉴发达国家经验，将微生物检查方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。验证实验伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。有了系统的方法验证，可以避免以往因为

22、阳性菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判，以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以及新的药品注册管理办法的要求都是相一致的。第39页，共82页，编辑于2022 年，星期六为什么验证 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠性及检验方法的完整性。第40页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证什么 微生物检验：某种样品采用某种方法得到一个检查结果。供试品影响 方法的有效性第41页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证什么 验证试验方案的设计需满足两方面的要求：一方面，样品的预处理方式能有效消除（或中和）样品的抑菌性；另一方面，样品的预处理方

23、式和检测过程以及培养条件等均不会影响样品中的微生物生长。第42页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证 药品微生物检查方法验证的一般程序与环节需前处理不需前处理去除抑菌作用 有抑菌作用无抑菌作用样品可以通过验证实验判断验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出影响验证前处理方法对污染菌生长、检出影响样品有抑菌作用无抑菌作用有抑菌作用去除抑菌作用验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出影响去除抑菌作用样品验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出影响去除抑菌作用样品不需前处理样品需前处理不需前处理样品需前处理不需前处理样品需前处理不需前处理样品无抑

24、菌作用有抑菌作用需前处理不需前处理样品无抑菌作用有抑菌作用需前处理不需前处理样品第43页，共82页，编辑于2022 年，星期六需要验证的重点环节 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究提高。供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。第44页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证的类型 前验证:建立药品的无菌检查法时，需对供试品的抑细菌和

25、抑真菌特性及无菌检查方法的可靠性进行验证 再验证:修订的检验方法;供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，应重新验证；定期的方法验证.第45页，共82页，编辑于2022 年，星期六供试品中抗菌活性的去除 稀释法：降低供试品的相对浓度 薄膜法：利用体积差异分离 中和法：利用化学（生物）专属性灭活 离心法：利用沉降系数差异分离第46页，共82页，编辑于2022 年，星期六抗菌活性去除效果的检验 应根据供试品的特点，选择敏感菌株，对供试品抗菌活性去除效果加以检验再按药典要求全面验证，提高效率。第47页，共82页，编辑于2022 年，星期六选择敏感菌株 间接方法：文献、技术资料（可靠）直接

26、方法：预实验（个体抑菌实验）参考选择：一般中药选择枯草和金黄；抗生素根据抗菌谱选择。第48页，共82页，编辑于2022 年，星期六选择适宜的方法 可靠、稳定、简便 参考方法：在样品许可的条件下 薄膜过滤，冲洗 第49页，共82页，编辑于2022 年，星期六什么时候不验证 已经验证过的、体系中没有变化因素的 不用验证的 参照质量体系中其他项目的执行情况第50页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证以后怎么办 按验证确立的方法进行供试品的无菌检查。验证资料的审查、复核与采纳。方法验证与无菌检验标准建设。第51页，共82页，编辑于2022 年，星期六结果总结与报告 综合分析实验中遇到的所有情况，

27、最终形成一份详细、严谨、具有可操作性的验证报告。给出该品种的标准检验规程，以及各方法操作的关键点，以供检验参考。方法验证实验报告 标准的技术文件。第52页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查方法的验证 验证的目的:在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检出。验证实验 检验条件 检验方法 样品量 检验规程 稀释液种类及体积 SOP 中和剂 培养基 培养时间 培养温度第53页，共82页，编辑于2022 年，星期六影响无菌检验的因素 样品/药品本身的特殊性 样品/药品中添加的防腐/抑菌剂 培养基的特性 培

28、养条件 人员因素第54页，共82页，编辑于2022 年，星期六 验证试验可在供试品的无菌检查之前或与供试品的无菌检查同时进行。当同时进行时，若验证试验失败，那么供试品的无菌检查结果是不成立的。第55页，共82页，编辑于2022 年，星期六菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。l验证用菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢 杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。l选择的原则:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,标 准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌液制备：同培养基灵敏度试验方法加菌量:100cfu。第56页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证方法：薄膜过滤法 将规定量的供试品

29、按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌、过滤。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积相同培养基的容器，加入等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温度培养35天。各试验菌同法操作。第57页，共82页，编辑于2022 年，星期六 结果判断：与对照管比较，如含供试品各管中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用。按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。可采用增加冲洗量，增加培养基的用量，使用中和剂或灭活剂；更换滤膜品种等方法消除供

30、试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。无菌操作过程对消除抑菌有很大关系各方法组合运用，效果更佳！第58页，共82页，编辑于2022 年，星期六 样品处理 主要强调固体样品的溶解、转移、均匀分配问题。通常将规定取样量全部转移到400500ml稀释剂或者适宜溶液，再进行分配。冲洗方法 强调少量多次：50ml/次；强调充分振摇；操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过程中盖还是不盖滤筒下口等等。菌液加入 菌液组、供试品加菌液组严格一致。无菌检查法验证实验要点第59页，共82页，编辑于2022 年，星期六中和剂加入 不同中和剂加入方式可能效果不一样。直接加入培养基中效果最好。但如果某些中和剂对微生物生长

31、不利可考虑其他步骤加入。菌液加入 按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑过滤器的有效性。而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。第60页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查方法验证 通过验证最终确定：样品检验量，稀释液类型、用量及样品浓度，薄膜过滤器类型，冲洗液类型及冲洗次数，酶的浓度、加酶量及加酶方式，阳性对照菌，培养基生产单位、配制、消毒及用量，培养温度与时间等。第61页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查方法验证 为了考察检验方法的稳定性和重现性，验证时，至少

32、需准备3个不同批次的同类样品，3名不同实验人员分别进行3次验证试验。一旦验证合格，无菌检查方法必须严格按照验证合格的程序进行，涉及到培养基的生产单位、配制、灭菌及用量，稀释液、冲洗液的种类、配制、灭菌及用量，青霉素酶的浓度、加入量、加入方式，菌液制备及计数方式，集菌器的规格型号、生产单位，集菌仪，培养温度，培养时间等均应与验证时所用的仪器设备及物料一致。第62页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证试验应注意的问题 样品的选择（是否有抑菌性）样品必须无菌合格 供试液浓度的选择（浓度不能太高）充分振荡 试验菌株测试的顺序（先验证敏感菌）菌液的加法（最后一次冲洗液加入）培养基的用量 三次平行试

33、验第63页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证试验记录 总的要求：详细、严谨、可操作性 供试品信息 检验数量和检验量：按照无菌检查的量确定 供试品处理、供试品溶液的制备 检验方法（选择直接接种法说明理由）实验用菌：代数、稀释级、计数 培养基信息 检验条件：主要是冲洗条件（冲洗液、冲洗次数、量，必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等条件）。需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明 逐日记录各菌的生长情况第64页，共82页，编辑于2022 年，星期六验证试验结论 采用的方法：薄膜过滤法/直接接种法 供试品检验量及处理、制备情况 关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处理等因素。阳性对照菌的选择第65页，共

34、82页，编辑于2022 年，星期六 薄膜过滤法加菌的时机 按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，而验证试验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌的生长的影响，可以与对照滤器比较而作出判断，所以验证试验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。验证及资料中常见的问题第66页，共82页，编辑于2022 年，星期六薄膜过滤法滤膜材质选择 普通滤膜 有机膜 低吸附滤膜 1.根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。2.应保证滤膜在过滤前后的完整性。3.采用全封闭过滤器注意观察膜的状态，某些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供试品可以损伤普通滤膜。第67页，共82页，编辑于2022 年，星期六敏感菌株与阳性对照

35、菌 阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌株 问题：降低了阳性对照菌的意义，实际工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多（敏感菌株），但阳性对照只能选择金黄色葡萄球菌。第68页，共82页，编辑于2022 年，星期六稀释液选择的问题 药典附录无菌检查法规定的稀释液和冲洗液只有2种，即0.1%蛋白胨水溶液和PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。但各药品项下却规定用0.9%的氯化钠溶液做为稀释液，采用经验证合格的适宜的溶液作为稀释剂、冲洗液。理论上使用0.1%蛋白胨水溶液和PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液做为稀释液和冲洗液效果更好，因为这2种溶液具有修复已损伤的微生物的作用，可以提高检出率。第69页，共82页，编辑于2

36、022 年，星期六 薄膜过滤法和直接接种法 如：一般供试品（无特殊说明）采用直接接种法某厂家胸腺五肽注射液为普通注射剂，完全可以采用薄膜过滤法，生产单位进行的无菌检查验证法为直接接种法。也有的厂家把两种方法的验证都写上，结论中也没有说明采用那种方法。无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。修订：改为薄膜过滤法重新进行验证。问题：方法选择错误第70页，共82页，编辑于2022 年，星期六问题：冲洗条件、冲洗量的选择 有些验证资料中，对非抑菌性供试品也采用大量的冲洗，100ml/次*10次/膜，增加了出现误差的机会。1.对膜的损伤 2.检验方法繁琐，大大增加检验

37、人员的工作量（检验要按照已经验证的方法进行）3.验证试验方法选择总的原则是由易到难第71页，共82页，编辑于2022 年，星期六 冲洗不一定为100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振摇。对于抑菌性较强的供试品，可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤，以减少膜的吸附,减少冲洗量。如：抗生素品种取规定量，混合至含适量稀释液（如500ml等)的无菌容器中，然后再过滤。对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或固体原料，一定要充分溶解、混合均匀。抗菌药可以根据其抗菌谱选择敏感菌先进行预试验，找到合适的条件再进行其他菌的实验。采用开放式薄膜过滤器：滤膜分成几份与取样量、冲洗条件的选择有关，建议尽量与无菌检

38、查法一致（最常见为3等分）。第72页，共82页，编辑于2022 年，星期六方法描述不够详细，没有可操作性 如：某产品验证资料内容“将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入小于100CFU的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养集中，或将培养基加至滤筒中”。验证的目的是为了“照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查”，方法确立后，以后该产品就可以采用该方法进行检验。修订：应记录取样量、（稀释方法）、冲洗液、冲洗量（冲洗条件）等。第73页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查方法验证操作过程供试品溶液制备：取无菌供试品约10g，用无菌注射器吸取适量pH7.0氯

39、化钠-蛋白胨缓冲液将其溶解，全量移至500ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，充分溶解摇匀后制成2%青霉素钠供试品溶液。第74页，共82页，编辑于2022 年，星期六 无菌检查方法验证操作过程 冲洗量确定：根据供试品的特性首先选择对供试品敏感的菌确定冲洗量，同时确定阳性对照菌。将供试品溶液按薄膜过滤法过滤，并用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量约为100ml，共冲洗3次，并在最后一次冲洗液中加入小于100cfu的菌，然后在滤筒中加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，放置30-35恒温室培养5天观察结果；另取上述供试品溶液，按以上方法操作，但冲洗次数为4次（每次100 ml），

40、同时进行阳性对照。第75页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查方法验证操作过程冲洗量（ml）培养时间（天）1 2 3 4 50 300 400 阳性对照-+-+-+第76页，共82页，编辑于2022 年，星期六 无菌检查方法验证操作过程 A组（试验组）将供试品溶液按薄膜过滤法过滤，并用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量约为100ml，共冲洗4次，并在最后一次冲洗液中逐一加入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，最后在4个加有细菌的滤筒中分别加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，放置30-35 恒温室培养5天观察结果；在

41、2个加有真菌的滤筒中分别加入100ml改良马丁培养基，放置23-28 恒温室培养5天观察结果。培养基中加青霉素酶，每100ml培养基加2ml酶。第77页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查方法验证操作过程 B组（缓冲液对照组）不加供试品，用等量500ml pH7.0 氯 化 钠-蛋 白 胨 缓 冲 液替代供试品溶液，操作同A组（试验组）。C组（阳性对照组）取4个装有100ml硫乙醇酸盐流体培养基的滤筒，逐一加入与A组（试验组）等量的金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌，放置30-35恒温室培养5天观察结果；取2个装有100ml改良马丁培养基的滤筒，逐一加入与等A组（试验

42、组）量的白色念珠菌、黑曲霉，放置23-28恒温室培养5天观察结果。D组（阴性对照组）同供试品无菌检查，阴性对照均应无菌生长。第78页，共82页，编辑于2022 年，星期六 验证时为了保证实验的成功率，最好首先进行B组（缓冲液对照组），C组（阳性对照组），D组（阴性对照组）三组实验验证因为稀释剂对照组实验不符合要求，那么试验组也就没意义了，所以必须是稀释剂对照组符合要求后，试验组才能进行。第79页，共82页，编辑于2022 年，星期六无菌检查方法验证结果分析结果分析：阴性对照均呈阴性，验证方有效。说明本次验证所用供试品及相关物品均无菌，且验证操作正确，无污染事件发生。如果A组与B组的微生物生长数

43、量和生长时间一致，表明该样品的预处理方式能有效消除样品的抑菌性；如果B组与C组的微生物生长数量和生长时间一致，表明样品预处理所用稀释液、冲洗液、中和剂的毒性，检测程序和培养条件等均不会影响微生物的生长。第80页，共82页，编辑于2022 年，星期六微生物验证日期批号试验组 缓冲液对照组 阳性对照组培 养 时 间（天）1 2 3 4 51 23 4 5 1 23 4 5金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉+-+-+-+-+-+-+-第81页，共82页，编辑于2022 年，星期六 验证试验失败后，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。可采用增加冲洗量，增加培养基的用量，使用中和剂或灭活剂；更换滤膜品种等方法消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。全部验证必须按照批准的验证方案进行，验证结束后应该及时汇总验证数据记录和验证报告，然后根据验证程序编写无菌检验SOP。第82页，共82页，编辑于2022 年，星期六