蛋白质的提取纯化和素材644.ppt

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1、蛋白质的提取(tq)纯化和分析第一页，共二十八页。材料(cilio)(cilio)选择和预处理细胞(xbo)(xbo)破碎蛋白质的粗提目目 录录题目(tm)(tm)分析蛋白质的纯化蛋白质的纯化分析检测第二页，共二十八页。1题目(tm)解析某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点3.94.1，它能耐一定的高温，在90 C加热34 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露(bol)它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。在钙离子的作用下才能起到暴露疏水在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能集团发挥性能(xngnng)(xngnng)，结

2、合蛋白，结合蛋白质根底知识从而可以判断其为钙调蛋质根底知识从而可以判断其为钙调蛋白。白。第三页，共二十八页。材料的选择材料的选择TEXTTEXT材料的预处理材料的预处理成年健康雄性大鼠脑组织20克比雌鼠体积大，本钱(chngbn)较低物种易获得将切取的组织用4预 冷0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸(lzh)吸干残留的PBS磷酸盐缓冲液 第四页，共二十八页。预处理过的组织预处理过的组织(zzh)细胞破碎(p su)高速珠磨法 制备制备(zhbi)(zhbi)组组织细胞悬液剪织细胞悬液剪碎法碎法 蛋白质被释放出蛋白质被释放出来来331122破碎第五页，共二十八页。剪碎法1.将组织块放

3、入平皿后，参加(jir)少量PBS；2.用眼科剪将组织剪至匀浆(yn jin)状，参加10 ml PBS；3.用吸管吸取(xq)组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；返回返回第六页，共二十八页。高速(o s)珠磨法破碎(p su)机理：高速珠磨法是一种有效的细胞破碎方法，珠磨机是该法所用的设备，其结构示意图见图1。微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子(zh zi)之间以及珠子(zh zi)和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞膜破裂，释出内含物。在珠液别离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。第七页，共二十八页。

4、钙调蛋白钙调蛋白(dnbi)(dnbi)的粗提取的粗提取抽提 蛋白质破碎后，使用适当(shdng)的溶剂，将蛋白质提取溶解到溶剂当中，常用稀酸、稀碱、有机溶剂等电点3.94.1酸性(sun xn)蛋白质稀碱性溶液抽提溶液碱性的程度，碱性过大那么难以复性pH调至等电点偏碱的一侧4.1第八页，共二十八页。粗提取物离心(lxn)操作除去固体(gt)杂质的上清液第九页，共二十八页。热变性热变性(binxng)(binxng)初步纯化初步纯化天然(tinrn)结构%钙调蛋白(dnbi)一般蛋白100热稳定性不同第十页，共二十八页。其他其他(qt)(qt)方法方法盐析(yn x)法等电点法有机溶剂法第十一

5、页，共二十八页。3蛋白质的精纯和分析(fnx)鉴定第十二页，共二十八页。亲和色谱亲和色谱(s p)(s p)配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配体蛋白质和配体复合物复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配载体与配体交联体体交联体杂质杂质杂质杂质游离游离配体配体洗脱(x tu)结合(jih)耦联作用机理作用机理第十三页，共二十八页。金属金属(jnsh)(jnsh)螯合亲和层螯合亲和层析析钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+结构域,每个结构域可以结合一Ca2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+结合后的构型相当

6、稳定。第十四页，共二十八页。金属金属(jnsh)(jnsh)螯合色谱螯合色谱原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基 与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相 上，二价金属离子可以与流动相中含有(hn yu)的半胱 氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合 作用而进行别离NHNH2 2NHNH2 2NiNiHisHisHisHisHisHisHisHisproteinprotein第十五页，共二十八页。步骤步骤(bzhu)(bzhu)1.制作金属螯合亲和色谱柱：用浓度为制作金属螯合亲和色谱柱：用浓度为0.2 mol/L的的CaCl2溶液上溶液上柱。将上清液柱。将上清液PH调制调制6-8，

7、参加蛋白质解离抑制剂。慢上样，参加蛋白质解离抑制剂。慢上样3.再用配体再用配体CaCl2溶液洗脱，下方流出为目的蛋白液，用大使管溶液洗脱，下方流出为目的蛋白液，用大使管或者烧杯或者烧杯(shobi)盛装之。盛装之。2.上柱后依次用50ml bufferB、200ml含0.5mol/L NaCl的bufferB洗脱(x tu)。下方用大试管或烧杯收集杂质液。第十六页，共二十八页。配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物第十七页，共二十八页。步骤步骤(bzhu)(bzhu)目的(md)：除去蛋白液中配体离子方法一：半透膜进行透析方法二：将上次获得目的蛋白液经凝胶过滤色谱柱下方首次接

8、受的溶液即为高纯度的钙调蛋白溶液；第二次接受到的即为配体离子的溶液。第十八页，共二十八页。凝胶过滤色谱(s p)的洗脱第十九页，共二十八页。定性分析分析(fnx)鉴定定量分析第二十页，共二十八页。定性分析定性分析(dngxngfnx)(dngxngfnx)第二十一页，共二十八页。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定(cdng)蛋白质分子量用SDS-PAGE检测不同纯化阶段所获得的提取液样品中CaM的纯度与相对分子质量。电泳采用质量分数为15%的别离胶和质量分数为5%的浓缩胶，120V 电压条件(tiojin)下进行电泳，直至溴酚蓝到达凝胶底部，考马斯亮蓝染色，凝胶成像仪成像。当分子量在15K

9、D到200KD之间时，蛋白质的移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX 假设将分子量的标准蛋白质的迁移率对分子(fnz)量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。第二十二页，共二十八页。定量分析(dnglingfnx)紫外检测法简单快速不破坏样品准确度低考马斯亮蓝染色法简单迅速干扰少灵敏度高(1g)Folin-酚试剂法灵敏度高常用第二十三页，共二十八页。goalsgoalsFolin-酚试剂(shj)(shj)法在碱性条件下蛋白质和铜作用(zuyng)生成蛋白质-铜络合物此络合物将Fo

10、lin试剂复原(hun yun)，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。step1step2第二十四页，共二十八页。Thank you!Thank you!第二十五页，共二十八页。人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己(zj)的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。第二十六页，共二十八页。第二十七页，共二十八页。内容(nirng)总结蛋白质的提取纯化和分析。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。2.用眼科剪将组织剪至匀浆状，参加10 ml PBS。3.用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。溶液碱性的程度，碱性过大那么难以复性。氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合。3.再用配体CaCl2溶液洗脱(x tu)，下方流出为目的蛋白液，用大使管或者烧杯盛装之。鼓舞我们前进第二十八页，共二十八页。