烟草抗青枯黑胫病益生菌剂研制与应用精品文稿.ppt

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1、烟草抗青枯黑烟草抗青枯黑胫病病益生菌益生菌剂研制与研制与应用用第1页，本讲稿共31页第2页，本讲稿共31页1.项目实施的背景项目实施的背景1.1 青枯病、黑胫病是烟草生产上的毁灭性病害。湘西土样中青枯菌含量较大，永州次之，郴州相对较少，土壤中青枯菌含量湘西土样中青枯菌含量较大，永州次之，郴州相对较少，土壤中青枯菌含量与青枯病发生的严重程度呈正相关，其中加青枯菌拮抗菌肥土壤中的含菌量明显与青枯病发生的严重程度呈正相关，其中加青枯菌拮抗菌肥土壤中的含菌量明显少于未加菌肥土壤少于未加菌肥土壤 杜桂萍，周建国，烟草青枯病菌的田间快速检测，湖南农业大学学杜桂萍，周建国，烟草青枯病菌的田间快速检测，湖南农

2、业大学学报报.2010,36(2):192-195.1.2 对青枯病的防治尚无理想药剂和抗病品种。规模化发展、集约化经营规模化发展、集约化经营烟草连作烟草连作病原积累病原积累病害发生造成损失病害发生造成损失易感品种易感品种第3页，本讲稿共31页合成农药合成农药的长期使用的长期使用l活性化合物积累活性化合物积累l农药残留农药残留l非靶标毒性非靶标毒性l病原菌耐药性逐渐增病原菌耐药性逐渐增强强l烟草及其制品安烟草及其制品安全性全性烟烟草草可可持持续续发发展展受受到到影影响响1.3 化学农药使用的长期影响。第4页，本讲稿共31页1.4 湖南省郴州市烟草种植面临的主要问题。n目前最突出的问题是根茎病害

3、和叶部病害；目前最突出的问题是根茎病害和叶部病害；n根茎病害发生规律复杂、危害严重、难以控制。根茎病害发生规律复杂、危害严重、难以控制。n烟草青枯病和黑胫病是烟草的系统性、突发性和流行性病害，面积和危害烟草青枯病和黑胫病是烟草的系统性、突发性和流行性病害，面积和危害程度都在扩大，已经成为制约我省郴州市烟叶生产可持续发展的重要的因程度都在扩大，已经成为制约我省郴州市烟叶生产可持续发展的重要的因素。素。第5页，本讲稿共31页文献检索后发现文献检索后发现有关烟草青枯病害的报道有162篇论文王岩等以硫酸庆大霉素为诱变剂，通过浓度梯度平板法筛选出拮抗效果与T5菌株类似的抗性突变菌株T5-1，该菌遗传稳定

4、性较好。以牛粪、玉米秸秆为原料生产有机肥，当堆温达到50 以上后保温2周，然后降温至40时接入T5-1菌株，40 下培养3 d，可得到拮抗菌和嗜温菌浓度均为1012cfu/g(干基)的高密度堆肥产品。大田试验结果表明，该有机肥对烟草青枯病具有一定的防治效果，第一年有机肥施用量较小，效果不显著；第二年连续施用有机肥且加大施用量，抗病效果显著增加，其中生物有机肥作基肥施用效果最好，青枯病的发病率较对照降低了50.65，病情指数降低了71.09。第6页，本讲稿共31页有关烟草黑胫病害的报道有179篇论文。方敦煌等报道生防菌GP13不同施用时期防治效果表明，生防菌对烟草黑胫病的防治效果在40.1-90

5、.5，3个时期以成活后施用，防治效果较好，移栽期效果稍差，假植期防效相对较差。500倍生防菌菌剂的防效与对照药剂相当，防效为42.6-94.5。第7页，本讲稿共31页未见通过直接对病原菌抗生素标记，不经过平板拮抗，直接进行土壤菌株对抗筛选的研究报道。第8页，本讲稿共31页二、研究目标和主要研究内容二、研究目标和主要研究内容v研究目标研究目标v1.通过室内及大田试验，建立恰当的抑制黑胫病、青枯病益生菌剂筛选方法，筛选出通过室内及大田试验，建立恰当的抑制黑胫病、青枯病益生菌剂筛选方法，筛选出20-35抑制土壤青枯病、黑胫病病源菌在烟田内扩繁的益生细菌、芽孢杆菌。抑制土壤青枯病、黑胫病病源菌在烟田内

6、扩繁的益生细菌、芽孢杆菌。v2.构建抑制构建抑制青枯病、黑胫病病源菌数量的益生菌库，实现对根茎病害的多元化控青枯病、黑胫病病源菌数量的益生菌库，实现对根茎病害的多元化控制。制。v3.研究益生菌剂的生产、保存、使用的关键技术，对连作烟田的失衡微生物系进行原位修复；研究益生菌剂的生产、保存、使用的关键技术，对连作烟田的失衡微生物系进行原位修复；v4.构建构建青枯病和黑胫病的模式研究系统，实现对根茎病害的可持续控制。青枯病和黑胫病的模式研究系统，实现对根茎病害的可持续控制。第9页，本讲稿共31页主要研究内容主要研究内容v1 烟草根际、叶际优势微生物菌库的建立。以桂阳代表性的植烟土壤为对象，可培养方法

7、在烟草根际、叶际优势微生物菌库的建立。以桂阳代表性的植烟土壤为对象，可培养方法在实验室中对优势微生物进行分离纯化，构建一个丰富的根际优势微生物菌库群，其目的是为实验室中对优势微生物进行分离纯化，构建一个丰富的根际优势微生物菌库群，其目的是为构建菌库提供优质的菌种资源。构建菌库提供优质的菌种资源。v2.实验室模拟并研究不同微生物在灭菌土壤中的定植能力，筛选出模拟大田情况下，在可实验室模拟并研究不同微生物在灭菌土壤中的定植能力，筛选出模拟大田情况下，在可变环境中定植能力均较好的微生物，从而构建益生菌库。变环境中定植能力均较好的微生物，从而构建益生菌库。v3.研究菌剂种类和用量对不同病害发病情况降低

8、程度，确定较为有效的田间菌剂研究菌剂种类和用量对不同病害发病情况降低程度，确定较为有效的田间菌剂使用浓度，使用条件，与栽培技术的配套情况，评估菌剂的适应能力，为菌剂使使用浓度，使用条件，与栽培技术的配套情况，评估菌剂的适应能力，为菌剂使用提供理论依据。用提供理论依据。第10页，本讲稿共31页v4.益生菌剂对土壤微生态的影响及抗病机理研究益生菌剂对土壤微生态的影响及抗病机理研究 （1）菌剂对土壤中有效）菌剂对土壤中有效N、P、K含量变化影响研究含量变化影响研究 （2）菌剂对土壤微生物群落结构影响研究）菌剂对土壤微生物群落结构影响研究v5.确定菌株的生产参数确定菌株的生产参数 研究菌剂规模化生产关

9、键技术和技术参数研究菌剂规模化生产关键技术和技术参数:以工业化生产为前提，研究不同以工业化生产为前提，研究不同发酵工艺菌剂中活菌收获率，降低生产成本，确定生产环节的关键技术参数，发酵工艺菌剂中活菌收获率，降低生产成本，确定生产环节的关键技术参数，进行中试生产研究，并对产品不同保存情况下菌剂活力进行研究，确定关键进行中试生产研究，并对产品不同保存情况下菌剂活力进行研究，确定关键技术，为菌株产业化生产销售提供技术储备。技术，为菌株产业化生产销售提供技术储备。第11页，本讲稿共31页三、技术关键与创新点三、技术关键与创新点v1、技术关键、技术关键v（1）建立具有桂阳烟区土壤代表性的能够在烟草根际、叶

10、际定植且具有降低病原微生物）建立具有桂阳烟区土壤代表性的能够在烟草根际、叶际定植且具有降低病原微生物侵染能力的微生物菌库，并从中筛选出具有田间使用效果的菌株。侵染能力的微生物菌库，并从中筛选出具有田间使用效果的菌株。v（2）大田实验中该菌株能够在烟草根际、叶际与病原菌的生态位竞争中占有）大田实验中该菌株能够在烟草根际、叶际与病原菌的生态位竞争中占有优势，可以在大田中繁殖、持久性生存，稳定，具有可持续性。优势，可以在大田中繁殖、持久性生存，稳定，具有可持续性。v（3）确定菌剂的生产培养关键技术，菌剂保存条件，如是固态菌剂，确定填充剂成）确定菌剂的生产培养关键技术，菌剂保存条件，如是固态菌剂，确定

11、填充剂成分，掌握不同环境条件下菌剂保存时间与菌剂活菌数的关系。分，掌握不同环境条件下菌剂保存时间与菌剂活菌数的关系。第12页，本讲稿共31页v2、创新点、创新点v 本项目从病原菌、寄主植物、发病土壤三要素出发，直接利用抗生素标本项目从病原菌、寄主植物、发病土壤三要素出发，直接利用抗生素标记记青枯病原菌青枯病原菌、益生拮抗菌，基于生态位理论研究在、益生拮抗菌，基于生态位理论研究在土壤土壤中病原菌、益生菌群中病原菌、益生菌群的变化，及植株感病情况情况，的变化，及植株感病情况情况，构建益生菌库构建益生菌库，最终实现对烟草病害的生物多，最终实现对烟草病害的生物多元化控制方法；元化控制方法；第13页，本

12、讲稿共31页四、研究方法与技术路线四、研究方法与技术路线v1、主要的试验研究方法、主要的试验研究方法 （1）采集桂阳烟区烟草不同生长时期根际土壤、叶际样品，调查烟草根际）采集桂阳烟区烟草不同生长时期根际土壤、叶际样品，调查烟草根际微生物群落结构，并分离纯化烟草优势细菌。以桂阳烟区种植的烟草植株为微生物群落结构，并分离纯化烟草优势细菌。以桂阳烟区种植的烟草植株为研究对象，不同生长阶段，取烟草根际土壤、叶片，采用土壤溶液培养基、研究对象，不同生长阶段，取烟草根际土壤、叶片，采用土壤溶液培养基、营养肉汤培养基、营养肉汤培养基、PDA培养基培养等方法，结合分子克隆技术研究烟草根际、培养基培养等方法，结

13、合分子克隆技术研究烟草根际、叶际微生物多样性，分离代表性优势微生物。叶际微生物多样性，分离代表性优势微生物。第14页，本讲稿共31页v（2）实验室烟草根际、叶际益生微生物菌库的建立。）实验室烟草根际、叶际益生微生物菌库的建立。土壤优势细菌分别接种桂阳烟区代表性灭菌土壤，设置不同土壤温度、湿度、土壤优势细菌分别接种桂阳烟区代表性灭菌土壤，设置不同土壤温度、湿度、营养类型，病害接种量等变化，筛选对病害微生物生长繁殖抑制且不同情况下均营养类型，病害接种量等变化，筛选对病害微生物生长繁殖抑制且不同情况下均表现较强定植能力的微生物，采用分子鉴定方法鉴定菌种后构建菌库。表现较强定植能力的微生物，采用分子鉴

14、定方法鉴定菌种后构建菌库。第15页，本讲稿共31页v（3）盆栽试验选择优良菌株）盆栽试验选择优良菌株 在初步筛选的基础上，缩小筛选范围，并对筛选菌株进行抗生素选择性标记（选择与出在初步筛选的基础上，缩小筛选范围，并对筛选菌株进行抗生素选择性标记（选择与出发菌株生长型一致的菌株），消毒烟苗栽培至桂阳烟区代表性灭菌土壤，抗生素标记菌株发菌株生长型一致的菌株），消毒烟苗栽培至桂阳烟区代表性灭菌土壤，抗生素标记菌株灌根或喷洒至叶际后，接种病原微生物（青枯、黑胫等病菌），设置温、湿度梯度、菌剂灌根或喷洒至叶际后，接种病原微生物（青枯、黑胫等病菌），设置温、湿度梯度、菌剂使用浓度等环境变量，研究烟苗病情指

15、数，表现优良的作为菌剂备选。使用浓度等环境变量，研究烟苗病情指数，表现优良的作为菌剂备选。第16页，本讲稿共31页v（4）大田试验选择菌剂配方）大田试验选择菌剂配方 根据实验室盆栽结果，多点选择合适的烟田，跟踪菌剂在烟草生长期内在根际、叶际的根据实验室盆栽结果，多点选择合适的烟田，跟踪菌剂在烟草生长期内在根际、叶际的定植规律，研究对烟草品质的影响。实验结果表现较好的菌剂作为生产备选。定植规律，研究对烟草品质的影响。实验结果表现较好的菌剂作为生产备选。第17页，本讲稿共31页v（5）确定菌种生产关键技术，开展中试研究，确定产品剂型、存放条件。）确定菌种生产关键技术，开展中试研究，确定产品剂型、存

16、放条件。与企业合作，研究菌剂发酵生产关键技术和技术参数，降低成本，以工业化与企业合作，研究菌剂发酵生产关键技术和技术参数，降低成本，以工业化生产为前提，研究所选用基质配方的规模化生产关键技术，并确定生产各环节的生产为前提，研究所选用基质配方的规模化生产关键技术，并确定生产各环节的相应技术参数，为功能生物有机肥的研发提供支撑。研究液态、固态菌剂的保存相应技术参数，为功能生物有机肥的研发提供支撑。研究液态、固态菌剂的保存方法及相应保存时间，活菌或数量变化趋势，研究不同保存环境条件（光、温度、方法及相应保存时间，活菌或数量变化趋势，研究不同保存环境条件（光、温度、pH、含水量等）对菌剂活力影响，优化

17、得出适宜的生产、保存及运输条件。、含水量等）对菌剂活力影响，优化得出适宜的生产、保存及运输条件。第18页，本讲稿共31页v（6）研究菌剂在土壤中迁移、繁殖规律，对土壤微生态的影响。）研究菌剂在土壤中迁移、繁殖规律，对土壤微生态的影响。抗生素标记菌剂分别对田间烟苗采用灌根等接种技术，研究在烟草根际、抗生素标记菌剂分别对田间烟苗采用灌根等接种技术，研究在烟草根际、叶际、维管束定植规律，叶际、维管束定植规律，PCR-DGGE、克隆文库技术、克隆文库技术、T-RFLP、Biolog等等技术研究菌剂对土壤微生物生态影响，阐明菌剂的施用对烟草土传病害病原菌的技术研究菌剂对土壤微生物生态影响，阐明菌剂的施用

18、对烟草土传病害病原菌的拮抗作用及抑制病原菌生长的机理。拮抗作用及抑制病原菌生长的机理。第19页，本讲稿共31页2、技术路线、技术路线第20页，本讲稿共31页五、预期达到的目标五、预期达到的目标v1、成果形式、成果形式v（1）构建适应桂阳烟区特点的益生微生物菌库）构建适应桂阳烟区特点的益生微生物菌库1个，菌库容量高于个，菌库容量高于20种微生物。种微生物。v（2）产品：田间证明有效，达到申请国家微生物肥料产品标准的微生物菌剂）产品：田间证明有效，达到申请国家微生物肥料产品标准的微生物菌剂产品产品1-2个，并已通过中试生产。个，并已通过中试生产。v（3）论文）论文 2-4篇。篇。v（4）专利）专利

19、 1-2项。项。v（5）施用项目研发的菌剂后，植烟土壤微生态改良、土传病害降低，发病指数比对）施用项目研发的菌剂后，植烟土壤微生态改良、土传病害降低，发病指数比对照烟田病情指数降低照烟田病情指数降低20%。第21页，本讲稿共31页v2、经济指标：、经济指标：预计项目结束后，每亩烟草施用菌剂预计项目结束后，每亩烟草施用菌剂10 公斤，按公斤，按3元元/公斤，每年推广公斤，每年推广20万万亩，控制生产成本不高于亩，控制生产成本不高于0.7元元/公斤，此项目公斤，此项目5年内新增产值就达年内新增产值就达 300万元之万元之多，本项目生产菌剂在防治烟草青枯病、黑胫病的同时，具有防治茄科作物多，本项目生

20、产菌剂在防治烟草青枯病、黑胫病的同时，具有防治茄科作物土传病害的潜力，通过在烟草栽培中的示范性应用，将会带来可观的经济效土传病害的潜力，通过在烟草栽培中的示范性应用，将会带来可观的经济效益。益。第22页，本讲稿共31页六、具体实施措施六、具体实施措施v 1、建立项目组，以项目的形式实施、建立项目组，以项目的形式实施 郴州市烟草科学研究所、河南工程学院资源与环境工程学院共同牵头，郴州市烟草郴州市烟草科学研究所、河南工程学院资源与环境工程学院共同牵头，郴州市烟草公司桂阳县分公司，三个单位根据各自特点具体组织实施。公司桂阳县分公司，三个单位根据各自特点具体组织实施。v 2、在河南工程学院和重庆市烟草

21、研究所建立菌种选育研究平台，进行菌株选育和分析、在河南工程学院和重庆市烟草研究所建立菌种选育研究平台，进行菌株选育和分析研究。研究。v 3、项目组将成立技术组，研发关键技术，引进成熟经验，制定祥尽的技、项目组将成立技术组，研发关键技术，引进成熟经验，制定祥尽的技术实施方案。术实施方案。v 4、研究、试验、示范、培训、具体实施相结合。、研究、试验、示范、培训、具体实施相结合。第23页，本讲稿共31页七、项目开展的条件及已经进行的部分工作七、项目开展的条件及已经进行的部分工作（一）项目开展的条件（一）项目开展的条件v1、市、县公司的大力支持，烟农的迫切需要。、市、县公司的大力支持，烟农的迫切需要。

22、v2、相关文献得成功报道、已有的工作基础可确保项目的可行性。、相关文献得成功报道、已有的工作基础可确保项目的可行性。v3、已经组建了具有丰富经验的、已经组建了具有丰富经验的7人工作团队，项目展开具有具有可靠的硬件人工作团队，项目展开具有具有可靠的硬件配备配备v4、已有相应的菌剂中试厂家。、已有相应的菌剂中试厂家。第24页，本讲稿共31页（二）已有的工作基础：（二）已有的工作基础：v1、项目申报单位湖南省烟草公司郴州市公司在从传统烟叶生产向现代烟草、项目申报单位湖南省烟草公司郴州市公司在从传统烟叶生产向现代烟草农业转变方面，做了许多有益的研究与探索，并取得良好成效，积累了丰富农业转变方面，做了许

23、多有益的研究与探索，并取得良好成效，积累了丰富的经验。的经验。v2、郴州市公司与河南工程学院在、郴州市公司与河南工程学院在2010就开展了针对桂阳县旱田烟草青枯病生物防治就开展了针对桂阳县旱田烟草青枯病生物防治的科研工作，连续两年从桂阳仁义石坡、桂阳樟市曹新桥曹溪、桂阳樟市山背、桂阳的科研工作，连续两年从桂阳仁义石坡、桂阳樟市曹新桥曹溪、桂阳樟市山背、桂阳仁义王泗烟草青枯病发病严重地区取样仁义王泗烟草青枯病发病严重地区取样70个，调查烟草青枯病发病株与未发病株、个，调查烟草青枯病发病株与未发病株、旱田与水田根际微生物群落种群均一度、种群丰富度，种群类别等指标，并进行旱田与水田根际微生物群落种群

24、均一度、种群丰富度，种群类别等指标，并进行跟踪、对比分析，两年中共分离出优势细菌跟踪、对比分析，两年中共分离出优势细菌60余株、芽孢杆菌余株、芽孢杆菌87株，分离出烟草株，分离出烟草青枯病病原菌青枯病病原菌5株。株。第25页，本讲稿共31页第26页，本讲稿共31页v项目组已从重庆市、湖北省恩施市烟田取样，分离出优势细菌、芽胞杆菌上签株。项目组已从重庆市、湖北省恩施市烟田取样，分离出优势细菌、芽胞杆菌上签株。v项目组已开展绿色木霉、哈茨木霉等菌株与病原菌拮抗的相关研究。项目组已开展绿色木霉、哈茨木霉等菌株与病原菌拮抗的相关研究。v已成功将分离出的烟草青枯病原菌进行利福霉素、青霉素等抗生素标记。已

25、成功将分离出的烟草青枯病原菌进行利福霉素、青霉素等抗生素标记。v实验室拮抗实验已经展开，并在盆栽比较实验中选取到相比对照切实降低青枯病数量实验室拮抗实验已经展开，并在盆栽比较实验中选取到相比对照切实降低青枯病数量的菌株三株。的菌株三株。v实验室已经开展抗生素标记菌株在不同环境下环境行为研究。实验室已经开展抗生素标记菌株在不同环境下环境行为研究。第27页，本讲稿共31页菌株平板涂布浓度生长情况Q33-6RIF 20 mg/mL 150 L+aRIF 20 mg/mL 50 L+Bos6-RIF 0.2 mg/mL 40 L+SCGRIF 0.02 mg/mL 20 L+B1-1RIF 0.02 mg/mL 20 L+第28页，本讲稿共31页对比发现为同一株菌对比发现为同一株菌第29页，本讲稿共31页对比发现为同一株菌对比发现为同一株菌第30页，本讲稿共31页第31页，本讲稿共31页