仪器分析毛细管电泳法优秀课件.ppt

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1、仪器分析毛细管电泳法第1 页，本讲稿共22 页第2 页，本讲稿共22 页 本章要求 了解电泳、淌度、电渗的概念 了解毛细管电泳仪的结构 了解六种毛细管电泳分离模式第3 页，本讲稿共22 页 毛 细 管 电 泳（capillary electrophoresis，CE）又 称高 效 毛 细 管 电 泳（HPCE），是 以 毛 细 管 为 分 离 通 道、以 高压直流电场为驱动力的液相分离技术。CE 实 际 上 包 含 电 泳、色 谱 及 其 交 叉 内 容，使 分 析 化 学 得 以 从微 升 水 平 进 入 纳 升 水 平，并 使 单 细 胞 分 析，乃 至 单 分 子 分 析 成 为 可能。

2、生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。第4 页，本讲稿共22 页5.1 基本概念和原理 在 电 解 质 溶 液 中，带 电 粒 子 在 直 流 电 场 的 作 用 下，以 不同 的 速 度 或 速 率 向 其 所 带 电 荷 相 反 电 场 方 向 迁 移 的 现 象。阴 离 子 向 正 极 方 向 迁 移，阳 离 子 向 负 极 方 向 迁 移，中 性 化合物不带电荷，不发生电泳运动。利 用 这 些 带 电 粒 子 在 电 场 中 迁 移 速 度 的 不 同 而 达 到 分 离 的技术称为电泳。1.电泳第5 页，本讲稿共22 页2.毛细管电泳：CE 以 高 压 电 场 为 驱 动

3、力，以 毛 细 管 为 分 离 通 道，利 用 被 分 析 离 子 在 电场 作 用 下 移 动 速 率 不 同 而 达 到 分 离 的 目 的，主 要 用 于 分 析 在 毛 细 管 缓冲溶液中离解为离子的物质。第6 页，本讲稿共22 页毛细管的内径比头发丝还细得多10-30 千伏电压第7 页，本讲稿共22 页3.淌度淌度：单位电场下的电泳速度。绝对淌度：在无限稀释溶液中（稀溶液数据外推）测得的淌度称为绝对淌度，0em电泳速率：待测物从进样端到检测窗口的迁移速度，vemem：cm2/(s V)；vem：cm/s；E：V/cm第8 页，本讲稿共22 页4.电渗毛 细 管 内 充 满 溶 液 p

4、H 3 时，管 内 Si-OH 电 离 SiO-基，毛 细 管 壁带 负 电，与 溶 质 界 面 上 形 成 双 电 层。在 双 电 层 的 扩 散 外 层 中，阳 离子向阴极移动，带动溶液形成轴向流动。第9 页，本讲稿共22 页在 毛 细 管 中 电 渗 速 度 可 比 电 泳 速 度 大 一 个 数 量 级，所 以 能 实现 样 品 组 分 同 向 泳 动。正 离 子 的 运 动 方 向 和 电 渗 流 一 致，最先 流 出；中 性 粒 子 的 电 泳 流 速 度 为“零”，其 迁 移 速 度 相 当于 电 渗 流 速 度；负 离 子 的 运 动 方 向 和 电 渗 流 方 向 相 反，但

5、 因 电 渗流 速 度 一 般 都 大 于 电 泳 速 度，在 中 性 粒 子 之 后 流 出，从 而 因 各 种 粒子迁移速度不同而实现分离。离子的出峰次序为：正离子 中性分子 负离子第10 页，本讲稿共22 页电渗流的作用：可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离。改 变 电 渗 流 的 大 小 和 方 向，可 改 变 分 离 效 率 和 选 择 性，也 是CE与HPLC 相比能优化分离的重要因素。电 渗 流 的 微 小 变 化 影 响 结 果 的 重 现 性，控 制 电 渗 流 恒 定 是CE 分析关键所在。电渗流在CE 中起到像HPLC 中的泵一样作用。第11 页，本讲稿共22 页铂电

6、极缓冲溶液高压电源毛细管5.2 毛细管电泳装置第12 页，本讲稿共22 页1.进样系统电动进样；压力进样；扩散进样。进样体积一般在纳升级。2.分离系统毛细管：熔融石英，长40100 cm，内径25100 m；恒温系统：控制柱温变化在0.1；高压电源：电流0300 A，电压030 kV(稳定性0.1%)3.检测系统4.数据处理系统紫外-可见检测器；激光诱导荧光检测器；电化学检测器。第13 页，本讲稿共22 页5.3 毛细管电泳分离模式6 种分离模式：毛细管区带电泳CZE 毛细管等速电泳CITP 毛细管等电聚焦CIEF 毛细管电色谱CEC 胶束电动毛细管色谱MECC 毛细管凝胶电泳CGE第14 页

7、，本讲稿共22 页1.毛细管区带电泳(CZE)用CZE时，整个系统用一种缓冲溶液(背景电解质)，根据各组分荷质比不同而分离。背景电解质仅起传导电流的作用。t 0 t 0第15 页，本讲稿共22 页2.毛细管等速电泳（CITP）使 用 两 种 电 解 质：一 种 为 迁 移 率 较 高 的 前 导 离 子L电 解 质，一 种 为迁 移 率 较 低 的 尾 随 离 子T电 解 质，被 分 离 组 分 夹 在L与T之 间，以 同一速度运动，由于迁移率不同而分离。第16 页，本讲稿共22 页3.毛细管等电聚焦(CIEF)基本操作步骤：进样、聚焦和迁移，用于生物大分子的分离。毛细管等电聚焦电泳的运行过程

8、(a)进样；(b)聚焦；(c)迁移第17 页，本讲稿共22 页4.毛细管电色谱(CEC)分为填充柱和开管柱两种方式，可分离离子和中性分子，且可分离手性分子。5.胶束电动毛细管色谱(MECC)两 相：流 动 的 水 相 和 起 固 定 相 作 用 的 胶 束 相(准 固 定 相)，被 测 组 分 由于在水相和胶束相之间分配系数的差异而分离。第18 页，本讲稿共22 页5.4 毛细管电泳特点及应用(1)高分辨率：理论塔板数高达数百万块至数千万块。(2)高灵敏度：可检测出低至10-20 mol 浓度的物质。(3)高分析速度：可3 min 内分离30 种阴离子；1.7 min 内分离19 种阳离子；4

9、 min 内分离10 种蛋白质。(4)试样用量少：仅需几nL(10-9 L)的试样。(5)仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升。(6)自动：CE 是目前自动化程度最高的分离方法。(7)通常使用水溶液，对人和环境无害。1.优点HPLC 中，纵 向 扩 散 和 传 质 阻 力 是 影 响 谱 峰 展 宽 的 重 要 因素，而CE 只有纵向扩散影响谱峰展宽，塔板数：D:组分扩散系数U：毛细管两端施加电压可 采 用2000060000V 的 高 压，分 离 速 度 和 分 离 度 有 明 显的改善，N 为(12)105，HPLC 的N 为5 1032 104。理论塔板数第19 页，本讲稿共22

10、 页(1)进样不够方便。(2)分析阴离子时，出峰时间较长。电渗会因样品组成而变化，影响分离重现性。(3)光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰。2.缺点毛细管电泳与高效液相色谱比较：操作简单，试样量少。分离效率高，成本低。迁移时间的重现性、进样的准确性和灵敏度比HPLC 差。第20 页，本讲稿共22 页3.应用毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床医学等领域也有较多应用，如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、PCR 产物分析、DNA 片段及序列分析等。可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验。除 分 离 生 物 大 分 子（肽、蛋 白、DNA、糖 等）外，还 可 用 于 小 分 子（氨 基 酸、药 物 等）及 离 子（无 机、有 机），甚 至 可 以 分 离 各 种 颗 粒（硅 胶 颗 粒 等）。从 无 机 离 子 到 整 个 细 胞，具 有“万 能”分 析 功能或潜力。第21 页，本讲稿共22 页 本章要求 了解电泳、淌度、电渗的概念 了解毛细管电泳仪的结构 了解六种毛细管电泳分离模式第22 页，本讲稿共22 页