实验三的酶切精品文稿.ppt

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1、实验三的酶切第1页，本讲稿共11页实验原理l 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。第2页，本讲稿共11页限制性内切酶酶分子 识别位点 切割位点 限制作用是否需用 ATP 类 三 亚 基 双 功能酶 二分非对称 至 少 在 识 别位 点 外 1000bpYes 类内 切 酶 与 甲基 化 酶 分 子不在一起4-6bp,大 多数 为 回 文 对称结构 在 识 别 位 点中 或 靠 近 识别 位 点 无 特异性No 类二 亚 基 双 功能酶 5-7 bp 非 对称在 识 别 位 点下 游 24-26bpYes限制性内切酶可分为

2、三类第3页，本讲稿共11页类限制性内切酶 类 酶 切 割 位 点 在 识 别 序 列 中，有 的 在 对 称 轴 处 切 割,产 生平 末 端 的DNA 片 段(如Sma:5-CCCGGG-3)；有 的 切 割 位点 在 对 称 轴 一 侧，产 生 带 有 单 链 突 出 末 端 的DNA 片 段 称 粘 性末端，如EcoR 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 第4页，本讲稿共11页实验材料和试剂实验材料：玉米基因组DNA实验试剂：l BamH I 酶及其酶切缓冲液：购买成品。l SalI 酶及其酶切缓冲液：购

3、买成品。l 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。第5页，本讲稿共11页实验仪器恒温水浴锅第6页，本讲稿共11页用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，37 水浴保温2-3h 电泳检测EP 管编号实验步骤反应体系 20L 酶液 DNA 15L BamH 1L Sal 1L 10BufferT 3L第7页，本讲稿共11页对质粒DNA酶切反应 限 制 性 内 切 酶 用 量 可 按 标 准 体 系1g DNA 加1 单 位 酶,消 化1-2h。但 要 完 全 酶 解则 必 须 增 加 酶 的 用 量，一 般 增 加2-3 倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。第8

4、页，本讲稿共11页电泳检测示例第9页，本讲稿共11页实验注意事项1.限 制 性 内 切 酶 用 量 可 按 标 准 体 系1g DNA 加1单 位 酶，消 化1-2h。但 要 完 全 酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3 倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。2.酶 切 时 所 加 的DNA 溶 液 体 积 不 能 太 大，否 则DNA 溶 液 中 其 他 成 分 会 干 扰 酶 反应。3.许 多 实 验 制 备 的DNA 不 易 于 降 解，需 适 当 增 加 酶 的 使 用 量。反 应 液 中 加入 过 量 的 酶 是 不 合 适 的，除 考 虑 成 本 外，酶 液 中 的 微 量 杂 质 可 能 干 扰随后的反应。4.市 场 销 售 的 酶 一 般 浓 度 很 大，为 节 约 起 见，使 用 时 可 事 先 用 酶 反 应 缓 冲 液（1）进 行 稀 释。另 外，酶 通 常 保 存 在50%的 甘 油 中，实 验 中，应 将反应液中甘油浓度控制在1/10 之下，否则酶活性将受影响。第10页，本讲稿共11页思考题 如 果 一 个DNA 酶 解 液 在 电 泳 后 发 现DNA 未被 酶 切 或 者 酶 切 不 完 全,你 认 为 可 能 是 什 么 原 因？第11页，本讲稿共11页