医学专题—上海儿童医院23168.ppt

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1、串联质谱技术(jsh)新生儿遗传代谢病筛查上海市儿童医院田国力(gul)第一页，共四十七页。遗传(ychun)代谢病n 遗传性代谢病（Inborn Errors of Metabolism,IEM）是由于基因改变导致某些酶或蛋白质功能发生质/量的改变，引起某些代谢途径(tjng)上的生化物质发生改变引起一系列疾病。n 大多数为单基因遗传病n 遗传方式以常染色体隐性遗传或X连锁隐性遗传为主第二页，共四十七页。遗传(ychun)代谢病发病机制异常代谢途径代谢物（A1）代谢物(C1)代谢物(B1)代谢物（A2）代谢物(C2)代谢物(B2)代谢物(A)代谢物(B)辅酶（C）正常代谢途径酶第三页，共四十

2、七页。疾病(jbng)特点n 目前已发现500余种疾病n 主要类型有氨基酸代谢障碍、有机酸血症、脂肪酸代谢障碍、核酸代谢异常症、金属代谢障碍、线粒体病n 80%属常染色体隐性遗传n 单病发生率低，群体患病率高n 单基因缺陷所致代谢通路阻,大多为单基因遗传病，少数为线粒体基因遗传病n 表现非特异性，有赖遗传学或生化方法确诊，代谢物、酶学和分子检测n 常规试验检测：缺乏特异(ty)标志物n 儿科、血液科、神经科、骨科等不同诊室就诊n 早期症状多无特异性，累及部位和病情轻重差异很大，极易造成误诊n 新生儿期、幼儿或儿童期发病,某些可至成人期开始发病。第四页，共四十七页。临床(ln chun)特征n

3、多在新生儿期、幼儿或儿童期发病。某些可至成人期开始发病。n 新生儿期发病：呕吐、喂奶困难、反应力低下、呼吸暂停、急促等n 儿童期发病：可表现为全身多器官受累n 以神经肌肉系统(xtng)、呼吸系统(xtng)、消化系统(xtng)等症状为主n 乏力、智力发育迟缓、肌张力增高或降低、癫痫、黄疸、肝脾肿大、呼吸困难n 代谢性酸中毒、容貌异常、毛发皮肤色素改变、特殊体味n 饮食、应激反应、体能消耗等为疾病急性发作诱因。第五页，共四十七页。遗传(ychun)代谢病诊断困难n 临床症状和体征：缺乏特异性n 常规检测：缺乏特异标志物n 特殊试验检测n 氨基酸分析：氨基酸自动分析仪，高效液相色谱n 酰基肉碱

4、分析n 串联质谱技术n 气相质谱技术n 酶学分析n 基因诊断n 组织活检、成纤维细胞组织培养、脑脊液培养、其他(qt)神经病学检查第六页，共四十七页。PKU历史(lsh)n 体内高Phe引起(ynq)患儿智力低下n 1930提出低苯丙氨酸饮食治疗n 1950应用饮食治疗n 仅对PKU同胞有益n 大多患儿出现不可逆症状后才确诊n 1963年美国新生儿PKU筛查Pediatrics,105:89,2000.第七页，共四十七页。重视遗传代谢(dixi)病筛查与诊断n 疾病谱的改变(gibin)n 感染性疾病、重度营养不良、肿瘤、先天畸形、遗传代谢性疾病n 诊断技术的进步n 生化检测、基因芯片、全基因

5、组测序等n 治疗方法的提高n 替代治疗、系谱分析、遗传咨询、器官移植、基因治疗n 国内外对出生缺陷的重视第八页，共四十七页。新生儿遗传(ychun)代谢病筛查n 对新生儿遗传代谢缺陷、先天性内分泌异常以及某些严重的遗传性疾病进行筛查的总称n 患病新生儿在临床症状出现前能给予治疗，防止或减轻体格和智力发育障碍，避免痴呆或死亡的发生n 是当今国际上早期(zoq)发现遗传代谢病患儿的有效措施第九页，共四十七页。n 是集筛查、早期诊断、及时治疗、预防再发等措施为一体n 减少出生缺陷，提高人口素质n 是当今国际上早期发现遗传(ychun)代谢病患儿的有效措施n 预防效果显著，成本效益最好 新生儿遗传(y

6、chun)代谢病筛查第十页，共四十七页。新生儿遗传(ychun)代谢病筛查技术n 细菌抑制法:BIAn 荧光法：FIA,EFIAn 免疫法：ELISA,DELFIAn 串联质谱仪：一次检测，多种疾病。检测氨基酸代谢异常，脂肪酸代谢异常和有机酸代谢异常。n Microarray platform：分子基因的研究，将DNA点在玻璃芯片上，然后与荧光标记的诊断(zhndun)探针反应，检测响应荧光信号n 数字微流体(Digital Microfluidics):用于溶酶体贮积病的筛查第十一页，共四十七页。串联(chunlin)质谱筛查的优势一种疾病一种测试(csh)多种疾病多种测试新生儿筛查方案的扩

7、展 将非常昂贵一份血样同时检测超过30多种物质，近40种 代谢疾病。高灵敏性、高选择性 高灵敏性、高选择性 快速检测，达到早诊断、早治疗的效果 快速检测，达到早诊断、早治疗的效果(xiogu)(xiogu)降低了筛查诊断的假阳性和假阴性 降低了筛查诊断的假阳性和假阴性VS.传统筛查 串联质谱MS/MS是一种在同一样本中同时测量多种待测物的方法在同个测试平台上检测多个疾病就变得可能第十二页，共四十七页。质谱仪组成(z chn)n MS仪主要由离子源、真空接口、质量分析器、检测器等四部分(b fen)组成n 样品中被测物质在离子源内电离形成各种质荷比不同带电离子（离子化），经真空接口进入由电场或磁

8、场形成的质量分析器，利用电磁学原理，根据m/z不同将带电离子分开，最后到达检测器被检测，得到样品的质谱图及离子强度第十三页，共四十七页。质谱的基本原理n 将分析物离子化为各种(zhn)质荷比(m/z)不同的带电粒子n 应用电磁学原理,带电粒子按m/z在空间或时间上产生分离排列成的图谱n 根据它们所形成的谱图、离子峰强度对分析物进行鉴定n 若同时加入被检测物质对应的内标或外标，既可以进行定量检测。第十四页，共四十七页。MS/MS的基本原理n 两个MS经碰撞室(CID)串联而成n 最常应用于NBS的是三重四极杆，由两个MS经碰撞室(CID)串联而成n 一级MS是功能类似于气相和液相色谱的分离器，只

9、允许选择的离子(母离子)通过n 母离子进人CID产生碎片(子离子)n 子离子经二级MS选择最终进入(jnr)检测器n 通过不同扫描的方式记录即可得到串联质谱图谱，实现对待测物的定性n 通过样品中加入定量同位素内标，实现待测物定量检测第十五页，共四十七页。串联(chunlin)质谱仪一级质谱 一级质谱碰撞室 碰撞室二级质谱 二级质谱扫描特定范围离子或允许特定离子进入碰撞器分离器分子离子碰撞解离形成子离子扫描一定范围子离子选择特定子离子进入检测器分析仪第十六页，共四十七页。串联(chunlin)质谱技术设备串联四级杆质谱仪进样器高效液相泵仪器控制及数据处理系统第十七页，共四十七页。串联(chunl

10、in)质谱新生儿筛查的基本原理n 遗传代谢病：由于遗传因素体内正常代谢途径受阻n 氨基酸代谢病患者血中氨基酸水平异常n 有机酸血症及脂肪酸代谢障碍病患者血中游离肉碱或不同种类的酰基肉碱水平异常n 利用串联质谱仪通过检测(jin c)检测(jin c)滤纸干血片中氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平n 通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来，综合判断多种遗传代谢病n 一个测试平台上同时检测多个疾病第十八页，共四十七页。串联(chunlin)质谱新生儿筛查的步骤n 采血后滴于专用采血滤纸片，晾干，制成滤纸干血片n 采用串联质谱技术，通过同位素内标法(IS)n 分析物和对应内标的响应比等

11、比于分析物和对应内标的浓度比n 一次性定量检测(jin c)新生儿的滤纸干血片样品中的数十种氨基酸、酰基肉碱浓度n 通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来，综合判断30余种遗传代谢病第十九页，共四十七页。衍生(yn shn)化氨基酸扫描质谱图氨基酸 m/z 同位素 m/zAla 146.0 Ala-d4 150.3Leu 188.1 Leu-d3 191.2Phe 222.2 Phe-d5 227.2Tyr 238.2 Tyr-13C6 246.2第二十页，共四十七页。串联质谱检测(jin c)指标名称 缩写丙氨酸 AlanineAla精氨酸 ArginineArg瓜氨酸 Ci

12、trullineCit鸟氨酸 OrnithineOrn苯丙氨酸 PhenylalaninePhe酪氨酸 TyrosineTyr甘氨酸 GlycineGly亮氨酸 LeucineLeu甲硫氨酸 MethionineMet缬氨酸 ValineVal脯氨酸 ProlinePro第二十一页，共四十七页。串联(chunlin)质谱检测指标名称 缩写 名称 缩写 名称 缩写游离肉碱C C0 己酰肉碱 C6 肉豆蔻二烯酰肉碱 C14:2乙酰肉碱 C2 己二酰肉碱 C6DC 3-羟基肉豆蔻酰肉碱 C14-OH丙酰肉碱 C3 辛酰肉碱 C8 棕榈酰肉碱 C16丙二酰肉碱 C3DC 辛烯酰肉碱 C8:1 棕榈烯酰

13、肉碱 C16:1丁酰肉碱 C4 辛二烯酰肉碱 C8:2 3-羟基棕榈烯酰肉碱 C16:1-OH3-羟基丁酰肉碱 C4-OH 葵酰肉碱 C10 3-羟基棕榈酰肉碱 C16-OH异戊酰肉碱 C5 葵烯酰肉碱 C10:1 十八碳酰肉碱 C18异戊烯酰肉碱 C5:1 葵二烯酰肉碱 C10:2 十八碳烯酰肉碱 C18:13-羟基异戊酰肉碱 C5-OH 月桂酰肉碱 C12 3-羟基十八碳烯酰肉碱 C18:1-OH戊二酰肉碱 C5DC 肉豆蔻酰肉碱 C14 3-羟基十八碳酰肉碱 C18-OH肉豆蔻烯酰肉碱 C14:1第二十二页，共四十七页。高苯丙氨酸血症第二十三页，共四十七页。中链酰基辅酶(f mi)A脱氢

14、酶缺乏症第二十四页，共四十七页。游离(yul)肉碱及酰基肉碱n 有机酸血症相关(xinggun)：n C0、C2、C3、3DC、C4、C4-OH、C5、C5-OH、C5DC、C5:1n 脂肪酸代谢病有关：n C0、C4、C5DC、C6、C8、C10、C12、C14、C14:1、C16、C16-OH、C18、C18-OH第二十五页，共四十七页。标本(biobn)前处理方式第二十六页，共四十七页。衍生(yn shn)化标本前处理方法n 样品处理过程中加入盐酸正丁醇，引入丁基n 改变分子结构（除去羧酸功能团），消除潜在负离子，提高正离子模式下的离子化效率n 酯化作用可以减少潜在的溶剂或其他干扰物质n

15、 降低分析物极性更好的去溶剂化，样品更加容易进入仪器(yq)真空环境n 酯化作用可以引入测量酰基肉碱和氨基酸方式（游离酸形式）无法检测到的干扰物第二十七页，共四十七页。非衍生(yn shn)化标本前处理方法n 无需使用盐酸正丁醇，使用甲醇萃取后可直接进样n 整个样本预处理步骤仅需半小时，n 琥珀酰丙酮的测试无需单独处理n 具有(jyu)扩展性：类固醇疾病、维生素缺乏等多种临床疾病n 二羧酸酰基肉碱或氨基酸可能有两个负电荷位置，影响正离子效率（分子的pKa值、流动相的pH值）第二十八页，共四十七页。非衍生(yn shn)化法为应用趋势n 操作繁琐(3h)n 过程难以标准化n 对环境和人员有害n

16、需要氮吹设备衍生化法非衍生化法n 操作步骤简单(40min)n 易于标准化n 不涉及酸腐、有毒物n 扩展性好发达国家的遗传(ychun)代谢病筛查已从传统衍生化法逐步转为非衍生化法（近5年美国12.20%46.84%）第二十九页，共四十七页。标本前处理(chl)方法比较衍生(yn shn)化n 实验步骤长n 实验过程2.5小时左右n 需要氮吹设备n 丁醇盐酸具有强烈腐蚀性n 对实验室环境(hunjng)要求高n 实验人员需防护n 试剂相对便宜非衍生化n 简化实验过程n 实验过程1小时n 无需氮吹及衍生化过程n 环境好n 人员无需特殊防护n 试剂价格相对贵第三十页，共四十七页。美国(mi u)C

17、DC统计年度 N 荧光法比例%MS（N）MS%非衍/衍生%衍生化 非衍生化2009 2181 351 16.1 756 384 52.2 50.82010 2141 351 16.3 995 355 63.1 35.72011 2502 368 14.7 1116 622 69.5 55.72012 2483 354 14.2 1086 667 70.6 61.42013 2630 510 19.4%1065 804 71.1 75.5PhePhe测定测定(cdng)(cdng)标本数为例标本数为例第三十一页，共四十七页。检测(jin c)指标选择第三十二页，共四十七页。n 不同酶缺陷引起不同

18、代谢途径差异n 引起特定指标升高或降低n 氨基酸代谢病可有一种或数种氨基酸水平异常n 有机酸血症或脂肪酸氧化(ynghu)代谢病可有一种或数种酰基肉碱水平异常n 一种指标异常可提示一种或几种代谢病n 一种疾病也可对应多种指标异常n 计算不同氨基酸或酰基肉碱之间的比值，有助于不同疾病之间的鉴别，降低假阳性率或假阴性率。第三十三页，共四十七页。一个指标对应一种(y zhn)疾病疾病 指标丙二酸血症C3DC戊二酸血症I型 C5DC精氨酸血症 ARG酪氨酸血症 TYR第三十四页，共四十七页。多个(du)指标对应一种疾病：主要指标疾病 指标苯酮尿症 PHE，TYR，PHE/TYR枫糖尿症 LEU/ILE

19、，VAL戊二酸血症第II型 C4，C5，C8，C8:1，C10，C12，C14，C16极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 C14:1，C14,C16，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 C6，C8,C10，C8/C10第三十五页，共四十七页。一个指标(zhbio)对应多种疾病疾病 指标3-甲基巴豆酰辅酶羧化酶缺乏症 C5OH C5OH 3-羟基-3-甲基戊二酸尿症 C5OH C6DC B-酮硫解酶缺乏症 C5:1 C5OH 3-甲基戊烯二酸血症 C5OH多种羧化酶缺乏症 C5OH C3第三十六页，共四十七页。一个(y)指标对应多种疾病疾病 指标丙酸血症、甲基丙二酸血症 C3瓜氨酸血症、NICCD CitOT

20、C，CPS，NAGS Cit第三十七页，共四十七页。疾病(jbng)与临床症状疾病 临床症状氨基酸代谢障碍 PKU、MSUD、尿素循环障碍智力低下、发育迟缓、高血氨有机酸代谢障碍 MMA、PA、IVA 代谢性酸中毒、嗜睡、呼吸窘迫、周期性代谢危象脂肪酸代谢障碍 MCAD、VLCAD、LCHAD低血糖、昏迷、猝死、心肌病第三十八页，共四十七页。第三十九页，共四十七页。疾病（缺陷酶）常见缩写 主要标志 相关比例异戊酸血症（异戊酰基辅酶A脱氢酶缺乏）IV A C5 C5/C0,C5/C2,C5/C3戊二酸血症I型（戊二酰辅酶A脱氢酶缺乏）GA I C5-DC C5-DC/C5-OH,C5-DC/C8

21、,C5-DC/C163-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症HMG C5-OH,C6-DC C5-OH/C8多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏MCD C5-OH C5-OH/C8甲基丙二酸血症(甲基丙二酰-CoA 变位酶)MUT C3 C3/C2,C3/C163-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶，亚组）3MCC C5-OH C5-OH/C8,C5-OH/C0甲基丙二酸血症（腺苷钴胺素合成）CblA，B C3 C3/C2,C3/C16丙酸血症(丙酰-CoA羧化酶)PROP C3 C3/C2,C3/C16酮基硫解酶缺乏症BKT C5:1,C5-OH C5-OH/C8甲基丙二酸血症合并

22、同型半胱氨酸血症(MTHF 甲基转移酶）Cbl C,D C3 C3/C2,C3/C16,C3/Met甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症(MMADHC蛋白)Cbl C,DC3C3/C2,C3/C16,C3/Met 丙二酸血症MAL C3-DC C3-DC/C10异丁酰甘氨酸血症(异丁酰-CoA 脱氢酶)IBG C4 C4/C2,C4/C3,C4/C82-甲基3-羟基丁酰辅酶A水解酶缺乏症2M3HBA C5-OH C5-OH/C82-甲基丁酰甘氨酸血症(2-甲基丁酰-CoA 脱氢酶)2MBG C5 C5/C0,C5/C2,C5/C33-甲基戊二酰血症(3-甲基戊二酰-CoA 水合酶)3MGA C5

23、-OH C5-OH/C8第四十页，共四十七页。第四十一页，共四十七页。新生儿筛查的首要代谢(dixi)疾病氨基酸类代谢(dixi)病6 苯丙酮尿症 枫糖浆尿症 同型胱氨酸尿症 瓜氨酸血症 精氨酸琥珀酸血症 酪氨酸血症型脂肪酸类代谢(dixi)病5n中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症n极长链乙酰辅酶A脱氢酶缺乏症n长链-3-羟酰辅酶A脱氢酶缺乏症n三功能蛋白缺乏症n肉碱摄取缺陷症有机酸类代谢病9n异戊酸血症n戊二酸尿症型n3-羟基-3-甲基戊二酸尿症n多发性羧酶缺乏症 n甲基丙二酸血症 n甲基丙二酸血症(cbIA和cbIB)n三甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症n丙酸血症n酮硫解酶缺乏症第四十二页，共四十七页

24、。结果(ji gu)解释n 静脉全肠外营养：氨基酸增多或支链氨基酸增高，氨基酸比率（苯丙氨酸/酪氨酸，甲硫氨酸/苯丙氨酸，亮氨酸/丙氨酸）有助于区分真假阳性n 药物：抗生素（氨苄青霉素和头孢噻肟、幼儿和母亲）酰基肉碱升高。C5 C14:1,C16:1OHn 特殊饮食：含中链甘油三酯奶粉，低体重婴儿使用多，可能导致DBS中C6,C8,C10,和 C12浓度升高n 产妇疾病：幼儿样本的异常(ychng)辨识未发病的产妇有代谢疾病。最常见的产妇疾病有CUD，3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（3MCC），3MGA，戊二酸血症型（GAI）和维生素B12缺乏症第四十三页，共四十七页。结果(ji gu)解释

25、n 饥饿或肥胖：支链氨基酸升高n 高蛋白饮食：总氨基酸、蛋氨酸、酪氨酸升高n 肾脏疾病：苯丙氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、支链氨基酸等n 临终(ln zhn)：多种氨基酸升高，丙氨酸、谷氨酸显著升高n 肝功能异常：长链脂肪酸升高n 激烈运动：游离肉碱降低n 窒息，昏迷，组织缺氧：长链脂肪酸升高第四十四页，共四十七页。串联(chunlin)质谱技术发展方向n 枫糖尿症：别异亮氨酸、异亮氨酸和羟脯氨酸分离 n 酪氨酸血症I型：琥珀酰丙酮n 甲基丙二酸血症：甲基柠檬酸，3-羟基丙酸，甲基丙二酸n 先天性肾上腺增生症-类固醇分析(fnx)：皮质醇、雄烯二酮、17-羟基黄体酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇n 溶酶体储存疾病：酶产品的功能分析第四十五页，共四十七页。谢 谢！第四十六页，共四十七页。内容(nirng)总结串联质谱技术新生儿遗传代谢病筛查。代谢物(A)。代谢物(B)。单基因缺陷所致代谢通路阻,大多(ddu)为单基因遗传病，少数为线粒体基因遗传病。新生儿期、幼儿或儿童期发病,某些可至成人期开始发病。高灵敏性、高选择性。降低了筛查诊断的假阳性和假阴性。MS/MS 是一种在同一样本中同时测量多种待测物的方法。MS/MS 的基本原理。通过样品中加入定量同位素内标，实现待测物定量检测。扫描一定范围子离子选择特定子离子进入检测器第四十七页，共四十七页。