发酵工程下游加工过程概论bdql.pptx

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1、第十二章 发酵工程下游加工过程简介一、发酵工程下游加工过程概论 1、发酵工程下游加工过程的特点 1）所需产物在培养液中浓度较低，且稳定性差2）普遍存在下游工程代价高，回收率较低等问题发酵液发酵液是复杂的多相系统是复杂的多相系统2、发酵工程下游加工过程的一般程序成品加工发酵液的预处理和过滤提取精制采用凝聚和絮凝技术加速固、液分离；如产物在细胞内，还要进行细胞破碎提取（初步纯化）目的是除去与目标产物性质差异大的杂质精制（高度纯化）是采用对产品有高度选择性的分离技术，除去与产物化学性质和物理性质相近的杂质最终获得质量合格的产品3、主要操作单元：絮凝离心过滤细胞破碎萃取沉淀层析结晶干燥二、发酵液预处理

2、和过滤 为什么要对发酵液进行预处理？预处理的目的是什么？发酵液的基本特性 产物浓度低 具有极性 黏度大 表面张力大 性质不稳定一）发酵液的预处理1、目的：发酵液中杂质多且成分复杂，其中对纯化影响最大的是高价无机离子(Ca 2+、Mg 2+、Fe 3+等)和杂蛋白等改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中；（一般为液相）能够除去部分杂质。2、高价无机离子的去除镁离子的去除：常用草酸 与钙离子生成草酸钙沉淀 草酸为弱酸，对发酵产物的破坏较小，草酸钙沉淀还能促进蛋白质凝固，有利于提高滤液的过滤速度；草酸的溶解度较小，需大用量时，可用草酸钠取代；草酸价格较

3、高，生产上一般需回收钙离子的去除：铁离子的去除：常用三聚磷酸钠 与镁离子形成可溶性络合物 Na5P3O10+Mg 2+=MgNa3P3O10+2Na+常用黄血盐 与铁离子形成普鲁氏蓝沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe 3+=Fe4Fe(CN)63+12K+3、可溶性杂蛋白的去除 杂蛋白的存在会降低离子交换树脂和大网格树脂的吸附量，如采用溶剂萃取，会发生乳化，影响两相分离。此外，在常规过滤和膜过滤时，还会使滤速下降，使膜受到污染。1）沉淀法 调等电点 因羧基的电离度比氨基大，所以大多数蛋白质的等电点都在酸性范围(pH4.0-5.5)但仅靠调等电点还不能使大部分蛋白质沉淀蛋白质是两性物质，在酸性溶液

4、中，能与一些阴离子物质如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐和过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu 2+、Zn 2+、Fe 3+、Pb 2+等 形成沉淀2）变性法 变性蛋白溶解度较小 最常用加热法 加热不仅能使蛋白变性，还可降低液体黏度，提高过滤速率；其他方法：大幅度调节pH，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂 变性法存在一定的局限 如加热法只适用于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，且需消耗大量酸碱，而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。3）吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而将其除去 如四环素生产中，采用黄血盐和硫

5、酸锌的协同作用生成亚铁氰化钾的胶状沉淀来吸附蛋白；在枯草芽孢杆菌发酵中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去 凝聚和絮凝都是发酵液预处理的重要方法，其处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。发酵液预处理的方法凝聚和絮凝 凝聚指在投加的化学物质（如水解的凝聚剂：铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。电解质的凝聚能力可用凝聚值表示，即使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L）。一般反离子的价

6、数越高，凝聚值越小，即凝聚能力越强。如 Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+絮凝指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用，工业上使用到的有聚丙烯酰胺类衍生物、聚合铝盐、海藻酸钠、壳聚糖等，目前最常用的是聚丙烯酰胺类衍生物。1）板框(plate and frame)压滤机板框过滤机结构图 1-尾板 2-滤框 3-滤板 4-主梁 5-头板 6-紧压装置二）发酵液过滤常用设备板框过滤机Plate shifter1500 x 1500 Filter Press Cloth washing1）板框(pla

7、te and frame)压滤机2）带式压滤机二）发酵液过滤常用设备 发酵后期要少加消泡剂和少进行补料，防止消泡剂和未用完的培养基增加过滤难度；菌体自溶前放罐可防止因菌体自溶释放出的代谢产物增加发酵液黏度影响发酵液过滤的因素1）菌体细胞体积 真菌菌丝体较粗大，发酵液不需特殊处理，易过滤；放线菌菌丝细而分支，交织成网格状，较难过滤，发酵液需经预处理，凝固蛋白质等胶体物质，提高过滤速度；细菌菌体更小，发酵液如不经絮凝等预处理，很难用常规过滤设备进行过滤操作。2）培养基组成黄豆饼粉、花生饼粉等会增加过滤难度3）放罐时机当发酵液中有不溶性多糖时，会使发酵液的黏度增大而影响过滤速度；可用酶将其转化成可溶

8、性单糖，提高滤速。提高过滤性能的方法1）加助滤剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，从而增加滤速；常用硅藻土、珍珠岩等；加入方法有两种：a)预先在滤布上铺上一层1-2mm厚的助滤剂；b)直接把助滤剂加入发酵液中。2）添加填充凝固剂如CaSO4、AlPO4等本身就是助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固3）酶解法（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离高度纯化成品加工预处理胞外产物（加热、调pH、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞内产物提

9、取精制产品的收得率和质量控制。细胞破碎 目的代谢产物并非都是分泌型的，许多是存在于细胞内的，特别是基因工程菌在细胞内形成的包含体是不分泌的，故需进行细胞破碎。大规模破碎细胞常用方法；利用高压使细胞悬液通过针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，造成细胞破碎。影响破碎的主要因素是压力、温度和循环次数1）高压匀浆法高压匀浆器排出阀2）高速球磨法高速球磨机1-物料进口 2-物料出口 3、4-冷却水进、出口 5、6-夹套冷却水进、出口由于圆盘的高速旋转，细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞得以破碎。3）超声波法 常用超声波频率15-25kHz；原理：由于超声波产生极为强烈

10、的冲击波压力，引起黏滞性旋涡在介质中的细胞上造成了剪切力，促使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎；超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时需冷却；通常杆菌比球菌易破，阴性菌比阳性菌易破4）酶解法 专一性强，条件温和；但费用较高 酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用大多数微生物都能产生一种可以水解自身细胞壁的酶；当改变一定的环境条件，可诱发这种酶的过量产生或激发其他自溶酶产生，而发生自溶现象。5）渗透压冲击法 将细胞先放入高渗透压的介质中，如高浓度的甘油或蔗糖液，在达到平衡后，介质突然被稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂；此法适用于细胞壁较脆弱的，

11、或者细胞壁预先用酶处理的，或细胞壁合成受到抑制的微生物；6）反复冻结-融化法 将细胞反复在低温下突然冷冻后在室温下融化，引起细胞破裂；低温冷冻一方面能使细胞膜的疏水键结构断裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶使细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。该法适用于细胞壁较脆弱的细胞细胞破碎方法二、提取（初步分离）（一）沉淀法（Precipitation）沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质由液相转变为固相析出的过程。方法简单、成本低、使用广泛，初步分离的常用手段。盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法非离子型聚合物沉淀法聚电解质沉淀法生成盐复合物沉淀法热变性及酸碱变性沉淀

12、法 中性盐的加入能破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质的溶解度降低而析出。1.盐析法(Salting out)破坏了蛋白质在水中存在的两个因素(水化层和电荷),从而使蛋白质沉淀。将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。盐溶(salting in)：许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比在纯水中的溶解度大大增加）；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓

13、度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。1）蛋白质浓度蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。2）离子强度和种类3）温度 温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；4）pH 由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pH作为盐析pH影响盐析的因素2.等电点沉淀法原理：利用两性电解质在电中性时溶解度最低优点：许多蛋白的等电点都在偏酸范围内，而许多无机酸的价格低廉；缺点：酸化时易引起蛋白失活 不少蛋白质与金属结合

14、后会发生等电点偏移，如胰岛素的等电点为5.3，在与Zn 2+结合形成胰岛素锌盐，其等电点升为6.2；故加入金属离子后选择等电点沉淀时，要注意调整pH。二、提取（初步分离）（二）结晶法（crystallization）物质从液态（液体或熔融体）或气态形成晶体的过程叫结晶。加入能使结晶溶质溶解度降低的物质，让结晶溶质形成过饱和液；例如卡那霉素不溶于乙醇，向卡那霉素脱色液中加入终浓度为60%-80%的乙醇，就结晶析出;在普鲁卡因青霉素结晶时，加入一定量的食盐，可使结晶更易析出结晶方法（过饱和溶液形成的方法）1）浓缩结晶 减压蒸发浓缩，达到过饱和2）冷却结晶 适用于溶解度随温度变化很大的物质；先加热使

15、其溶解，然后冷却结晶；3）化学反应结晶 加入反应剂或调pH，使生成更低可溶性物质；如在青霉素醋酸丁酯提取液中，加入乙醇-醋酸钾，因形成的青霉素钾盐难溶于醋酸丁酯而结晶析出。4）解析结晶（drowningout）三、精制（高度纯化）（一）离子交换法(Ion exchange)离子交换工作原理 根据物质的酸碱性、极性不同，在水溶液中所带阴阳离子不同，电荷不同的物质对层析柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变洗脱液的离子强度或pH，不同物质就能依次从层析柱中分离出来。在离子交换过程中，离子首先扩散到树脂表面，通过树脂扩散到交换位置，在交换位置进行离子交换。被交换的分子所带电荷越多，它与树脂的结合越紧密

16、，也就越不容易被其它离子所取代。被交换的离子扩散到树脂表面，洗脱液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。三、精制（高度纯化）（二）色谱分离法用微量注射器针头或微细管把样品点一小点在层析床的一端。要求层析床必须完全干燥，点样之后转入装有展层剂的玻璃槽中。当展层剂的前沿跑到滤纸全长的80-90时，将层析床取出。纸层析可以用相对迁移率（Rf）来表示一种物质的迁移：或者也可以用相对于一种已知迁移率的标准物的迁移（Rx）来表示：待测物移动的距离标准物移动的距离Rx=组分移动的距离溶剂移动的距离Rf=薄层扫描仪快速；可用腐蚀性试剂显色；易于制备少量样品。薄层层析十六元环大环内酯类抗生素的薄层色谱图1:乙酰螺

17、旋霉素;2:麦迪霉素;3:麦白霉素;4:吉他霉素;5:乙酰吉他霉素9、静夜四无邻，荒居旧业贫。5月-235月-23Friday,May 12,202310、雨中黄叶树，灯下白头人。08:27:0508:27:0508:275/12/2023 8:27:05 AM11、以我独沈久，愧君相见频。5月-2308:27:0508:27May-2312-May-2312、故人江海别，几度隔山川。08:27:0508:27:0508:27Friday,May 12,202313、乍见翻疑梦，相悲各问年。5月-235月-2308:27:0508:27:05May 12,202314、他乡生白发，旧国见青山。

18、12 五月 20238:27:05 上午08:27:055月-2315、比不了得就不比，得不到的就不要。五月 238:27 上午5月-2308:27May 12,202316、行动出成果，工作出财富。2023/5/12 8:27:0508:27:0512 May 202317、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。8:27:05 上午8:27 上午08:27:055月-239、没有失败，只有暂时停止成功！。5月-235月-23Friday,May 12,202310、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。08:27:0508:27:0508:275/

19、12/2023 8:27:05 AM11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。5月-2308:27:0508:27May-2312-May-2312、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。08:27:0508:27:0508:27Friday,May 12,202313、不知香积寺，数里入云峰。5月-235月-2308:27:0508:27:05May 12,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。12 五月 20238:27:05 上午08:27:055月-2315、楚塞三湘接，荆门九派通。五月 238:27 上午5月-2308:27May 12,20

20、2316、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2023/5/12 8:27:0508:27:0512 May 202317、空山新雨后，天气晚来秋。8:27:05 上午8:27 上午08:27:055月-239、杨柳散和风，青山澹吾虑。5月-235月-23Friday,May 12,202310、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。08:27:0508:27:0508:275/12/2023 8:27:05 AM11、越是没有本领的就越加自命不凡。5月-2308:27:0508:27May-2312-May-2312、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。08:27:0508:27:0508:27

21、Friday,May 12,202313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。5月-235月-2308:27:0508:27:05May 12,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。12 五月 20238:27:05 上午08:27:055月-2315、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。五月 238:27 上午5月-2308:27May 12,202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/5/12 8:27:0508:27:0512 May 202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。8:27:05 上午8:27 上午08:27:055月-23 MOMODA POWERPOINTLoremipsumdolorsitamet,consecteturadipiscingelit.Fusceidurnablandit,eleifendnullaac,fringillapurus.Nullaiaculistemporfelisutcursus.感 谢 您 的 下 载 观 看专家告诉