基因工程第八章优秀课件.ppt

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1、基因工程第八章第1 页，本讲稿共49 页一、粘性末端的连接DNA 连接酶把相互靠近的5 端磷酸与3-OH 连到一起。第一节 DNA 片段的体外连接1.两段DNA 的连接依靠粘性末端2.DNA 片断与载体的连接依靠粘性末端第2 页，本讲稿共49 页二、齐平末端（blunt end）的连接5 端与3 端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA 连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3-OH-PP-HO-5 3 第3 页，本讲稿共49 页1972 年，斯坦福大学的P.Labban 和P.

2、Kaiser 提出。（1）同聚加尾 法 2.人工加尾形成“粘性末端”DNA 末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3-OH 端加上脱氧核苷酸。原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。加尾碱基互补第4 页，本讲稿共49 页缺点：优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。第5 页，本讲稿共49 页用T4 DNA 连接酶连到平端DNA 上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接 linker用化学合成法合成的一段10-12bp 的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：linker 的作用第6

3、页，本讲稿共49 页缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:优点：第7 页，本讲稿共49 页（3）DNA 接头(adapter)连接法1978 年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用T4DNA 连接酶连到DNA 分子的两端，直接成为人工粘性末端。adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。adapter 的作用第8 页，本讲稿共49 页Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 B

4、amHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接第9 页，本讲稿共49 页接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA 片段的连接。优点：连上后就能用。缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5 端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4 多核苷酸激酶加上磷酸。）防止自我连接第10 页，本讲稿共49 页5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCT

5、AG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP 处理-OHHO-第11 页，本讲稿共49 页Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5GATCCCGG-HO-GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG5 5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口HO-OHCIP 处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。第12 页，本讲稿共49

6、 页三、PCR 产物的连接1.在引物的5 端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3 端1520bp 与模板互补；5 端610bp 是某个内切酶的识别序列。（5 端多余的35bp 属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。第13 页，本讲稿共49 页引物1GCAGAATTC 互补序列模板EcoRI 位点5-3 GCAGAATTC 互补序列5-3 3 模板GCAGAATTC 互补序列 PCR 产物5-3 3 复性延伸模板模板3 3 第14 页，本讲稿共49 页GCTAGCCGG 互补序列模板BamH I 位点-5 3-5 复性延伸模板模板3 3

7、GCTAGCCGG 互补序列-5 3-模板5 GCTAGCCGG PCR 产物 互补序列-5 3-引物2第15 页，本讲稿共49 页带酶切位点的PCR 产物GCAGAATTC PCR 产物5-3 GCTAGCCGG PCR 产物-5 3-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI 位点BamHI 位点AATTC PCR 产物 5-3 GCTAG PCR 产物-5 3-GCEcoRI BamHI两头各有一个粘性末端！第16 页，本讲稿共49 页2.与T 载体直接连接（1）PCR 产物两个3 端一般都有一个ATaq DNA 聚合酶的特性：在DNA 双链的3 端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）

8、。（2）T 载体的两个3 端人为地各加一个T利用Taq DNA 聚合酶，当原料中只有dTTP 时，被迫在平端载体上添加T！第17 页，本讲稿共49 页AAdNTPTTdTTPTaq DNA 聚合酶载体PCR 产物TA TA第18 页，本讲稿共49 页四、DNA 体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。第19 页，本讲稿共49 页EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4 个碱基的粘性末端。第20 页，本讲稿共49

9、页2.DNA 插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRI BamHIEcoRI BamHIEcoRIBamHI第21 页，本讲稿共49 页3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA 定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG 起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组 但移码突变！第22 页，本讲稿共49 页4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10 倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5 磷酸被除去，不能自我连接

10、。但可以与插入片断以单链连接。5 3 载体插入片断第23 页，本讲稿共49 页1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA 插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）第24 页，本讲稿共49 页1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第二节 重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备第25 页，本讲稿共49 页使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12 系列的大肠杆菌。2.菌种用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理第26 页，本讲稿共49 页4.制备过程培养大肠杆

11、菌OD600至0.3-0.4On ice 5-10 min4 离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4 离心收集菌4 离心收集菌分装、-70 冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬On ice 30 min用冰冷的60mMCaCl2重悬第27 页，本讲稿共49 页二、重组DNA 导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA 的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA 的过程。1.外源DNA 导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA 导入细菌的过程。第28 页，本讲稿共49 页每gDNA 转化成功的细

12、菌克隆数。3.转化方法 2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heat shock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法第29 页，本讲稿共49 页10ng 载体DNA100 L 感受态菌 On ice 混合，静置10 分钟42C 1 分钟加入1mL LB 培养基37 摇1 小时 10-100 L 转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法第30 页，本讲稿共49 页LB 培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15 分钟，2C 离心集菌冰冷的水重悬菌体2C 离心集菌冰冷的水重悬菌体2C 离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成 5

13、0-300 L 电转仪调为2.5kV,25 F 脉冲控制器200-400 0.5 g 质粒DNA On ice 混合加入1mLSOC 培养液37C 中速震荡60分钟10-100 L 转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法第31 页，本讲稿共49 页4.平板培养基培养细菌10-100 L 转化液涂于含抗菌素的平板37 过夜第32 页，本讲稿共49 页环形重组质粒 质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。环形质粒数（1）重组质粒 5.影响转化率的因素第33 页，本讲稿共49 页生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受

14、态菌要在-70 以下CaCl2处理使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞（competent cells)第34 页，本讲稿共49 页把重组的噬菌体DNA 或Cosmid 质粒DNA 包装成具有感染能力的 噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（in vitro packaging）（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA 接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA 注入受体大肠杆菌进行扩增。第35 页，本讲稿共49 页cI857 基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32 下培养细菌时能

15、够保持溶源性。但当温度升高到44 45 时，就会导致cI 基因编码的阻遏蛋白失活，DNA 复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857 基因突变的 噬菌体 但由于该噬菌体的S 基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。第36 页，本讲稿共49 页cI857 其它基因溶源状态（DNA 不转录、不翻译）DNA阻遏 蛋白阻遏 蛋白44 45 DNA 转录、翻译合成外壳蛋白32 第37 页，本讲稿共49 页 噬菌体1外壳蛋白基因E 发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857 基因突变的 噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型 噬菌体。（4）互补型噬菌体 外壳

16、蛋白基因D 发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体2第38 页，本讲稿共49 页体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA 能形成106噬菌斑）。（5）转导 第39 页，本讲稿共49 页转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节 外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his3 1第40 页，本讲稿共49 页（1）利用原生质球进行转化 2.酵母的转化方法 酵母原生质体感受态酶去壁

17、CaCl2、PEG插入外源基因 的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA 进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA 进入。转化第41 页，本讲稿共49 页 酵母0.1mol/L LiCl 处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG 4000（2）利用Li+盐进行转化第42 页，本讲稿共49 页叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞1.叶盘法（leaf disk)第43 页，本讲稿共49 页植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25 F 电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)第44

18、页，本讲稿共49 页又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m 钨弹头 吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（gene gun）4.脓杆菌（agrobacterium）介导（详见另外章节）第45 页，本讲稿共49 页（1）原理：三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES 缓冲盐水与含有氯化钙和DNA 的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA 的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA 沉淀。不需要载体。（2）特点：第46 页，本讲稿共49 页脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。2.脂质

19、体（lipofectin）载体法脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。直接把外源DNA 注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法(microinjection)第47 页，本讲稿共49 页二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖传染法吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。第48 页，本讲稿共49 页DEAE-dextran(葡聚糖)细胞 外源DNA预处理摄入DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran 对细胞有毒!5.病毒（virus）介导（略）第49 页，本讲稿共49 页