实习3-芯片数据的基本处理和分析21293.pptx

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1、实习三：芯片数据的基本处理和分析 王 斌陈 欢 阮 陟 王 丹浙江加州国际纳米技术研究 浙江加州国际纳米技术研究院 院(ZCNI)(ZCNI)实习一 基因组数据注释和功能分析实习二核苷酸序列分析实习三 芯片数据的基本处理和分析实习四 蛋白质结构与功能分析实习五 蛋白质组学数据分析实习六 系统生物学软件实习课程内容基因组学 基因组学转录物组学 转录物组学蛋白质组学 蛋白质组学系统生物学 系统生物学芯片数据分析的一般流程：1.芯片杂交实验芯片杂交实验，芯片数据采集（读取扫描图），芯片数据采集（读取扫描图）2.数据基本处理数据基本处理3.数据提交公共数据库数据提交公共数据库4.数据生物信息学分析数据

2、生物信息学分析 3浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_实习内容：TIGR TM4 软件的介绍和使用 GenMAPP 软件的介绍和使用 GEO 数据库的介绍4浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Cy3 Cy3Cy5 Cy5Cy5-cDNA Cy5-cDNACy3-cDNA Cy3-cDNART RTRT RTcDNA cDNAarray array样本 样本 mRNA mRNA对照 对照 mRNA mRNATIF TIF 扫描图 扫描图常见的双通道（常见的双通道（dual channeldual channel）实验流程：）实验流程：对照基因 对照基因(referen

3、ce gene)(reference gene)：绿色 绿色 荧光标记 荧光标记(G)(G)样本基因 样本基因(sample gene)(sample gene)：红色 红色 荧光标记 荧光标记(R)(R)5浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_6浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_区块(block)非饱和区域 非饱和区域饱和区域 饱和区域信号杂交的一些概念信号杂交的一些概念背景探针区域 探针区域7浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_A package of Open Source software programs for Microarray ana

4、lysis 芯片数据采集（读取扫描图）数据基本处理存储整理芯片数据（数据库）芯片数据分析结果的图形显示TIGR TM4:TIGR TM4:8浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_GenePixGenePix格式（格式（.gpr.gpr）9浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Agilent Agilent 格式 格式（.txt.txt）：）：10浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MEV MEV 文件：文件：MEV MEV 格式的芯片数据 格式的芯片数据11浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Express Converter:芯片数据的格式

5、转换12浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Express Converter Express Converter 主界面：主界面：13浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_ExpressConverter 使用方法：1.1.选择 选择“Input Format Input Format GenPix GenPix”,指定输入的文件格式 指定输入的文件格式;2.2.选择 选择“File File Select input files”Select input files”，选定一个或多个需要，选定一个或多个需要转换的文件 转换的文件;3.3.选择 选择“File Fi

6、le Start converting”Start converting”，格式开始转换。，格式开始转换。待状态栏显示 待状态栏显示“Converting is successful”Converting is successful”后，后，格式转换完 格式转换完成。此时在原 成。此时在原genepix genepix 存放的文件夹中会出现文件名相同但 存放的文件夹中会出现文件名相同但扩展名不同的 扩展名不同的.mev.mev 和 和.ann.ann 的文件。的文件。14浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_inputoutput15浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni

7、_程序运行前程序运行结果16浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MEV MEV 文件：文件：MEV MEV 格式的芯片数据 格式的芯片数据17浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MEV MEV 注释文件（后缀名为 注释文件（后缀名为.ann.ann）18浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_课堂练习使用使用ExpressConverterExpressConverter将将testdata.gprtestdata.gpr转换成转换成testdata.mevtestdata.mev和和testdata.anntestdata.ann。用记事本查看用记事本查

8、看testdata.gprtestdata.gpr，testdata.mevtestdata.mev和和testdata.anntestdata.ann。ExpressConverter ExpressConverter 快捷方式：快捷方式：“开始 开始”“所有程序 所有程序”testdata.gpr testdata.gpr：C:Program FilesExpressConvertersamples C:Program FilesExpressConvertersamples19浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MIDAS:数据基本处理20浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断

9、平台 zcni_低质量数据过滤 根据Flag 过滤 根据信号和背景值过滤21浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MEV MEV 文件：文件：MEV MEV 格式的芯片数据 格式的芯片数据22浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Flags in Mev file:A 0 non-saturated pixels in the spot A 0 non-saturated pixels in the spot B 0-50 non-saturated pixels in the spot B 0-50 non-saturated pixels in the spot C

10、 50 or more non-saturated pixels in the spot C 50 or more non-saturated pixels in the spot X spot is rejected,due to spot shape and intensity X spot is rejected,due to spot shape and intensity relative to background relative to background Y background is higher than spot intensity Y background is hi

11、gher than spot intensity Z spot not detected by Spotfinder Z spot not detected by Spotfindergood good23浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_ 由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡等因素，需对cy3 和cy5 的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据，Normalization 正是基于此种目的。芯片内的数据标准化（Normalization）24浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MIDAS MIDAS 可选的数据处理方法可选的数据处理方法 标准化处

12、理方法 标准化处理方法Total Intensity normalization 低质量数据过滤方法 低质量数据过滤方法Invalid-intensity checkingLOWESS(Locfit)normalizationIterative linear regression normalizationIterative log mean centering normalizationRatio Statistics normalizationLow intensity filterStandard deviation regularizationSlice analysis(non-st

13、atistical)In-slide replicates analysisFlip-dye consistency checkingRatio Statistics confidence interval checkingSignal/Noise checkingCross-file-trimSpot QC flag checkingMA-ANOV ACross-slide replicates t-test(statistical)Cross-slide one-class SAM(statistical)差异表达基因识别方法 差异表达基因识别方法25浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台

14、 zcni_芯片内的数据标准化（Normalization）A AA AMA plotIn many microarray gene expression experiments,the general assumption is that most of the genes would not see any change in their expression.Therefore the majority of the points on the y axis(M)would be located at 0,since log(1)is 0.26浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zc

15、ni_M=log2(R/G)A=log2R*G区块间均一化处理27浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_用MIDAS 处理单张双色芯片的基本流程1.芯片数据的芯片数据的读入读入；2.低质量数据的低质量数据的过滤过滤；3.标准化标准化（包括区块间的均一化）；（包括区块间的均一化）；4.结果文件的结果文件的输出输出。28浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MIDASMIDAS程序界面程序界面29浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Step 1Step 1：芯片数据的：芯片数据的读入读入30浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Step 2Step

16、 2：低质量数据的：低质量数据的过滤过滤31浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Step 3Step 3：标准化标准化（包括区块间的均一化）（包括区块间的均一化）32浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Step 4Step 4：结果结果文件的输出文件的输出33浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_34浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MIDASMIDAS统计作图（统计作图（MIDAS InvestigationMIDAS Investigation窗口查看）窗口查看）log-ratios histogram(.his)Box plot(.

17、box)Intensity plot(.ity)R-I(.prc)Intensity plot(.lty)35浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_课堂练习 使用 使用MIDAS MIDAS 处理 处理testdata.mev testdata.mev，并查看结果文件；，并查看结果文件；MIDAS MIDAS 程序位置：程序位置：C:zcnishiyan3MIDAS2_19 C:zcnishiyan3MIDAS2_19，双击，双击Midas.bat Midas.bat 打开程序；打开程序；输入文件 输入文件testdata.mev testdata.mev 由 由ExpressCo

18、nverter ExpressConverter 产生，在 产生，在C:Program FilesExpressConverterSamples C:Program FilesExpressConverterSamples。36浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_芯片数据聚类分析和差异表达基因筛选 基因表达研究中通常假设表达水平相似的基基因表达研究中通常假设表达水平相似的基因可能参与相同或相似的生物学过程，因而它们因可能参与相同或相似的生物学过程，因而它们具有相似的基因表达谱。具有相似的基因表达谱。例：例：在临床或诊断学等领域中，为研究某些在临床或诊断学等领域中，为研究某些疾病的

19、发生机制，通常对正常组织和肿瘤组织细疾病的发生机制，通常对正常组织和肿瘤组织细胞间的基因表达情况作比较分析，从中筛选出具胞间的基因表达情况作比较分析，从中筛选出具有显著差异的表达基因。有显著差异的表达基因。37浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_38浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MeV 4.3MeV 4.3支持的文件格式支持的文件格式 MIDAS MEV,TA V MIDAS MEV,TA V 格式 格式 表格格式 表格格式 GEO GEO 格式 格式 Affymetrix Affymetrix 格式 格式 GPR GPR 格式 格式 Agilent Agil

20、ent 格式 格式39浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_MeV 4.3MeV 4.3程序主界面程序主界面常用工具栏导航栏结果界面40浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_芯片数据聚类分析和差异表达基因筛选11表格格式数据的读入与转化表格格式数据的读入与转化22系统聚类法对基因和样本聚类系统聚类法对基因和样本聚类33使用使用SAMSAM（significanceanalysisforsignificanceanalysisformicroarraysmicroarrays）查找差异表达基因）查找差异表达基因41浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_11表格

21、格式数据的读入与转化表格格式数据的读入与转化1 选择“FileLoadData”弹出导入数据对话框42浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_43浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_44浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_数据起始位置45浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_不同颜色表示相对表达量 不同颜色表示相对表达量样本名 样本名基因名 基因名HeatmapHeatmapViewView46浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_22系统聚类法对基因和样本聚类系统聚类法对基因和样本聚类47浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 z

22、cni_聚类分析结果图：聚类分析结果图：48浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_存储和注释感兴趣的分类：存储和注释感兴趣的分类：单击鼠标左键选中目标分类使其高亮化；单击鼠标左键选中目标分类使其高亮化；右键选择菜单中的 右键选择菜单中的StoreCluster StoreCluster，并设置注释的名称和颜色，并设置注释的名称和颜色等信息。等信息。49浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_50浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_33使用使用SAMSAM查找差异表达基因查找差异表达基因51浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_不同实验类型 不同实

23、验类型样本分组 样本分组52浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_53浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_SAM SAM 结 结 果：果：Expression Images Expression Images54浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_SAM SAM 结 结 果：果：Centroid Graphs Centroid Graphs55浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_SAM SAM 结 结 果：果：Expression Graphs Expression Graphs56浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_SAM

24、SAM 结 结 果：果：Table Views Table Views57浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_课堂练习 使用 使用MeV MeV 处理 处理TDMS_format_sample.txt TDMS_format_sample.txt，并查看结果文件；，并查看结果文件；MEV MEV 程序位置：程序位置：C:zcnishiyan3MeV_4_3 C:zcnishiyan3MeV_4_3，双击，双击TMEV.bat TMEV.bat打开程序；打开程序；输入文件 输入文件TDMS_format_sample.txt TDMS_format_sample.txt 位于：位于

25、：C:zcnishiyan3MeV_4_3data C:zcnishiyan3MeV_4_3data。58浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_GenMAPP一款将 一款将 芯片数据 芯片数据 和 和 代谢途径 代谢途径 结合起来的图形化显示工具 结合起来的图形化显示工具59浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_WhyPathwayAnalysis?Intuitive to Biologists Provide a biological context for results More efficient than searching databases gene-by

26、-gene Intuitive data display for sharing data Computation on Pathway Content Analyze over-representation of changed genes on pathways and ontologies Generate and compare pathway signatures between models60浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_GenMAPP 安装和更新61浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_GenMAPP 基本概念 MAPP MAPP：描述了模式生物

27、的代谢途径图：描述了模式生物的代谢途径图。目 目 前 前 MAPP MAPP 数 数 据 据 库 库 中 中 包 包 含 含 了 了 人 人(H.sapiens)(H.sapiens)、小 小 鼠 鼠(M.musculus)(M.musculus)、大 大 鼠 鼠(R.norvegicus)(R.norvegicus)、酵 酵 母 母(S.cerevisiae)(S.cerevisiae)、线 线 虫 虫(C.elegans)(C.elegans)、狗 狗(C.familiaris)(C.familiaris)、鸡 鸡(G.gallus)(G.gallus)、牛 牛(B.taurus)(B.t

28、aurus)、果 果 蝇 蝇(D.melanogaster)(D.melanogaster)和 和 斑 斑 马 马 鱼 鱼(D.rerio)(D.rerio)等 等模式生物 模式生物。62浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_SupportedSpeciesFruitflyHumanMouseRatWormYeastZebrafishChickenDogCowMosquitoByrequest:AnyEnsemblspeciesDatabasesbyothergroups:FissionyeastE.coliSoon:Arabidopsis63浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台

29、 zcni_心肌炎患者数据-脂肪酸降解途径64浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_GenMAPP 基本概念 Gene Gene database database：包 包 含 含 了 了 上 上 述 述 物 物 种 种 所 所 含 含 基 基 因 因 的 的 注 注 释 释 及 及 其 其 基 基因标识号（因标识号（ID ID）。对 对 于 于 每 每 个 个 基 基 因 因，Gene Gene Database Database 会 会 建 建 立 立 它 它 在 在 各 各 个 个gene gene ID ID system system 中 中 的 的 对 对 应 应 关

30、关 系 系。比 比 如 如，Trp53 Trp53 基 基 因 因 在 在MGI MGI（小 小 鼠 鼠基 基 因 因 组 组 数 数 据 据 库 库）中 中 的 的 标 标 识 识 号 号 为 为 MGI:98834 MGI:98834，而 而 在 在UniGene UniGene 数 数 据 据 库 库 中 中 标 标 识 识 号 号 为 为Mm.222 Mm.222，在 在Ensembl Ensembl 数 数 据 据 库 库中标识号为 中标识号为ENSMUSG00000059552 ENSMUSG00000059552。65浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_ID Sys

31、tem(Species)System CodeAffymetrix Probe Set ID XPDB PdEMBL EmPfam PfEnsembl EnRefSeq Q Entrez Gene LRGD(R.norvegicus)RFlyBase(D.melanogaster)FSGD(S.cerevisiae)DGene Ontology TUniProt/TrEMBL SHUGO HUniGene UInterPro IWormBase(C.elegans)WMGI(M.musculus)MZFIN(D.rerio)ZOMIM OmOther O66浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平

32、台 zcni_Step 1 Step 1：打开：打开“GenMAPP 2”GenMAPP 2”程序。选择菜单 程序。选择菜单“Data Data Choose Gene Choose Gene Database”Database”按照实验物种选择合适的 按照实验物种选择合适的 基因库 基因库。67浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Step 2 Step 2：从菜单：从菜单“File File Open”Open”打开相应的 打开相应的MAPP MAPP 文件 文件。68浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Step 3 Step 3：从菜单：从菜单“Data Dat

33、a Choose Expression Dataset”Choose Expression Dataset”打开 打开 表达量文件 表达量文件（.gex.gex）并选择相应的）并选择相应的 颜色集 颜色集。69浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_Step 4:Step 4:点击感兴趣的基因查看注释 点击感兴趣的基因查看注释70浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_如何制作.gex 表达量文件？1.1.将芯片数据用 将芯片数据用Excel Excel 按一定格式整理 按一定格式整理71浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_2.2.将 将Excel Excel

34、 另 另 存 存 为 为 文 文 本 本 文 文 件 件（txt txt 后 后 缀 缀 名 名 或 或csv csv 后 后 缀 缀 名 名），可 可 在 在Data Data 菜 菜 单 单“Expression Expression Datasets Datasets New New dataset”dataset”导 导 入 入 该 该 文 文 本 本 文 文件 件。此 此 时 时，程 程 序 序 会 会 向 向 用 用 户 户 提 提 问 问 文 文 件 件 中 中 的 的 数 数 据 据 是 是 数 数 值 值 型 型 还 还 是 是 文 文 本 本型 型，对 对 文 文 本 本

35、文 文 件 件 要 要 在 在 图 图 示 示 框 框 中 中 选 选 勾 勾，点 点 击 击“OK”OK”即 即 可 可，一 一 般 般Control Control Average Average、Treated Treated Average Average、Fold Fold Change Change 和 和p-value p-value 为 为数值型，其他为文本型。数值型，其他为文本型。72浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_如何制作颜色集（color set）？在菜单 在菜单“Data Data Expression Dataset Manager”Expression Dataset Manager”界面下从 界面下从菜单 菜单“Color sets Color sets new”new”新定义一个颜色集 新定义一个颜色集。73浙江加州国际纳米技术研究院分子诊断平台 zcni_