微生物工程第一章 菌种与种子扩大培养22167.pptx

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1、第一章：菌种与种子扩大培养q 微生物工业用菌种q 种子扩大培养q 影响种子质量的主要因素第一节 微生物工业用菌种一、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长二、工业化菌种的要求q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物q 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）q 生产特性要符合工艺

2、要求放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源1、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：三、已工业化产品生产菌的介绍2、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶氨基酸生产菌

3、的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌3、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌四、菌种分离与保藏1、菌种分离的一般过程土样的采取 预处理 培养 菌落的选择 产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目

4、的产物的微生物问题：2、采样时要注意的问题q 气候、水分、空气q 来源要广q 结合产品的特点q 标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。3、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31）但主要是通过培养的方法定向培养的富集方法1、底物 2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，

5、培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。4、菌落的选出q 从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）q 从形态的角度 菌 落 的 外 观 形 态，是 微 生 物 的 一 个 重 要 表 征。如 多 糖产 生 菌 在 适 当 的 培 养 基 上 生 长，从 具 有 粘 液 性 的 菌 落 外 观上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有

6、凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型例：醛肟水解酶的筛选-Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落5、目的微生物富集方法的研究进展q 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA 同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA 杂交技术等q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重

7、点。2002,陈文新（科学院院士）q In contrast to this traditional approach,modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening,which also enables access to enzymes of nonculturable organisms.By this strategy,for instance,the company Diversa(San Diego,CA,USA)identised 120 unique esterases

8、/lipases from only 16%of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.FEMS Microbiology Reviews 26(2002)73 81六、菌株选育与分子改造目的q 提高生产能力q 提高产品质量q 开发新产品q 解决生产实际问题q 防止菌种退化方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9自然突变有两种情况：一 种 是 我 们 生 产 上 所 不 希 望

9、 看 到 的，表 现 为 菌 株 的 衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另 一 种 是 我 们 生 产 上 希 望 看 到 的，对 生 产 有 利，这 种 突变成为正突变。1、自然选育自然选育在工业生产上的意义自 然 选 育 虽 然 突 变 率 很 低，但 却 是 工 厂 保 证 稳 产 高 产 的重要措施。回 复 突 变：高 产 菌 株 在 传 代 的 过 程 中，由 于 自 然 突 变 导 致高 产 性 状 的 丢 失，生 产 性 能 下 降，这 种 情 况 我 们 称 为 回 复突变问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。

10、单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验2、诱变育种用 各 种 物 理、化 学 的 因 素 人 工 诱 发 基 因 突 变 进 行 的 筛 选，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍（2）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择（1）、诱变剂的作用原理（略）压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH（3）、诱变育种的一般步骤(p83)（4）、筛选的方法q 随机筛选q 形态q 理性化筛选从 产 物 形 成 的 生 理 生 化

11、途 径 着 手，进行 有 的 放 矢 的 筛 选。如 结 构 类 似 物 抗性、营 养 缺 陷 型 等，筛 选 而 产 生 的 这些特性，称为遗传标记。结 构 类 似 物：在 化 学 和 空 间 结 构 上 和 代 谢 的 中 间 物（终 产 物）相 似，因 而 在 代 谢 调 节 方 面 可 以 代 替 代 谢 中 间 物（终 产 物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶结构类似物抗性：Lys 的类似物AEC,Thr 的类似物AHV营养缺陷型：如Thr 缺陷型黄色短杆菌F9-50 的诱变谱系

12、Bervibacterium flavum As 1.495(leu-)lys.HCl 2.1 g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8 g/lF9-50(leu-,Thr-,AEC r)33.5 g/l3、基因的直接进化(directed evolution)q 突变 基因突变库的建立q 筛选 基因突变库的筛选q 基因复制与遗传步骤：在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。七、生产用菌种的保藏与复壮（一）、菌种保藏1、概 念：根 据 菌 种 的 生 理 生 化 特 点，人 工 地 创 造 条件，使其代谢活动处于不活泼状态。2、不同情况、不同菌种采

13、用不同方法。v 斜面低温保藏法（如酵母菌）v 石蜡油封保藏法（如酵母菌）v 砂土保藏法（如放线菌）v 硅胶保藏法v 冷冻干燥保藏法（如一般细菌）v 液氮超低温冻结法（如真菌）（二）、防止菌种衰退的措施（1）、菌种的衰退v 发酵力的下降v 繁殖力的下降v 发酵产品的得率降低（2）、衰退的原因v 菌种保藏不妥v 菌种生长的要求没有得到满足 遇到不利的条件 失去某些必要的条件v 发生回复突变（3）、防止衰退的方法v 做好菌种的保藏工作v 尽可能满足生长条件v 尽量减少传代次数（4）、菌种的分离复壮v 普 通 方 法：稀 释 平 板 法 或 平 板 划 线 法 分 离 单 细 胞菌落v 芽 孢 杆 菌

14、：先 将 菌 液 沸 水 处 理 数 分 钟，再 用 平 板进行分离v 改变培养条件：如单细胞分离仍效果不佳，可考虑改变培养温度条件，以利高产菌株生长而不利低产菌株生长 返回第二节 种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求工业微生物的培养类型种子制备的技术概要及种子制备实例影响种子质量的因素 种 子 扩 大 培 养 是 指 将 保 存 在 砂 土 管、冷 冻 干 燥 管 中 处休 眠 状 态 的 生 产 菌 种 接 入 试 管 斜 面 活 化 后，再 经 过 扁 瓶 或摇 瓶 及 种 子 罐 逐 级 扩 大 培 养,最 终 获 得 一 定 数 量 和 质 量 的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。

15、一、种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念:种子扩培的目的q 接种量的需要q 菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：q 总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无杂菌污染二、工业微生物的培养类型培养类型 培养类型 静置培养 静置培养 通气培养 通气培养种子扩大 种子扩大培养 培养液体培养 液体培养 表层培养 表层培养 固态培养 固态培养大规模工 大规模工业生产 业生产嫌气性发酵 嫌气性发酵 好气性发酵 好气性发酵酒精、丙酮、酒精、丙酮、丁醇、乳酸等 丁醇、乳酸等固体培养 固体培养液体深 液体深层培养 层培养载体培养 载体培养两

16、步法 两步法液体深 液体深层培养 层培养返回三、影响种子质量的因素（一）、种子制备的过程（一）、种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。（二）、实验室阶段1、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：q 对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量

17、和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。q 对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。2、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。3、起始接种物的传代问题q 细菌保藏斜面 活化斜面q 产孢子保藏 母斜面 子斜面目的：使菌种的传代次数尽可能的少。母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。子

18、瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1 个月。孢子培养不产孢子的细菌如谷氨酸棒杆菌和短杆菌，采用斜面营养细胞保藏法，23 月移种1 次产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种如灰色链霉菌和卡那霉菌，可将孢子接入液体培养基中形成菌丝体种子。（三）、生产车间阶段1、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。q 缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：2、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，

19、所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化例：柠檬酸发酵q 以蔗糖为原料成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5%20%NH4NO3 0.225%0.11%K2HPO4 0.03%MgSO4.H2O 0.025%0.025%KCl 0.015%琼脂 2%q 薯干粉成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 薯干粉 10%22-28%(NH4)2SO4 0.5%琼脂 2%3、发酵级数的确定谷氨酸：二级发酵摇瓶一级种子（小罐）发酵青霉素：三级发酵一级种子（发芽罐）二级种子（繁殖罐）发酵 一般由菌丝体培养开

20、始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数链霉素：四级发酵一级种子 二级种子三级种子发酵发酵级数确定的依据q 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4 级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面4、接种量的确定 移入种子的体积接种量 接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。P 1475、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间

21、。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。接种种龄对碱性蛋白酶产生的影响接种量对碱性蛋白酶产生的影响6、温度大多数微生物的最适生长温度：2537 不同生长阶段的微生物对温度的反应不同。原则：延迟期处于最适生长温度，对数生长期略低于最适生长温度，后期主要决定于溶解氧。Q10:在生物学范围内，温度每升高10，生长速度加快1 倍。7、pH 值pH 值的作用：影响菌体本身的生命活动；影响酶合成方向。培养过程中发酵液的pH 值会发生变化。高碳源培养基倾向于向酸性pH 值转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH 值转移，变化总结果取决于碳氮比。8

22、、通气和搅拌通气量与菌种、培养基的性质及培养阶段有关。不同微生物要求通气量不同，同一菌种在不同生理时期对通气量要求不同培养罐深、搅拌转速大，通气管开孔小或多，培养基粘度小，氧的溶解度大，反之则小。9、泡沫泡沫形成的原因：机械搅拌和通气使液体分散和空气窜入；代谢活动产生的气泡。泡沫的危害：影响氧的吸收和二氧化碳的排出；降低发酵罐的有效容量；导致跑料和染菌。消泡措施：机械消泡，化学消泡。10、染菌的控制种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。11、种子的质量要求：量

23、：要求达到一定的浓度质:形态（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P 的含量，pH 酶活等 无污染四、种子制备过程举例（一）、谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵1、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%，pH 7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32，生长18-24 小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次2.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml 三角瓶中，装液200-250ml,32 培 养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2H

24、PO4 0.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基3.二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养7-10 个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2 时结束，6.887.0-7.2活力旺盛（二）、青霉素生产的种子制备制备过程安培管 斜面孢子 大米孢子 一级种子 二级种子 发酵1、斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：25、7天,注意湿

25、度50%左右2、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：25、7天，控制湿度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子3、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：长菌体培养条件：27，40小时接种量：200亿孢子/吨4、二级种子培养基：同上培养条件：27、10-14 小时接种量：10%种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 期青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4 为年青期，4-6 期合成青霉素的能力最强谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH