中国南方典型矿区浸矿细菌分离及其亚铁和硫氧化性能比较.pdf

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1、http:/ -1-中国南方典型矿区浸矿细菌分离及其亚铁和硫氧化性能比较中国南方典型矿区浸矿细菌分离及其亚铁和硫氧化性能比较1 何环，夏金兰，彭安安，邱冠周 中南大学资源加工与生物工程学院，教育部生物冶金重点实验室，湖南长沙（410083）E-mail：.摘摘 要：要：本实验从中国南方典型矿区广东梅州玉水生物提铜示范基地酸性矿水中分离得到三株嗜酸氧化亚铁硫杆菌 YS-I，YS-II，YS-III。对分离得到的菌株形态学、16S rDNA 的序列、以及对亚铁和硫的氧化性能进行了比较分析，并且对其中亚铁氧化活性较高的菌株 YS-I进行了黄铁矿和闪锌矿浸出的比较试验。结果表明，这些细菌的大小为长约

2、1.0-2.5um，直径 0.4-0.6um，能运动，革兰氏染色显阴性，最适生长 pH 值为 2.0，最适生长温度为 30，能利用亚铁盐，单质硫和硫代硫酸钠，不能利用有机能源。YS-I 浸矿数据表明该菌对铁闪锌矿和黄铁矿的浸出率分别为 14.38%和 3.8%。关键词：关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌，菌种筛选，系统发育分析，浸矿试验 中图分类号：中图分类号：TF18 文献标识码：文献标识码：A 嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxians）是典型喜温硫化矿浸矿细菌之一，化能自养，能氧化亚铁，单质硫及还原性硫化合物，杆状，细菌大小一般为长1.02.0um，宽0.50

3、.6um，能通过极生鞭毛运动，细菌在生长过程中有时会出现链生现象1。最新的浸矿菌属分类将Acidithiobacillus ferrooxians，Acidithiobacillus caldus以及Acidithiobacillus.thiooxidans归类为原细菌中-proteobacteria 2,3。浸矿功能菌种的定向选育对于提高实际矿样的浸出效果，具有重要的经济意义。成功的菌种定向选育与出发菌株的性能有直接的关系，而出发菌株的性能与菌株的来源地则密切相关。本实验意欲从典型矿区筛选浸矿功能菌株，为定向选育菌种提供基础菌株。为此，本实验从中国南方广东梅州玉水生物提铜示范基地中酸性矿水中

4、取回水样，从中筛选得到三株嗜酸硫杆菌，将其命名为YS-I，YS-II，YS-III。通过对其生理生化性质以及16S rDNA 序列同源性分析，发现这三株菌均为嗜酸氧化亚铁硫杆菌；利用氧化活性相对较高的菌株YS-I对黄铁矿、铁闪锌矿进行了浸矿实验，取得了一定的浸矿效果。1.材料及方法材料及方法 1.1 菌种来源菌种来源 实验中所采用嗜酸氧化亚铁硫杆菌均分离自广东梅州玉水生物提铜示范基地地下不同深度的矿坑中酸性矿水样品中，原始水样 pH 值介于 2.5-5.0 之间。1.2 培养基培养基 富集培养基采用修饰的 Waksman 培养基(1L)：(NH4)2SO4 3.0g，Ca(NO3)2 0.01

5、，KCl 0.1 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，FeSO 4.7H2O 45 g，加入 1000ml 蒸馏水，用 1mol/LH2SO4调节 pH 到 2.0。另外在实验过程中还采用了 Waksman+单质硫（1%，W/V）作为培养基培养细菌。固体培养基采用修饰过的 Starkey 培养基(1L):A 基本盐成份(NH4)2.SO4 3.0g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.1 g，MgSO4.7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.01g，dH2O 200ml；B 成份 琼脂粉 15g，1本课题得到国家创新群体基金资助项目(50321402)和国家重大

6、基础研究项目“973”(2004CB619204)的资助。http:/ -2-dH2O 700ml；C 成份 FeSO 4.7H2O22.2g，灭菌 dH2O 100ml。A、B 分别 121，0.1Mpa 灭菌 20min，FeSO 4.7H2O 采用 0.22um 超滤膜过滤除菌，A、B 灭菌冷却混合后，再混合 C，混合后的培养基用 1mol/LH2SO4调节 pH 到 2.5。本实验中如果没有特殊声明，所采用的液体培养基均为修饰过的 Waksman 培养基，培养条件均为 250ml 三角瓶中加 100ml 培养基 30、175r/min 恒温振荡器中培养；所选用固体培养基均是修饰过的 S

7、tarkey 培养基，涂布后的平板于恒温隔水式培养箱 30培养。1.3 采用试剂采用试剂 生化试剂：基因组提取试剂盒（EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps Kit）购自Bio Basic 公司，Taq DNA 聚合酶购自 Fermentas 公司，凝胶提取试剂盒（E.Z.N.A Gel Extraction Kit）购自 Omega Bio-Tek 公司，pBS-T PCR 产物克隆试剂盒购自 TIANGEN BIOTECH 公司（北京）。通用引物对 63f(5-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3)和 1387r(5-GGGCGGWGTGT

8、ACAAGGC-3)由北京三博远志生物技术有限公司提供。亚铁氧化滴定试剂：K2Cr2O7 0.02mol/L(使用时根据实验需求在稀释到相应浓度)，1:1硫磷酸（75ml H2SO4，75ml H3PO4，350ml H2O）,0.2%二苯胺磺酸钠4。实验采用矿物来源：本次实验中所选用的黄铁矿和铁闪锌矿由中南大学资源加工与生物工程学院矿物加工工程系提供。矿物基本成分如下：铁闪锌矿（Zn 47.4%，Fe 16.99%，S 30.85%，）,黄铁矿（Fe 44.79%，S 47.74%）。1.4 菌种分离及形态分析菌种分离及形态分析 先用修饰过的 Waksman 液体培养基富集样品中的微生物，取

9、 10ml 水样接到液体培养基中培养，待镜检可以看到明显的微生物时再用相同的培养基富集，富集三代后，采用平板连续分离 3 次，从平板上挑单菌落得到单菌株，将分离得到的三株细菌分别命名为 YS-I，YS-II，YS-III。将分离的单菌株转到液体培养基中扩培后收获细菌，在光学显微镜（Olympus CX-31）下观察细菌的的形态和运动情况，经革兰氏染色后再观察其染色情况。细菌样品经处理后用扫描电镜(JEOL JSM-6360 LV)观察细菌的显微结构。1.5 生理生化性质测定生理生化性质测定 1.5.1 生长氧化曲线测定生长氧化曲线测定 用液体培养基扩培好细菌后，离心分离富集细菌，将菌泥用灭菌的

10、不含亚铁的 Waksman培养基稀释，然后将稀释好的菌液接种到 250ml 含 100ml 修饰过的 Waksman 液体培养基中，保证接种初始浓度为 1.0106个/ml，每隔一段时间（48h）取一定量菌液，采用血小板计数法计量菌液中的菌数，同时采用亚铁氧化还原滴定法测定其中亚铁离子含量。1.5.2 最适生长温度测定最适生长温度测定 采用相同方法收集细菌后，同样用不含亚铁的 Waksman 培养基稀释，然后将稀释好的菌液接种到液体培养基中，保证每个接种后初始浓度均为 1.0106个/mL。将配好的菌液分别置于 25、30、35、40、45、50、55、60温度梯度中培养，2 天后采用血小板计

11、数法直接计数其中菌数。http:/ -3-1.5.3 初始初始 pH 对细菌生长氧化活性的影响对细菌生长氧化活性的影响 用 1mol/LH2SO4调节液体培养基的 pH 分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0。接种后保证每个样品中的细菌初始浓度均为 1.0106个/mL，在 30条件下培养 2 天后采用血小板计数法测量其中菌的生长情况。1.6 能源利用情况的测定能源利用情况的测定 在不含亚铁的基本液体培养基中（100ml）分别加入单质硫(1%)(W/V)，FeSO 4.7H2O（4.31%）+单质硫（1%），硫代硫酸钠（1%），葡萄糖（1%），酵母粉（1

12、%），蛋白胨（1%），黄铁矿（1%），铁闪锌矿（1%），其中硫代硫酸钠，FeSO 4.7H2O 均采用 0.22um 超滤膜过滤除菌后再加入培养基，硫磺隔水蒸煮一小时灭菌加入培养基，葡萄糖 115灭菌 20min 后再加入培养基，30条件下培养 5 天后采用血小板计数法测量其中菌的生长情况。1.7 16S rDNA 的的 PCR 扩增，序列测定及系统发育树分析扩增，序列测定及系统发育树分析 1.7.1 染色体染色体 DNA 的提取的提取 采用液体培养基培养细菌 3 天后，先用普通滤纸过滤尽量除去培养基中的铁矾，滤液先用4000r/min高速离心机离心5min最大限度除去培养液中沉淀后采用100

13、00r/min离心10min富集细菌，然后用 pH2.0 硫酸清洗菌泥 3 次后转至 1.5mlEP 管中，用 500ulTE(pH8.0)重悬细菌平衡 pH 后，按照基因组提取试剂盒内说明操作提取细菌的基因组 DNA。1.7.2 16S rDNA 的的 PCR 扩增及序列测定扩增及序列测定 采用通用引物 63f(5-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3)和 1387r(5-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3)扩增细菌的 16S rDNA，PCR 扩增体系为：10PCR 缓冲溶液 5L,25mmol/L MgCl2 5L,2mM dNTP mix 5L,引

14、物 63f（62.5mol/L）和引物 1387r（62.5mol/L）各 2L，Taq DNA 聚合酶（5u/L）1L,模板 2L。扩增程序为：94 5min；94 45s，55 45s，72 90s，33 个循环；72 10min。PCR 产物经过凝胶提取试剂盒（E.Z.N.A）回收后，用 pBS-T PCR 产物克隆试剂盒将 PCR 产物转入大肠杆菌，然后挑阳性克隆子穿刺后送交北京三博远志公司测序。1.7.3 系统发育树的构建系统发育树的构建 将菌株的 16S rDNA 序列在 GenBank 核酸序列数据库中进行序列比对后，用 Clustal X(1.8)软件进行 16S rDNA 同

15、源性分析,并构建系统发育树。1.8 浸矿试验浸矿试验 浸矿实验采用了黄铁矿，铁闪锌矿，矿样的粒度为200 目,矿浆浓度为 5%（W/V），100ml液体培养基中加入 5g 矿粉，细菌接种后浓度为 1.0107个/ml，培养十天后用原子吸收方法测量金属离子的浸出率。2.结果结果 2.1 细菌的形态特征细菌的形态特征 分离纯化出来的三株细菌通过显微镜观察均为短杆状，能运动，革兰氏染色显阴性，扫描电镜分析表明三株细菌的大小介于长 1.0-2.5um，直径 0.4-0.6um 如图 1-C（YS-I 在亚铁培http:/ -4-养基中生长电镜照片，文中只列出了部分图片）。同时，通过扫描电镜比较了细菌

16、Waksman+硫作培养基质的培养基和以 Waksman+亚铁作为培养基培养细菌的差异性。在普通光学显微镜下观察就可以发现，在硫培养基里生长细菌明显比在亚铁培养基中瘦长，并且在含硫培养基里生长的细菌链生现象明显，如 YS-II 在含硫培养基中链生现象（见图 1-D）。细菌在固体平板上培养一星期后开始出现白色凸起菌落，菌落直径约为 0.2-1mm，表面光滑，边缘完整，如图 1-A（YS-I）培养到十天左右，部分白色菌落开始变黄，菌落周围培养基也逐渐呈现黄色，培养到十四天左右，平板上菌落全部变成黄色，表面粗糙，菌落周围变得不规则，菌落中心呈现黄褐色。如图 1-B（YS-I）。ABCDABCDABC

17、D 图 1 细菌在固体培养基上菌落形态以及菌株 YSI 和 YSII 分别在含亚铁和含硫培养基中生长情况。Figure 1.The colony of the strain YSI and the cellular structure of the strain YSI and YSII 2.2 生理生化特征生理生化特征 2.2.1 生长氧化曲线生长氧化曲线 实验中三株细菌的生长曲线（如图 2-A）迟缓期均介于 8-10h 左右，然后进入代数期，根据不同菌株的生长曲线数据可以计算细菌在代数生长期的比生长速率（）和代时（G）（数据见表 1）。图 2 细菌的生长曲线 2-A 和亚铁氧化曲线 2-B

18、 Figure 2 The growth curve of the three strains and the ferrous ions oxidation rate curve http:/ -5-图 3 YS-I 亚铁和单质硫中生长曲线 Figure 3 The growth curve of strain YS-I in the culture medium with ferrous sulfate and elemental sulfur 从图 2 中得知，同一个矿区不同的水样点筛选出来的细菌生长氧化活性大致相同，但还是有一些差异，其中 YS-I 的氧化活性高于其它两株细菌。从图 2-

19、B 的亚铁氧化曲线可以看出，经过 72h 后培养基中的亚铁均被氧化完全。从细菌在含亚铁和单质硫的培养基中生长情况看，（如图）细菌在亚铁中上长速度明显快于在单质硫中生长细菌，但 100h 后，在硫中生长细菌菌浓度明显高于在亚铁中生长的细菌，细菌浓度达到 108个/mL。三株细菌在液体培养基中的代时和比生长速率见表 15。表 1 三株细菌在液体培养基的比生长速率和代时 Table 1 The growth rate and generation times of three isolates in the liquid medium 菌 株 YS-I YS-II YS-III 比生长速率（/h）0

20、.078 0.051 0.036 代时（G/h）8.937 13.720 19.001 2.2.2 初始初始 pH 对细菌生长的影响对细菌生长的影响 由图 3 可以看出，初始 pH 值对细菌的生长有较大影响，细菌生长的最适 pH 为 2.0，在pH 值低于 2.0 时，细菌的生长受到抑制，如图（4-A），其中空白对照中亚铁离子的氧化也相当低，说明在 pH 低于 2.0 时，溶液中的亚铁离子很难被空气中的氧气氧化。相比之下，细菌在 pH 介于 2.0-2.5 时，培养基中的亚铁离子几乎都是细菌氧化作用的结果如图（4-B）。在培养基 pH 高于 3.0 时，空白对比中的亚铁离子很容易被氧化，而该条

21、件下的细菌浓度并不高，这证明在 pH 高于 3.0 条件下，培养基中的亚铁离子几乎都是空气中氧气氧化所致。http:/ -6-图 4 初始 pH 对 YS-I 菌株生长氧化的影响 Figure 4 The Effects of initial pH on the growth and ferrous ions oxidation of strain YS-I 2.2.3 生长最适温度生长最适温度 从实验结果看，YS-I 细菌在 25-40均能生长，其最适的生长温度为 30，在温度超过40，菌体大量死亡。2 02 53 03 54 04 55 001 02 03 04 05 0T e m p e

22、 ra ture/OCConcentration(x106cells/mL)图 5 不同的温度梯度对 YS-I 菌株生长情况的影响 Figure 5The effect of different temperature grads on the growth of the strain YS-I 2.2.4 能源利用情况能源利用情况 三株菌株对能源的利用情况见表 2，三株细菌对能源的利用情况一致，不过在实验过程中发现，YS-I 在无机盐培养基中的生长情况均比另外两株细菌好，菌的浓度比另外两株细菌的菌体浓度都要高。并且在黄铁矿和硫和亚铁盐的培养基中的细菌在培养 3 天后，菌的浓度比在单质硫，硫代

23、硫酸钠，铁闪锌矿中的菌体浓度要高，但是五天后，单质硫的中菌体浓度要比单纯用亚铁作为能源基质培养的细菌的菌体浓度要高一个数量级。表 2 三株菌株对底物的利用情况 Table 2 The usage of substrates of three strains 底物 菌株 硫(1%)硫（1%）+亚铁盐（4.31%）葡萄糖（1%）酵母粉（1%）蛋白胨（1%）硫代硫酸钠（1%）黄铁矿（1%）闪锌矿（1%）YS-I +YS-II+YS-III+http:/ -7-2.3 菌株的菌株的 16S rDNA 序列分析和系统发育树的构建序列分析和系统发育树的构建 所分离到的菌株 YS-I，YS-II，YS-II

24、I 在 Genbank 中对应的登陆号分别为 DQ673104，DQ672631，DQ672632。图 6 三株细菌的 16S rDNA 系统发育分析 Figure 6 The 16S rDNA phylogenetic analysis of three isolates 从系统发育分析看所分离得到的三株细菌与已有的 Acidithiobacillus ferrooxians 相似度超过 98%，但分别属于不同的组。YS-II 与菌株 yunan3 相似度达到 99.8%，YS-III 与菌株YTW 和 YN-1 最相似，其中菌株 YSI 比较特殊，单独成组，有可能是嗜酸氧化亚铁硫杆菌属中的

25、一个新的亚种。2.4 浸矿实验浸矿实验 菌株 YS-I 菌株浸矿实验数据如表 3，图中数据表明，YS-I 菌株对闪锌矿浸出效果较好，10 天锌离子的浸出率为 14.38%，而空白锌的浸出率仅为 1.83%，相比之下 YS-I 菌株对黄铁矿的浸出效果不是很明显，铁的浸出率为 3.8%，空白的浸出率为 1%。表 3 YSI 菌株对黄铁矿和闪锌矿金属离子浸出率 Table3 Metal ions leaching rate of pyrite and spalerite by the strain YS-I 矿样 金属离子浸出率（%）空白浸出率（%）黄铁矿 3.8 1 闪锌矿 14.38 1.83

26、3.讨论讨论 本实验从广东梅州生物提铜示范基地酸性矿水中分离纯化得到三株细菌，通过细胞形态与生理生化及分子生物学上的鉴定，该三株细菌均为嗜酸氧化亚铁硫杆菌，三株细菌均能利用亚铁，单质硫，硫代硫酸钠作为能源物质，不能利用葡萄糖等有机能源，同时，葡萄糖明显阻碍了细菌利用亚铁。另外通过对其中氧化活性比较好的细菌 YS-I 的生理生化性质研究发现该菌株的最适生长温度为 30，最适 pH 为 2.0-2.5。系统发育分析表明，该三株细菌可能分别属于三个不同的组，并且 YS-I 与分离得到的两株菌株在进化树上相差较远，自成为一个新的组；从对三株细菌的生理生化性质研究表明，YS-I 在生长氧化活性方面明显强

27、于另外两株细菌外，能源利用和细菌形态方面并没表象出特别的差异，有可能分离到的该菌株是一个新的亚种6,7。http:/ -8-通过比较在亚铁和单质硫中生长的细菌形态发现，生长在单质硫中的细菌比在亚铁中生长的细菌菌体大小明显偏长，并且链生现象明显，可能是因为细菌在不同亲疏水性的培养基质中其胞外多聚物的成分存在差异性所致。据Gehrke T et.al,8,9研究表明，Acidithiobacillus ferrooxidans在亚铁盐中生长时，其胞外物质含有较多糖及糖醛酸，细菌主要通过静电作用于晶体表明接触，而在单质硫中生长的细菌其胞外物质含有较少的糖类物质，但是其饱和酸的含量却增多。傅建华等，1

28、0采用了电镜细胞化学方法证实了Acidithiobacillus ferrooxidans胞外多聚物的存在，科学、直观地再现了胞外多聚物中的脂类、多糖、外膜蛋白等生物大分子以及铁离子，间接证明了胞外多聚物在吸附、形成细菌生物膜过程中起着关键作用。另外，细菌在两种能量基质中生长速度明显存在差异，在单质硫中生长的细菌虽然在初期生长速度明显低于在亚铁中生长速度，但是在培养100h后，在单质硫中生长的细菌浓度可以达到108个/mL，其原因可能是因为细菌在利用元素硫时，需要经过一段时间诱导自身表达或合成分泌性疏水胞外物质，利于与元素硫接触，一旦接触好后，由于元素硫的氧化能提供较亚铁氧化更多的能量，因而培

29、养后期菌体达到较高浓度。嗜酸氧化亚铁硫杆菌与硫化矿之间的相互作用机理研究较为深入，目前比较认同的主要存在两种机制11-13：不易溶于酸的金属硫化矿主要通过硫代硫酸钠途径，如黄铁矿，辉钼矿等，溶于酸的硫化矿主要通过聚硫化物途径。不溶于酸的金属硫化矿主要是通过溶液中的Fe3+对金属硫化矿氧化，在产生硫代硫酸根离子后，金属离子与硫之间的化学键断裂。溶于酸的金属硫化矿在浸出过程中受到溶液中的铁离子和质子攻击，这些金属硫化矿的金属与硫之间的化学键可以在质子的攻击下断裂而生成硫化氢进于通过聚硫化氢途径生成单质硫。通过采用YS-I浸出黄铁矿和闪锌矿，发现该菌株对闪锌矿有较好的作用，而对黄铁矿作用效果较差，并

30、且通过对比空白和加入细菌的浸出液可以肯定细菌对金属离子的浸出效果有明显的促进作用。矿物成分分析表明黄铁矿和闪锌矿均含有亚铁和硫，且黄铁矿中亚铁和硫含量都高于闪锌矿中相应的成分，但是该菌株却对闪锌矿作用效果更好，这可能与矿物的表面结构有关，尽管细菌与矿物的作用位点至今还不是很清楚，但Gehrke T,et al14,提出细菌可能会优先作用于晶格表面不完整的部分。石绍渊等15，通过扫描电镜观察浸渣颗粒表面发现经过细菌处理后，矿物颗粒表面一些部位形成明显的腐蚀坑。因为试验中选用的闪锌矿中含有较多元素铁，而相比之下黄铁矿中成分比较单一，因此铁闪锌矿的表面晶格比黄铁矿容易破坏；同时，闪锌矿中金属原子与元

31、素硫之间的化学键同时受到质子和三价铁离子的攻击更容易断裂，所以这些原因有可能是细菌对闪锌矿的浸出效果比黄体矿要好的原因。http:/ -9-参考文献参考文献 1Anders B.Jensen,Colin Webb.Ferrous Sulphate Oxidation Using Thiobacillus ferrooxidans:a Review J.Process Biochemistry,1995,30(3):225-236.2Donovan P.Kelly,Ann P.Wood.Reclassification of some species of Thiobacillus to the

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39、工程学报 J.2005,5(4):384-388.Isolation leaching bacteria in the typical mining area of south China and the relative oxidation ability between ferrous sulfate and elemental sulfur He Huan,Xia Jinlan,Peng Anan,Qiu Guanzhou School of Resources Processing and Bioengineering,Central South University,Changsha

40、,China(410083)Abstract Three strains Acidithiobacillus ferrooxians named YS-I，YS-II，YS-III were isolated from the acidic water in typical mine area of south ChinaMeizhou Yushui copper mine of Gunadong province.The morphology,16S rDNA sequence and the oxidation ability of ferrous sulfate and elementa

41、l sulfur were studied comparatively,while the strains YS-I with best oxidation ability was used to leaching pyrite and sphalerite.It were shown that these strains were Gram negative and rob-shaped in(1.0-2.5)（0.4-0.6）um,mobile,and the optimum pH was 2.0,and the optimum growth temperature was 30.Thes

42、e strains were able to grown in the liquid medium with ferrous sulfate,elemental sulfur and thiosulfate but failed to make use of organic energy source.The date of leaching experiment with the strain YS-I showed that the strain had better leaching rate on sphalerite than pyrite and the leaching rate of metal ions were 14.38%,3.8%respectively。Keywords:Acidithiobacillus ferrooxians,Strain Isolaton,Phylogenetic analysis,Leaching experiment