(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品).pdf

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1、基因工程知识点基因工程1、操作水平:DNA 分子水平目的:定向改变遗传物质或获得基因产物。理论基础:1)物质基础脱氧核苷酸 2)结构基础规则的双螺旋结构3)中心法则,共用一套遗传密码 2、基因工程(genetic engineering):指重组DNA 技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术 指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组 DNA 技术);而 下游技术 则涉及到基因工程菌或细 胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。(基因操作、遗传工程、重组 DNA 技术)。1973 年诞生的 b5E2RGbCAP基本用途:分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资

2、源;大规模生产生物活性物质;设计、构建生物的新性状甚至 新物种。p1EanqFDPw3、重组 DNA 技术:是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的 DNA 体外操作程序,也称为分子克隆技术。其核心步 骤是DNA 片段之间的体外连接。DXDiTa9E3d4、基因工程的基本形式:第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途1/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第1页(完整word

3、版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第1页径工程 第四代 基因组或染色体的转移 基因组工程 5、基因工程诞生的理论基础:理论上的三大发现 RTCrpUDGiT1】证实了 DNA 是遗传物质;2】揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理;3】遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。6、DNA 双螺旋:带负电的糖-磷酸骨架在外侧,碱基在螺旋中间相互堆叠,以 5 3方向反向平行关系。5PCzVD7HxA第二章 用于核酸操作的工具酶1、寄主的限制和修饰现象:【1】作用:保护自身 DNA 不受限制;破坏入侵的外源 DNA,使之降解。【2】入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌,但却丧失

4、了在其原来宿主细胞中的存活力。因为它们在接受新宿 主甲基化酶修饰的同时,也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。jLBHrnAILg2、限制性核酸内切酶的命名:如:Hind 属名(H)+种名(in)+株名(d)+类型()xHAQX74J0XII 型限制性核酸内切酶的基本特性:识别双链 DNA 分子中 4-8 对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序 列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。LDAYtRyKfE*一个单位的限制酶定义为:在合适的温度和缓冲液中,在 50L 反应体系中,1h 完全降解 1g 底物 DNA 所需的酶量。两种 DNA 甲基化酶:DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)

5、,甲基化酶在 5 GATC3序列中的腺嘌呤 N6 位引入甲2/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第2页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第2页基.DNA 胞嘧啶甲基化酶(dcm),甲基化酶在 5 CCAGG3或 5 CCTGG3序列中的胞嘧啶 C5 位上引入甲基,受其影响的酶有 EcoR II 等.Zzz6ZB2Ltk*3、诱发星号活性产生的原因:1高甘油含量 5%;2内切酶用量过大;3 低离子强度;4 高 pH;dvzfvkwMI1 5 含有有机溶剂,如乙醇;6Mn/Cu/Zn 等非 Mg 二价阳离子存在。4、DNA 聚合酶 I 的基本性质:5

6、 3 DNA 聚合酶活性;5 3的核酸外切酶活性;3 5的核酸外切酶活性。切口平移法:目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。rqyn14ZNXIKlenow 酶的基本用途:1】补平由核酸内切酶产生的 5粘性末端;2】DNA片段的同位素末端标记;EmxvxOtOco3】cDNA 第二链的合成;4】双脱氧末端终止法测定 DNA 序列Klenow 片段:保留 5 3聚合酶活性和 3 5外切酶活性;丧失了 53的核酸外切酶活性。SixE2yXPq5T4-DNA 聚合酶的基本用途:1】切平由核酸内切酶产生的 3粘性末端;2】DNA 片段的同位素末端标记 6ewMyirQFLT4-DNA 酶的基

7、本特性:1】5 3的 DNA 聚合酶活性和 3 5的核酸外切酶活性;kavU42VRUs2】在无 dNTP 时,可以从任何 3-OH 端外切;3】只有一种 dNTP 时,外切至互补核苷酸暴露时停止;4】在四种 dNTP 均存在时,聚合活性占主导地位;5】外切酶活性比 Klenow 酶高 1001000 倍。y6v3ALoS89反转录酶:依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶3/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第3页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第3页基本特性(用途):1.以 RNA 为模板聚合 cDNA 链;2.双向外切 DNA-RNA杂合链中

8、的 RNA 链 M2ub6vSTnPS1 核酸酶的基本反应(用途):(来源于稻谷曲霉菌;催化反应需 Zn2+和酸性条件 pH4.0 4.5)0YujCfmUCw1)内切单链 DNA 或 RNA;2)内切带缺口或缺刻的双链 DNA 或 RNA;3)在DNA 上定位 RNAeUts8ZQVRdBal31 核酸酶:单链内切、双链外切的核酸酶;运用于诱变育种。末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)基本特性:不需要模板的 DNA 聚合酶,随机掺入 dNTPs碱性磷酸酶:1 来自小牛胸腺的小牛肠碱性磷酸酶(CIP);2来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶(BAP)。sQsAEJkW5T它们都可以催化核酸分子的脱磷作用,使

9、 DNA 或 RNA 的 5磷酸变为 5-OH 末端。第三章 基因工程载体1、载体:在基因工程操作中,把能携带外源 DNA 进入受体细胞的 DNA 分子。*2、基因工程对载体的要求(理想质粒载体的必备条件):(1)在宿主细胞内能独立复制(2)有选择性标记(3)分子量小,拷贝数多(4)有一段多克隆位点,外源 DNA 插入其中不影响载体的复制(5)容易从宿主细胞中分离纯化4/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第4页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第4页载体的基本条件:能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制;具有合适的限制性核酸内切酶位点;具有合适

10、的选择性标记基因,用来筛选重组体DNA。GMsIasNXkA3.载体的种类:质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体、(柯斯质粒、动物病毒)特点:载体 DNA 是单个复制单元,在宿主细胞内应具有独立复制能力;含有多种限制行内切酶的单一切点;分子量尽可能小,便于细胞中分离纯化,离体条件下操作;载体内有不影响其复制,生长的非必要区域;具有多种选择性标记。TIrRGchYzg*构建基因文库常用的载体:载体系列、cosmid(柯斯质粒)载体、YAC(酵母人造染色体)、BAC(细菌人造染色体)、P1 源人工载体 7EqZcWLZNX第一节 质粒载体质粒:独立于染色体以外的能自主复

11、制的双链闭合环状 DNA 分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中组成部分:复制必需区、选择标记基因、限制性核酸内切酶位点(克隆位点)生物学特性:分子小、编码基因少、双链环状闭合。(酵母的杀伤质粒 是RNA)空间构型:共价闭合环状 DNA(SC),呈超螺旋 开环 DNA(OC),一条链上有一至数个缺口 lzq7IGf02E 线形 DNA(L 构型),呈负超螺旋*电泳速率:SC-DNA 最快、L-DNA 次之、OC-DNA 最慢二、质粒的类型5/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第5页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第5页1、接合型质粒:能自我

12、转移;带有自我复制所必需的遗传信息;带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如:F 质粒(性质粒、或 F 因子)严紧型质粒;不符合基因工程的安全要求 zvpgeqJ1hk2、非接合型质粒:不能自我转移;带有自我复制所必需的遗传信息;但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因(缺 乏转移所需的 mob 基因),因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。如:R 质粒(抗性质粒)、Col 质粒(大肠杆菌素 对不带 Col 质粒的大肠杆菌有毒。Col 质粒或 R 质粒如果带有转移基因,也可以成为接合型质粒)松 弛型质粒;符合基因工程的安全要求NrpoJac3v1三、质粒的复制类型-松弛型质粒:拷贝数多,有

13、10 60 份拷贝 严紧型质粒:拷贝数少,只有 1 3 份拷贝 1nowfTG4KI四、质粒载体的构建1.天然质粒的局限性1)分子量大,拷贝数低:第一个用于基因克隆的天然质粒 pSC101,分子长9.09kb,属严紧型质粒;但只有 Tetr 一个 选择性标记;分子质量大,拷贝数低fjnFLDa5Zo2)筛选标志不理想:ColE1 质粒筛选标志是大肠杆菌素 E1;colicin E1 能杀死不含 ColE1 质粒的菌,形成 噬菌斑。2.质粒载体必须具备的基本条件 tfnNhnE6e51)具有较小的分子量和较高的拷贝数 2)具有若干个限制性内切酶的单一酶切位点3)具有两种以上的选择标记基因 4)具

14、有复制起点(ORI)6/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第6页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第6页5)缺失 mob 基因 6)重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达3.质粒的选择标记及其工作原理:(1)选择标记-抗性基因氨苄青霉素抗性(Ampr)青霉素的衍生物;通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应,杀死生长的细菌氯霉素抗性(Cmlr)通过与 50S 核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成,杀死生长的细菌 四环素抗性(Tetr)通过与 30S 核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。链霉素抗性(Strr)

15、通过与 30S 核糖体亚基结合,导致 mRNA 错译。杀死细菌。HbmVN777sL卡那霉素抗性(Kanr)通过与 70S 核糖体结合,导致 mRNA 发生错读。杀死细菌4.人工构建的质粒载体的类型(1)高拷贝数的质粒载体:如 ColE1、pMB1,适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。V7l4jRB8Hs(2)低拷贝数的质粒载体:如 pSC101,不适合大量扩增 DNA 用;(3)失控的质粒载体:属温度敏感型复制控制质粒,如 pBEU1、pBEU2(4)插入失活型质粒载体:载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。(5)正选择的质粒载体:如 pUR2、pTR262;直接选择转化

16、后的细胞;目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体;只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。83lcPA59W9(6)表达型质粒载体:主要用来使外源基因表达出蛋白质产物7/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第7页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第7页第四章 分子基本操作技术*1、DNA 的提取方法:最常用的是碱抽提法。原理:1 闭合环状的质粒 DNA,在变性后不会分离,复性快;2 染色体线性 DNA 和或有缺口的质粒 DNA 变性后双 链分离,难以复性而形成缠绕的结构,与蛋白质 SDS 复合物结合在一起,在离心的时候沉淀下去。m

17、ZkklkzaaP步骤:溶菌破膜,蛋白质和 DNA 变性中和(用 NaAc)离心除去沉淀纯化 DNA(酚-氯仿抽提)沉淀 DNAAVktR43bpw2、三种电泳的区别和适用范围【*电洗脱槽 适用于回收大片段 DNA】琼脂糖凝胶电泳:(水平)分离范围广,分辨率低 脉冲电场凝胶电泳:适用于超大分子量的 DNA 电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳:(垂直)分辨力高,用于核酸,蛋白质分离,DNA 序列分析3、核酸的分子杂交:1)Southern blot【用 DNA(或 RNA)探针检测 DNA 样品】ORjBnOwcEd2)Northern blot【用 DNA(或 RNA)探针检测 RNA 样品】3)原位杂交

18、【对应的菌斑或噬菌斑位臵不变,可以直接找出阳性菌落】第六章 目的基因的获取和基因文库构建第一节 基因组 DNA 片断化1、限制性内切酶法:优点:由于带有粘性末端,产物可以直接与载体连接。缺点:目的基因内部也可能有该内切酶的切点,目的基因也被切成碎片。2、随机片断化:(1)限制性内切酶局部消化法;(2)机械切割法:超声波、高速搅拌8/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第8页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第8页3、化学合成目的基因方法:磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。化学合成 DNA 片断的组装方法:互补连接法、互

19、补延伸连接法4、寡聚核苷酸化学合成的优点:1直接合成基因;2合成引物(20mer 左右);3合成探针序列;4 定点突变合成;5 合成人工接头或衔接物。5、目的基因的获取方法:核酸杂交法、差示杂交法、PCR 筛选法、表达文库的免疫学筛选。2MiJTy0dTT第二节 基因文库构建1 基因文库:是用分子克隆方法将某种生物或其组织细胞的所有 DNA 片段插入适当载体,转化适当宿主菌后进行保存 的克隆集合。gIiSpiue7A2 构建步骤:1】染色体 DNA 大片段的制备:物理切割法:超声波、机械搅拌;酶切法:局部消化。2】载体与基因组 DNA 大片段的连接:粘性末端直接连接;人工接头法;同聚物加尾。构

20、建步骤:克隆载体制备-大分子基因组 DNA 分离-插入片段制备-插入片段与载体连接-连接产物宿主菌转化-基因组 DNA 文库生成。uEh0U1Yfmh3 基因组文库的大小:一个文库要包含 99%的基因组 DNA 时所需要的克隆数目。【p:文库包含了整个基因组 DNA 的概率(99%)f:插入载体的 DNA 片断的平均长度占整个基因 IAg9qLsgBX组 DNA 的百分数 N:所需的重组载体数(克隆数)】;9/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第9页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第9页【G 为基因组大小 f:基因组片段平均长度】4、cDNA

21、文库:利用某种生物的总 mRNA 合成 cDNA,再将这些 cDNA 与载体连接,转入细菌细胞中进行保存和扩增,称 cDNA 文库。以 mRNA 为模板逆转录出的 DNA 称cDNAWwghWvVhPE特点:1)不含内含子序列;2)可以在细菌中直接表达;3)包含了所有编码蛋白质的基因;4)比 DNA 文库小的多,容易构建。asfpsfpi4k构建步骤:1)总 RNA 提取(商业化的试剂盒 kit);(2)mRNA 的分离纯化(纤维柱,NaCl 洗脱)ooeyYZTjj13)cDNA 的合成:cDNA 第一链合成 降解 mRNA 模板 cDNA 第二链合成 去掉发卡结构 构建步骤:mRNA 的提

22、取-cDNA 克隆载体的选择-cDNA 克隆片段的获得-cDNA 文库的生成。BkeGuInkxIcDNA【p:文库包含了完整 mRNA 的概率(99%);1/n 低丰度(不足 14 份拷贝)mRNA 占细胞整个 mRNA 的比例;N:所需的重组载体数(克隆数)】PgdO0sRlMo第七章 基因的体外重组与转移1、粘性末端的连接:两段 DNA 的连接;DNA 片断与载体的连接2、平头末端的连接:(1)直接连接;(2)人工加尾形成粘性末端同聚加尾法-原理:DNA 末端转移酶能在没有模板的情况下给 DNA 的3-OH 端加上脱氧核苷酸 3cdXwckm15优点:能把任何片段连接起来。缺点:不能把插

23、入片段再切下来。衔接物(linker)连接-优点:可以用内切酶把插入片段切下来;能给载体连接上 Polylinker。h8c52WOngM10/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第10页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第10页缺点:如果插入片段内部也有该酶位点,不能切下完整的插入片段。DNA 接头连接法-优点:连上后就能用。缺点:接头与接头会彼此以粘性末端接在一起,影响与 DNA 片段的 连接。防止自我连接:先用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理接头,水解掉其 5端的磷酸,防止自我连接 v4bdyGious3、DNA 体外连接应注意的事项1】插入片

24、断与载体的酶切位点互补:(1)用相同的酶切(2)用同尾酶切2】DNA 插入的方向正确:用双酶切3】插入基因的开放阅读框(ORF)正确:(1)DNA 定向插入(2)起始密码4.防止载体自身环化连接:(1)用碱性磷酸酶处理线性载体分子(2)提高插入片断的用量(3)采用同聚物加尾连接技术(4)CIP 处理(5)使用同尾酶产生的黏性末端连接方法碱性磷酸酶的作用:防止载体自身环化连接,增加重组克隆的数目。5、载体和外源 DNA 插入片段的连接结果1.载体自身环化连接(能存活)2.载体之间互相连接(能存活)3.插入片段互相连接(不能存活)J0bm4qMpJ94.一个载体与几个插入片段重组(能存活)5.几个

25、载体与一个插入片段重组(能存活)第二节 基因转移1、感受态细胞:就是受体细胞处于摄入外源 DNA 的状态。(无特异性,对各种外来 DNA 都可接收)XVauA9grYP11/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第11页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第11页感受态大肠杆菌的制备 目的:增加受体菌细胞膜的通透性。制备原理:用CaCl 2 处理大肠杆菌,能增加膜的通透性 制备过程:培养大肠杆菌 OD600 至0.30.4冰浴 5-10 min 4离心收集菌用冰冷的 60mMCaCl2 重悬 4离心 收集菌用冰冷的 60mMCaCl2 重悬 On ic

26、e 30 min 4离心收集菌用冰冷的 60mMCaCl2 重悬分装、-70 冻存 2、外源 DNA 导入细菌的几种方法 bR9C6TJscw(1)转化 大肠杆菌捕获质粒 DNA 的过程。(2)转染 大肠杆菌捕获噬菌体DNA 的过程。(3)转导 借助噬菌体把外源 DNA 导入细菌的过程。3.转化方法:1)化学转化法;2)电转化法(转化效率高,高于 109/gDNA);3)热休克法(简单,但转化效率不高)pN9LBDdtrd4.转化率:每 g DNA 转化成功的细菌克隆数。影响转化率的因素:1)重组质粒(环形质粒数):1.环形重组质粒 2.质粒自我连接。(线性载体或 DNA 片断进入细菌会被降解

27、)DJ8T7nHuGT2)感受态细胞:生长状态(使用对数生长期的菌);必须在冰冷的条件下制备;储存感受态菌要在-70以下;CaCl2 处理,使细菌细胞膜失去一些蛋白;使用感受态菌时必须迅速融化(融化后一般不能再次冻存使用)QF81D7bvUA第八章 重组体克隆的筛选和鉴定一、抗药性标记及其插入失活选择法1.原理:pBR322 质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr 和 Ampr。Tetr 上有插入位点 BamH I 和 Sal I;Ampr 上有插入位点 Pst I。12/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第12页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-

28、第12页2、pBR322 抗菌素标记选择(1)四环素:抑制细菌生长,但不杀死细菌。(2)氨苄青霉素抗性基因:产生-内酰胺酶,使氨苄青霉素转变为青霉酮酸,使碘-青霉素指示液(蓝灰色)褪色。4B7a9QFw9h(3)环丝氨酸:杀死生长的细菌,但不杀死停止生长的细菌。*3、选择过程:(1)四环素抗性插入失活:如果在 Tetr 上插入外源 DNA,导致四环素抗性基因失活,可用四环素加环丝氨酸平板培 养基选择重组克隆。ix6iFA8xoXTetr 失活的菌生长被四环素抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;Tetr 不失活的菌抗四环素,能分裂生长,反而被环丝氨酸杀死。(2)氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果

29、 Ampr 上插入外源 DNA,导致氨苄青霉素抗性基因失活,可用碘-青霉素 指示液选择。wt6qbkCyDE二、-半乳糖苷酶显色反应选择法1.原理:载体上有一段-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的 片段(氨基端),其上有外源 DNA 的插入位点。受体菌基因组 中有突变的-半乳糖苷酶基因(片段缺失),可以被 IPTG 诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功 能的-半乳糖苷酶。2.选择过程中,-半乳糖苷酶使 Xgal 分解成兰色产物 Kp5zH46zRk假阳性:如果插入的外源 DNA 正好是 3 的倍数并且没有中止密码;(不破坏 肽)。13/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必

30、属精品)-第13页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第13页2、DNA 电泳检测法:直接电泳检测法;酶切电泳筛选法;PCR 扩增检测法;核酸杂交检测法;免疫化学检测法 核酸杂交检测方法:(1)Southern blotting:用 DNA(或 RNA)探针检测 DNA 样品 Yl4HdOAA61原位杂交筛选【对应的菌斑或噬菌斑位臵不变,可以直接找出阳性菌落】;R-环检测法【原理为 DNA-RNA 杂交;用外源基因的 mRNA 与重组载体杂交;缺点为需要电镜】ch4PJx4BlI(2)Northern blotting:用 DNA(或 RNA)探针检测 RNA 样品;主要检

31、测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取 RNA,再用探针杂交。qd3YfhxCzo3、免疫化学检测法:放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、Western 印记分析法。免疫沉淀检测法:检测分泌型产物;原理是抗原抗体凝集反应;TK 选择过程:HAT 培养基:次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基 宿主细:Tk-细胞株。载体标记:TK 基因。只有转入 TK 基因的细胞才能生存氯霉素乙酰转移酶(CAT):CAT 是由大肠杆菌转座子 Tn9 编码的,催化氯霉素发生乙酰化失活。选择条件:含氯霉素的完全培养基。宿主细胞:真核细胞株均可。载体标记:cat 基因CAT 分析方法:分析乙酰氯霉素;免疫学检查。第十章 外源

32、基因的表达1、外源基因:*最佳启动子必须具备的条件:14/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第14页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第14页 必须是一种强启动子;应呈现低水平的基础转录,便于表达毒性蛋白;应是可诱导型的。2、常用的表达载体:(1)非融合型表达蛋白载体 pKK223-3 具有一个强的 tac 启动子 条件:必须选择一个有 lacI 的宿主菌。E836L11DO5组成结构:强启动子:tac(trp-lac):trp 的-35 区 lacUV5 的-10区;操纵基因:乳糖操纵子系统 lac 操纵基因 调节基因宿主菌染色体上的乳糖操纵子

33、系统,如 JM105 菌;终止子:rrnB 的强终止子;S-D 序列和插入位点 区;载体的其余部分:来自 pBR322 质粒;表达诱导物:IPTG(乳糖的类似物,不会被降解)S42ehLvE3M(2)分泌型克隆表达载体 pIN 系统:以 pKK223 为基础构建的,调节基因不必借助宿主的 lacI.;直接分泌到固质中。载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起,可被宿主菌分泌到细胞周质中。如:pIN III 系列501nNvZFis组成结构:强启动子:Ipp(脂蛋白基因启动子)和 lacUV5 启动子;调节基因 lac I;S-D 序列和起始密码 ATG;分泌信号肽:大肠杆菌外膜蛋白基因

34、 ompa;插入位点区(多克隆位点)。jW1viftGw9pIN III-comA1 以 pBR322 为基础构建的。(3)融合蛋白表达载体 pGEX 系统 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。xS0DOYWHLP(1)优点:便于融合蛋白的分离和纯化15/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第15页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第15页(2)组成结构:启动子 tac 操纵基因 lacP 调节基因 lacI S-D 序列 ori:pBR322 oriLOZMkIqI0w融合肽:GST(谷胱甘肽巯基转移酶)3、影响外源基因

35、表达效率的因素:1】启动子的结构对表达效率的影响:(1)一致顺序 -35box-5-TTGACA-3 RNA 聚合酶 亚基的识别位点;-10box(Pribnow Box)5-TATAAT-3。ZKZUQsUJed(2)-35 与-10 区间的距离:间隔为 17bp 时,启动子最强;(3)-35 和-10区碱基顺序:越接近一致顺序,启动子越强。2】转译起始序列对表达效率的影响dGY2mcoKtT(1)S-D 序列:S-D 序列后面的 4 个碱基:如果是 A(T),翻译效率最高;如果是 G(C),效率只有 50%或 25%。rCYbSWRLIA(2)起始密码 AUG AUG 左侧的三个碱基也有影

36、响。-半乳糖苷酶的 mRNA中:AUG 左侧如果是 UAU 或 CUU 时,最为有效;如果是 UUC、UCA 或 AGG 时下降 20 倍。FyXjoFlMWh(3)其它 多顺反子的 mRNA 与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白 mRNA 的核糖体结合位点有 多个 U。TuWrUpPObX3】启动子与外源基因之间的距离4】转录终止区对表达效率的影响 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因,不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。5】载体拷贝数及稳定性16/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第16页(完整word版)基因工程知识点1(

37、良心出品必属精品)-第16页对表达效率的影响 增加载体的拷贝数会增加转录出的 mRNA 数目。增加表达效率。6】外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响7qWAq9jPqE第二节 外源基因在真核细胞中的表达酵母克隆载体:(1)整合型载体(YIp)由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片断(选择标记)构成。如 PYeleu10特点:转化率低(1-10 转化子/微克 DNA)。不能在酵母细胞中自主复制 载体上只有细菌的复制区,没有酵母的自主复制区。整合到酵母的染色体上 可与受体细胞的染色体 DNA 同源重组,随染色体一起复制。不能从酵母细胞中提取载体。llVIWTNQFk(2)复制型载体(YRp)由大肠

38、杆菌质粒和酵母的 DNA 片断(选择标记和酵母 DNA 自主复制顺序 ARS)构成。yhUQsDgRT1特点:转化率高(102-103 转化子/微克 DNA)。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。穿梭载体(shuttle vector)能在大肠杆菌中复制,又能在酵母细胞中自主复制。不稳定,容易丢失。MdUZYnKS8I(3)着丝粒质粒(YCp)在 YRp 质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。特点:行为像染色体,能稳定遗传。单拷贝存在。不易从细胞中提取。(4)附加体型载体(YEp)由大肠杆菌质粒、2m 质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。17/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-

39、第17页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第17页如 pYF92特点:很高的转化活性(103-105 转化子/微克 DNA).拷贝数多(25-100 分子/细胞)。比 YRp 稳定。09T7t6eTno第十一章 植物基因工程1、Ti 质粒:是根癌农杆菌染色体外/核外的一种闭合环状双链 DNA 分子,约 200 kb。类型:章鱼碱型(nos)、胭脂(ocs)、农杆碱型和农杆菌素碱型结构功能区域:(1)毒性区(Vir 区):该区段上的基因能激活 T-DNA 转移,使农杆菌表现出毒性,故称之为毒性区。T-DNA 区与 Vir 区在质粒 DNA 上彼此相邻,合起来约占 Ti 质粒

40、 DNA 的三分之一。e5TfZQIUB5(2)T-DNA 区 是农杆菌侵染植物细胞时,从 Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段 DNA,故称之为转移 DNA。该 DNA 片段上的基因与肿瘤的形成有关。NOC 是编码细菌利用胭脂碱的基因 s1SovAcVQM(TL-DNA)为 13 kb 的单拷贝序列,是诱发和维持肿瘤所必需的。(TR-DNA)为 7 kb 的多拷贝序列。GXRw1kFW5s(3)接合转移区(Con 区)(regions encoding conjugations):该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因(tra),调控 Ti 质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活 tra

41、基因,诱导 Ti 质粒转移,从而使肿瘤扩散。UTREx49Xj9(4)复制起始区(Ori 区):该区段基因调控 Ti 质粒的自我复制起始。2、T-DNA 转移至植物细胞的过程可分为:(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第18页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第18页1.农杆菌对植物细胞的识别和附着;2.农杆菌对植物信号物质的感受;3.农杆菌 vir 基因的活化;8PQN3NDYyP4.T-DNA 复合体的产生;5.T-DNA 复合体的转运;6.T-DNA 整合到植物基因组中。*植物受伤后能分泌酚类化合物诱导 Ti 质粒上的毒性基因表达。3、植物基因工

42、程载体命名规则:(1)天然存在的质粒第 1 个字母大写,并用括号括起来,如(ColE l)。(2)重组质粒用小写 p(Plasmid)后加两个大写字母表示:大写字母指构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机构,如:pSCl0l:SC(Stanley Cohen人名),pMT555:MT(Manchester Technology)曼彻斯特理工学院。mLPVzx7ZNw(3)农杆菌中的质粒一般在命名中要表示出来。如 pTiT37,Ti 表示根癌农杆菌,T37 表示质粒编号或分类。AHP35hB02d*1、请模仿多利羊的克隆过程,设计克隆大熊猫的方案,并回答相关问题.(1)从 A 大熊猫的主要性器

43、官-卵巢中取出一个卵细胞,去除细胞核.(2)从 B 大熊猫的体细胞中取出一个细胞,取出细胞中的细胞核.(3)将分离出的核注入无核卵细胞细胞内,融合成一个新的细胞.(4)用细胞培养技术,使融合的新细胞发育成胚胎.(5)将胚胎植入大熊猫 C(填 A、B、C)的子宫里.几个月后,该大熊猫可能分娩产下克隆大熊猫.NDOcB141gT(6)克隆大熊猫过程中,采用了核移植细胞培养胚胎移植等现代生物技术.*2、如何提高外源基因表达效率?19/23(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第19页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第19页答:选择强启动子序列,如 tac 等

44、;调整 S-D 序列与 AUG 碱的距离,一般为 5-9bp;1zOk7Ly2vA 提高质粒及 mRNA 的拷贝数和稳定性;高效的转录终止区和高效的翻译起始序列;减轻宿主细胞的代谢负荷:诱导表达 表达载体的诱导复制;提高表达蛋白的稳定性,防止其降解:克隆一段原核序列,表达融合蛋白(避免被降解的最好措施)采用某 种突变菌株 表达分泌蛋白质。fuNsDv23Kh答:提高启动子强度;缩短启动子与克隆基因间的距离;提高质粒拷贝数及稳定性;高效的转录终止区;高效的翻译起始序列;减轻细胞的代谢负荷:诱导表达 表达载体的诱导复制;提高翻译水平:调整 SD 序列与AUG 间的距离 用点突变的方法改变某些碱基

45、增加 mRNA 的稳定性;。提高表达蛋白的稳定性,防止其降解:克隆一段原核序列,表达融合蛋白(避免被降解的最好措施)采用某 种突变菌株 表达分泌蛋白质 tqMB9ew4YX*3、大肠杆菌表达外源基因的优劣势(劣势即为真核基因在原核生物表达需克服的障碍)。优势:1 基因克隆表达系统成熟完善;2 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定;3 全基因组测序,共有 4405 个开放型阅读框架;4 被美国FDA 批准为安全的基因工程受体生物。HmMJFY05dE(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第20页(完整word版)基因工程知识点1(良心出品必属精品)-第20页劣势:1 缺乏对真

46、核生物蛋白质的复性功能;2缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统,内源性蛋白酶降解空间构象 不正确的异源蛋白;3 细胞周质内含有种类繁多的内毒素。ViLRaIt6sk*4、Ti 质粒来自细菌(原核)系统,为何其基因能在真核生物中表达?证据 1:由 T-DNA 产生 mRNA 均是典型的植物 mRNA 分子,可通过植物 RNA聚合酶 II 被转录,并具有 5 帽子 结构和 3polyA 尾巴。9eK0GsX7H1证据 2:nos、ocs 等基因的 5末端具有真核特有的 TATA-box 和CAAT-box。naK8ccr8VI结论:T-DNA 的基因序列只能被真核生物识别,不能被原核生物识别。由此说明这些基因可以在真核细胞中表达,且只能在转化到真核细胞后表达。B6JgIVV9ao*5、现代生物技术(基因工程)的研究与发展的利弊。利:现代生物技术,特别是人类基因组计划的初步完成,标志着人类历史由认识客体、改造客体的时代转向认识主 体、改造主体的新时代;大规模生产生物分子;设计构建新物种;搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内 懂得遗传信息资源。P2IpeFpap5弊:克隆技术会带来社会伦理方面的问题;转基因技术的大范围应用会产生基因污染,增加基因遗传病的犯病风 险;宗教界人士、素食主义者及动物保护组织的反对 3YIxKpScDM本文档来源于第一文库网：https:/