基因工程大实验报告 (终稿).pdf

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1、内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文分类号:Q78编号:本科生基因工程实验论文本科生基因工程实验论文纳豆激酶纳豆激酶基因表达载体的构建及在基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达指导教师：指导教师：X X X X X X学学生：生：X XX X专专业业：生生 物物 科科 学学年年级级：2 20 00 09 92012 年 8 月 24 日内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文目目录录摘要.2绪论.3材料与方法.41 材料.41.1 试剂及仪器.41.2 菌种.51.3 质粒.51.4 常用溶液的配制.52 方法.62.1 引物的设计.62

2、.2 NK 基因的 PCR 扩增.72.3 DH5a 和 BL21(DE3)感受态的制备.72.4 pMD19-T-NK 的构建及转化和鉴定.82.5 pET-trx、pET-NK、pUC-Nk 的酶切与回收.92.6 pET-trx-NK 的构建及转化和检测.112.7 pET-trx-NK 的诱导表达.122.8 pET-trx-NK 表达的 SDS-PAGE 检测.13结果.151.NK 基因的 PCR 扩增.152.pMD19-T-trx 的构建与鉴定.163.pET-trx、pET-NK、pUC-Nk 的酶切与回收.164.pET-trx-NK 的构建与检测.185.pET-trx-

3、NK 的诱导表达与 SDS-PAGE 检测.19讨论.20参考文献.21致谢.21感想.221内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达摘要摘要纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶。经研究发现纳豆激酶具有纤溶活性和溶栓能力,可治疗和预防血栓病。此外，纳豆激酶还具有降低血液黏度、降血脂、降胆固醇,改善血液循环状况,维持血细胞的正常形态和功能等作用。本文主要介绍利用基因工程实验技术操作纳豆激酶基因，将已经连接在 pMD18-T 载体上的纳豆激酶酶源基因用 PCR 扩增出 837bp 的纳豆

4、激酶的基因片段，与 T 载体连接后导入感受态的 DH5菌中筛选鉴定。用双酶切切下纳豆激酶的成熟基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-trx，导入 BL(21)DE3 感受态菌中诱导表达纳豆激酶蛋白质，用 SDS-PAGE 鉴定。关键词关键词：纳豆激酶，基因表达，载体，大肠杆菌Constructing Expression Vector and ExpressingConstructing Expression Vector and Expressingnattokinasenattokinase in in E.coliE.coliABSTRACTABSTRACTNattoki

5、nase is a kind of subtilopeptidase.The study found that Nattokinasehas activity of fibrinoltic which can treat and prevent thrombosis.In addition,Nattokinase can also lower blood viscosity,blood fat,cholesterol,improve bloodcirculation and maintain normal blood cells form and function and so on.Main

6、 ofthis article describe the gene engineering operation in nottokinase gene which hasalready connected with pMD-18-T vector amplified by PCR in which can get837bp nattokinase gene fragments,then linking with T vector that transform itinto DH5 bacteria which were screened after identification.The mat

7、ure peptidecan be cutted by double-digested and insert with six histidine-tagged prokaryoticexpression vector pET-trx.At last,induced the protein expression of nattokinasein the expression of E.coli BL(21)DE3.Eventually,identify that by SDS-PAGE.KEY WORDSKEY WORDS:nattokinase,gene expression,vector，

8、E.coli2内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文绪论绪论：纳豆激酶(nattokinase 简称 NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种具有强烈纤溶活性的碱性丝氨酸蛋白酶1。纳豆激酶是食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产的分子量小的单链蛋白质。由于纳豆激酶具有纤溶作用强，作用迅速，药效时间长；来源于食品，安全性能好，更易被人体消化吸收。可通过静脉与口服两种途径给药以及不引起出血的副作用等第一代溶栓药物所不具备的优点，使其具有开发成新一代溶栓药的潜力。纳豆激酶于 1987 年由日本学者

9、 sumi 在纳豆中发现。其成熟肽含有 275 个氨基酸，分子量约为 28ku，等电点为 8.60.3。从纳豆中分离和纯化出一种蛋白激酶 L 这种酶具有很好的溶栓作用,是一种枯草杆菌的发酵产物,为丝氨酸蛋白酶类,称其为(nattokinase)L由 275 个氨基酸组成分子量为 27kD,等电点为 8.160.13L 这种酶与其它溶栓药相比,除具有较强的溶栓作用外,还具有体内作用时间长,无毒无副作用等优点。2我们用 PCR 方法克隆纳豆激酶基因，并重组到表达载体上进行了初步表达及表达产物经研究，纳豆激酶具有水解纤维蛋白的作用，它具有严格的限制性酶切位点，可直的活性测定,为用基因工程菌生产纳豆激

10、酶奠定基础。接作用于交联纤维蛋白，使其水解成可溶性的小分子，从而达到直接溶解血栓的作用。3提取纯化纳豆激酶，与交联的纤维蛋白酶解，发现不同时间降解交联纤维蛋白片段大小不同，出现 1413kD、36kD、和 41 kD 不同大小的片段，从而白哦名纳豆激酶具有直接降解血栓的作用。纳豆激酶活体内尿激酶原转化为尿激酶，从而增加纤维酶的活性，进一步加强它的溶栓作用；纳豆激酶刺激血管内皮细胞产生内源t-PA，t-PA 催化纤溶酶原转变纤溶酶，以使积累的纤维蛋白或血栓溶解；纳豆激酶通过降解好识货纤溶酶原激活剂的抑制剂（PAI-1）调控纤溶作用。4纳豆中含有 100 种以上的酶,碱性蛋白酶和 A-淀粉酶易将纳

11、豆中蛋白质分解便于人体消化吸收,弹性蛋白酶(Elastase)和植酸酶(Phytase)目前已被从纳豆中提取生产应用于食品及其它工业中。5纳豆激酶具有防治心脑血管栓塞、抗致病菌、防癌、抗癌、阻止动脉粥样硬化、抗氧化、延缓衰老等多重作用，因此，纳豆激酶成为现在一项热点研究项目。据统计,目前美国每年有 15 万人死于中风，在我国，每年死于冠心病者约 60 万人，死于脑梗塞，脑溢血者 120 万人，约有 80%病例是由于血栓引起而导致突发性恶果。6而纳豆激酶因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血管栓性疾病，与其他溶栓药物相比，具有安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可口服、半衰

12、期长、生产价格低廉等优点，极有可能成为新一代李晓你哥的预防和治疗栓塞的新型药3内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文物，将为解决莫倩血栓溶解药物口服性差、价格昂贵、并发症多等问题带来更多希望。综上所述,我国学者对纳豆激酶基因的克隆、表达及表达产物的活性方面进行了深入系统的研究,已经初步能够利用基因工程菌生产纳豆激酶样品。但是对于基因工程菌的发酵工艺、表达产物的分离纯化工艺、表达产物的产量及收率方面仅进行了一些探索性研究,要想实现利用基因工程菌工业化生产纳豆激酶,还需更加深入的研究。材料与方法材料与方法1.1.材料材料1.11.1 试剂、仪器及实验用具试剂、仪器及实验

13、用具1.1.11.1.1 仪器仪器台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，气浴振荡摇床（不需加水），制冰机（GRANT），超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司），微波炉和电磁炉，电泳仪（北京市六一仪器厂，DYY-11 型电泳仪）和电泳槽，电子分析天平（德国 Sartorius 公司），恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂出品，HSH 型），紫外分光光度计，PCR 仪（Biometra 华粤企业公司），通风橱，三用紫外分析仪，恒温细菌培养箱，凝胶成像仪，高压蒸汽灭菌锅（日本 HIRAYAMAHVE-50 高压灭菌锅）。1.1.21.1.2 实验用具实验用具超净工作台，玻璃涂布棒，酒精灯

14、，双面微量离心管架，试管架，记号笔,手表，摇菌试管，1.5mL 离心管，0.5mL 微量离心管，枪头（010uL，20200uL，2001000uL），100mL 三角瓶，250mL 三角瓶，凝胶成像系统，一次性薄膜手套等,0.2mLPCR 微量管，泡沫塑料保温盒，培养皿，琼脂糖凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块,垂直电泳槽及配套的玻璃板、夹子、密封条、梳子。1.1.31.1.3 试剂试剂LB 培养基，氨苄青霉素储存液，无菌 ddwater，100mg/mL（M/V）IPTG，20%葡萄糖，1.0mol/L Tris HCl（pH8.8），0.5mol/L Tris HCl（pH6.8），10%SD

15、S，30%Acr/Bis，10%Aps，2上样缓冲液，TEMED，低分子量蛋白分子量 Marker，考马斯亮蓝染色液，5 X 电泳缓冲液，20%（M/V）IPTG，2%（M/V）X-gal，50 X TAE 电泳缓冲液，溴化乙锭储存液，10加样缓冲液，6加样缓冲液，DNA 分子量 Marker，电泳级琼脂糖粉，3U/L Taq DNA 聚合酶，10PCR 缓冲液（MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP 混合液，10mg/mLRNase A，TE 缓冲液，95%和 70%乙醇，EcoR I 和 BamH I 限制性内切酶，10内切酶缓冲液，0.1 mol/L CaCl2溶液，T4

16、 DNA 连接酶，连接酶缓冲液。4内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文1.21.2 菌种菌种带有 pET-trx 质粒载体DH5菌,带有pMD18-T-NK载体的DH5菌，E.coli DH5，E.coli BL21（DE3）。由基因工程实验室提供。1.31.3质粒质粒1.3.1 目的基因所在质粒：pMD-18T-NK1.3.2 表达载体：pET-trx1.4.4常用溶液的配制常用溶液的配制1.4.11.4.1氨苄青霉素储存液：无菌水配制 100mg/mL，分装后-20C 保存。1.4.21.4.2 LB 培养基：胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 1

17、0g，加 200mL ddwater搅拌完全溶解，用约 NaOH 调 pH 至 7.0，加 dd water 至 1L，分装 4 个 200ml和 2 个 100ml,121 20min 灭菌。使用时可加入氨苄青霉素，终浓度 100ug/mL。1.4.31.4.3溶液（NaOH/SDS 溶液）：0.2mol/L NaOH，1%SDS,现用现配。5内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文1.4.41.4.4 50 TAE 电泳缓冲液（pH 约 8.5）：Tris 碱 242g,57.1ml 冰乙酸，37.2gNa2EDTA2H2O，dd water 定容至 1L。使用时

18、稀释成 1。1.4.51.4.5琼脂糖凝胶：称取 0.25g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入25ml 1TAE 电泳缓冲液（注意原液是 50，按照 1:49 的比例稀释），用保鲜膜盖住，放入微波炉里烧开（30 s），取出观察，若无颗粒则置于桌面上冷却至不烫手即可灌胶，若仍然有颗粒状物，需要再继续加热，直至无颗粒后冷却灌胶。1.4.61.4.6 1.0mol/L Tris HCl pH8.8：称取 12.1g Tris 碱,加 50mL 蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至pH8.8（约加 8mL）。让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至 pH8.8，加蒸馏水至 100mL。高温高压灭菌后 4保存。1.4.

19、71.4.7 0.5mol/L Tris HCl pH6.8：称取 6.05g Tris 碱溶于 40mL 蒸馏水中，加约 48mL1mol/L HCl，让溶液冷却至室温，再用 HCl 调至 pH6.8，加水稀释到 100mL 终体积。高温高压灭菌后 4保存。1.4.81.4.8 30%Acr（丙烯酰胺）/Bis（N,N-亚甲基双丙烯酰胺）：30g Acr+0.8g Bis，用 dd water 定容至 100mL，4C 棕色瓶避光保存（现用现配）。1.4.91.4.9 10%Aps（过硫酸铵）：蒸馏水配制，-20保存。过硫酸铵会缓慢分解，一周内使用完。1.4.101.4.10上样缓冲液：0.

20、5mol/L Tris HCl pH6.8 2mL，甘油 2mL，20%SDS 2mL，0.1%溴酚蓝 0.5mL，-2-巯基乙醇 1.0mL，dd water 2.5mL，室温存放。1.4.111.4.11电泳缓冲液：Tris 7.5g，甘氨酸 36g，SDS2.5g，加 ddwater 至 500mL。使用时稀释 5 倍。1.4.121.4.12考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝 R250 0.25g+45mL 甲醇+10mL 冰醋酸，用ddwater 定容至 100mL。1.4.131.4.13 LB 平板培养基：LB 培养基中含 1.2%（1.2g/100ml）琼脂，高压灭菌后加入氨苄青霉素

21、至 100g/mL，每个培养皿中约 20mL 倒制平板。2.2.方法方法2.12.1设计引物设计引物PCR引物：上游引物（PDU，5端带BamHI酶切位点）：5-GGATCC ATG GCC TCC TCC GAG AAC-3下游引物（PDL，5端带EcoRI酶切位点）：5-GAATTC TAC AGG AAC AGG TGG TG-36内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文2.2 NK2.2 NK 基因的基因的 PCRPCR 扩增扩增2.2.1由老师提供 pMD-18-T-NK 质粒进行 PCR 扩增。2.2.2在 0.2mL PCR 微量离心管中按下列剂量配制

22、50L 的 PCR 反应体系。PCR 体系PCR Supermix模板质粒Primer1Primer250L（总）45L1L（稀释 2050 倍）1L1L2Ldd water2.2.3设置 PCR 仪的循环程序：94 5min 94 30s循环 3030 次 60 30s 72 1min 72 10minPCR总时间需要1h50min。PCR结束后，取5l产物进行琼脂糖凝胶泳。观察是否有预计分子量的主要产物带。注：退火温度NK：60红色荧光蛋白：51绿色荧光蛋白：612.32.3DH5DH5和和 BL21(DE3)BL21(DE3)感受态的制备感受态的制备2.3.1取 2 个 1.5mL 预冷

23、 10 min 的无菌微量离心管，做上相应标记。2.3.2其中一管加入 1.0mL BL21(DE3)菌液，另外一管加 1.0mL DH5 菌液，然后在冰上放置 10min，5000r/min 4 离心 10min，弃上清。2.3.3加入 1ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中静置 30min。2.3.3 4，5000r/min 离心 10min。弃上清液后，用 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液重悬菌体，插入冰中放置 30min。2.3.4 4，5000r/min 离心 10min。弃上清液后，用 200uL 冰冷的 0.1 mo

24、l/L CaCl2溶液重悬菌体。7内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文2.3.5在超净工作台内将两种菌按 50ul/管分装在 1.5ml 管内，放于 4冰箱待用。2.4 pMD19-T-NK2.4 pMD19-T-NK 的构建及转化和检测的构建及转化和检测2.4.1 PCR 产物(NK)与 pMD-19-T（PCR 2.1）载体直接连接阳性 PCR 产物与 pMD-19-T 载体（PCR 2.1）连接。在离心管中加入：pMD-19-T连接反应体系10 xlink bufferPCR 2.1vectorPCRProductT4 DNA Ligase10L（总）1L2

25、L2L1L4LDd water在干式恒温气浴中 14，连接 3 h。2.4.2感受态细菌的转化2.4.2.1将恒温水浴的温度调节到 42。2.4.2.2从 4 冰箱中取出感受态菌，冰浴 7min。2.4.2.3取 5 uL 连接好的质粒与感受态细菌 DH5a 混匀，在冰上放置 20min。2.4.2.4于 42水浴中 90S 进行热休克，然后在冰中放置 4 min，在超净台上加入 300uLLB 培养基（不含氨苄青霉素不含氨苄青霉素），37振荡培养 45 min。2.4.2.5超净台上取上述转化的混合液 150L、200L 于新的 1.5ml 的离心管中，加入 40L 20%x-gal，7L

26、20%IPTG 混匀。2.4.2.6将上述菌液用涂布棒均匀的涂布在 Amp+LB 的固体培养基上，37恒温培养过夜。2.4.3 pMD-19-T-NK 的鉴定（提取质粒使用 Axygen 试剂盒）2.4.3.1观察菌落生长状态，用 10uL 枪头挑取 3 个白菌落分别置于含 1.7mL LB 培养基中，37摇菌培养 8h。2.4.3.2分别取 1.4mL 的菌液于 1.5mL 离心管中，10000r/min 离心 1min，弃上清。2.4.3.3加 250ul Buffer S1 悬浮细胞沉淀。2.4.3.4加 250ul Buffer S2 温和上下翻转 6-8 次，12000r/min 离

27、心 10min。2.4.3.5吸取上步中离心上清液并转移到制备管，12000r/min 离心 1min，弃滤液。2.4.3.6将制备管置回离心管，加 500ul Buffer W1，12000r/min 离心 1min，弃滤液。2.4.3.7将制备管置回离心管，加 700ul Buffer W2，12000r/min 离心 1min，弃滤液。8内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文2.4.3.8方法同上制备离心管，加 700ul Buffer W2，12000r/min 离心 1min，弃滤液。2.4.3.9将制备管置回 2ml 离心管，12000r/min 离心

28、1min。2.4.3.10将制备管移入新的 1.5ml 离心管中，在制备管中加 60-80ul Eluent，加热至65后，室温静置 1min，12000r/min 离心 1min。2.4.3.11电泳检测：以蓝菌落作对照，电泳检测 T4-NK 是否连接并转化成功。2.5 pET-trx2.5 pET-trx、pET-NKpET-NK、pUC-NkpUC-Nk 的酶切与回收的酶切与回收2.5.1提取 pET-trx、pET-NK 及 pUC-NK 的质粒（小提质粒 Axygen 试剂盒）2.5.1.1取菌液 10000r/min 1mim 离心，弃上清。2.5.1.2向吸附柱 cp3 中加入

29、500L 的平衡液 BL，12000r/min 1 min，弃废液。2.5.1.3将菌体沉淀的离心管中加入 250L 的溶液 P1 进行悬浮。2.5.1.4离心观众加入 250L 的 P2，将离心管温和上下翻转 6-8 次，混匀，使菌液达到清亮粘稠。（此步不超过 5min）。2.5.1.5离心管中加入 350L 的 P3，温和翻转 6-8 次，混匀，12000r/min 10min。2.5.1.6将上清转移到吸附柱 cp3 中，12000r/min 60s，弃废液。2.5.1.7 cp3 中加入 600L 漂洗液 pw（无水乙醇），12000r/min 60s。弃废液。2.5.1.8重复上步。

30、后 12000r/min 2min 离心。弃废液。2.5.1.9将吸附柱在新的离心管中，向膜中心滴加 100L 洗脱 buffer EB，放置 2min后，12000r/min 2min 离心。2.5.1.10琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的质量。点样顺序 1-7 孔分别为张婷组酶切产物、pET-NK（广）、pUC-NK（广）、pET-trx（广）、pET-NK（田）、pUC-NK（田）、pET-trx（田）。2.5.2 pET-trx、pET-NK、pUC-NK 双酶切2.5.2.1 pET-trx 质粒 DNA 双酶切体系：pET-trx 质粒 DNA 双酶切体系：pET-trx 质粒EcoR

31、 IBamH I10K Buffer40L（总）20L(更具所提质粒浓度确定)1.5L1.5L4 L13L9Dd water内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文2.5.2.2 pET-NK 质粒 DNA 双酶切体系：pET-NK 质粒EcoR IBamH I10K BufferpET-NK 质粒 DNA 双酶切体系40L（总）20L(更具所提质粒浓度确定)1.5L1.5L4 L13LDd water2.5.2.2 pUC-NK 质粒 DNA 双酶切体系：2.5.3 pET-trx、pET-NK、pUC-NK 胶回收2.5.3.1用 1TAE 和琼脂糖配制 1%回收

32、胶。2.5.3.2从恒温水浴锅中取出酶切产物，分别加入 4uL 的 10 Loading Buffer终止反应，并混匀。2.5.3.3选择 13 个相邻的点样孔，按顺序分别加入 pET-trx 空质粒，pET-trx 大片段（小样），pET-trx 大片段（大样-广），pET-trx 大片段（大样-田），菌落质粒，PCR产物，pET-NK（小样）、pUC-NK（小样），空泳道空泳道，pET-NK（大样-广），pET-NK（大样-田），pUC-NK（大样-广），pUC-NK（大样-田）2.5.3.4电泳结束后用电话卡将含有大量酶切产物的泳道切下，EB 染色含小样的胶块。在紫外灯下找到目的 DNA

33、 带，用刀片在目的 DNA 带的下上下边缘各切一个小口作为标记。2.5.3.5将做好切口标记的凝胶与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记估计未染色的胶块上大样的 DNA 酶切产物的位置。10pUC-NK 质粒 DNA 双酶切体系pUC-NK质粒EcoR IBamH I10K Buffer40L（总）20L(更具所提质粒浓度确定)1.5L1.5L4 L13LDd water内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文2.5.3.6用刀片切下大胶中 DNA 产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），分别转移至一个事先称量过的、灭活的 1.5mL 微量离心管中。再称量后计算

34、出其中胶块的重量。2.5.3.7再用 EB 染色切除 DNA 以后的大胶，与小胶条并在一起在紫外灯下检查是否已把 DNA 带切走。2.5.3.8按照 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收 DNA 酶切产物。2.5.3.8.1向吸附柱 CA2 中加入 500L 的 BL，12000r/min 1min 离心，弃废液，将吸附柱从新回收到收集管中。2.5.3.8.2将单一的目的 DNA 条带胶块的离心管中加入 600L 的溶胶剂。2.5.3.8.3在 60水浴锅中放置 10 min，中间隔 2-3 min 轻晃几次，确保胶体完全融化，没有胶体颗粒剩余。2.5.3.8.4在溶胶过程中，平衡柱子，取

35、 6 个有膜的 ep 管，加入 500L 的平衡液 BL，12000r/min 1min 离心。2.5.3.8.5待溶胶好后，静止2min（由于温度过高，平衡柱结合DNA 能力较弱），12000r/min,离心 60s。2.5.3.8.6上柱，离心后，弃废液。想 cp 柱中加入 600L，漂洗液 pw，12000r/min 60s。弃废液。2.5.3.8.7重复上步。弃废液，12000r/min，2min，弃废液。开盖放置，彻底晾干。2.5.3.8.8将 CA2，加入新的 ep 管中，先加入洗脱缓冲液 EB 350L，放置 2min。12000r/min 2min。收集 DNA 洗脱液。2.5

36、.3.9 pET-trx NK gene 胶回收电泳验证点样孔样品1pET-trx 质粒2pET-trx 大片段（广）3pET-trx 大片4pET-NK（广）5pET-NK（田）6pUC-NK（广）7pUC-NK（田）段（田）2.6 pET-trx-NK2.6 pET-trx-NK 的构建及转化和检测的构建及转化和检测2.6.1 pET-trx-NK 的构建（1）提前将干式恒温仪（或泡沫塑料保温盒里的水）温度调整到 14。（2）取一个高压灭活的 0.5mL 微量离心管，加入如下连接体系：11内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文pET-trx-NK 连接体系pET

37、-trx 回收 ProductNK 回收 Product10 x Ligation BufferT4Ligase10L（总）1L(根据所提质粒浓度确定)3L1L1L4LDd water将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于 16水中保温过夜连接。2.6.2 pET-trx-NK 转化 BL21（DE3）2.6.2.1将恒温水浴的温度调到 42。2.6.2.2从 4冰箱中取出一管 BL21(DE3)感受态菌，插入冰上。2.6.2.3加入 5L 连接好的 pET-trx-NK 质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上 25min。2.6.2.4轻轻摇匀后插入 42水浴中 90s 进行热休克，然后迅速放回

38、冰中，静置 5 min。2.6.2.5在超净工作台中向上述管中加入 300uL LB（不含氨苄青霉素）培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上 37震荡 45min。2.6.2.6在超净工作台中取上述转化混合液 300ul，混匀后滴到含合适抗菌素(Amp+)的固体 LB 平板培养皿中。从酒精中取出玻璃涂布棒，在火上点燃，熄灭后稍等片刻，待其冷却后轻轻涂布均匀。选两组不同条件进行对照对照 1对照 2100L200L37恒温培养箱室温2.6.2.7在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37恒温培养箱中约 30min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入 37恒温培养箱中培养过夜。2.72

39、.7pET-trx-NKpET-trx-NK的诱导表达的诱导表达2.7.1观察平板上菌落生长状态，发现少数，不明显的菌落散布，由于菌落的数量过少，故用其他小组的菌落进行扩培。2.7.2将 LB 培养基分装到 100ml 的三角瓶中，后加入氨苄青霉素（100mL/100L）。2.7.3将加好（Amp+）的 LB 培养基分装到灭菌的试管中 1.6mL/管2.7.4挑菌，37.4摇床中，进行摇菌扩培。12内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文2.7.5质粒提取使用 Axygen 试剂盒，步骤与 2.5.1 小提质粒相同。2.7.6提质粒后进行电泳检测。2.7.7将 LB

40、培养基配制成含 0.2%的 LB-葡萄糖培养基（Amp+浓度为 120g/ml，即100ml/120l 的比例加入 Amp+）2.7.8将正确的质粒对应的菌液加入 6ml 的 LB-葡萄糖培养基培养基 30，慢摇过夜。2.8 SDS-PAGE2.8 SDS-PAGE 检测检测 pET-trx-NKpET-trx-NK 的表达的表达2.8.1电泳槽的组装及配胶2.8.1.1 组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面，然后用夹子夹住玻璃两侧的中央部位。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部 1cm 处做一个标记。拔掉梳子，倒入自来水检验是否漏水。如不漏水，弃掉自来水后在卫生纸上倒置片刻，尽可能流尽水份。2

41、.8.1.2 配制 10%分离胶：按顺序和量取下列溶液混在一个 50mL 的小烧杯中：Acrylamide-Bis 3.96ml1M Tris(pH8.8)4.38ml dd water 3.432ml10%SDS 118.8LTEMED 9.9L10%APS 118.8L2.8.1.3 加完 TEMED 后拿起烧杯轻轻转动几下底部，将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。2.8.1.4 在胶液面上部用 1000uL 微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满 dd water。静置约 30min。直到烧杯中剩余的胶液凝固。倒出蒸馏水。2.8

42、.1.5 配支持胶：按顺序和量取下列溶液混在一个 50mL 的小烧杯中：Acrylamide-Bis 0.675ml0.5M Tris(pH6.8)0.563mldd water 3.165ml10%SDS 45LTEMED 7.5L10%APS 45L2.8.1.6 加完 TEMED 后拿起烧杯轻轻转动几下底部，将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝13内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约 20min。烧杯中剩下的胶液倾斜放置，直到其中的溶液凝固。2.8.1.7 去掉橡胶管，将装有胶的玻璃和梳子翻转,贴在电泳槽侧面，用

43、夹子把玻璃两边的中部与电泳槽中部夹在一起。2.8.1.8 在上面的槽中加满自来水试验一下是否漏水，然后倒掉自来水。2.8.1.9 配制 1X 加样缓冲液 400mL，从上面的电泳槽倒入，若不从下面的电泳槽漏水，则加满缓冲液，在将下面的电泳槽也加满电泳缓冲液，小心缓慢地拔出梳子。2.8.2外源基因的诱导表达2.8.2.1超净台中接种 pET-trx-NK 的 BL21（DE3）菌 空 pET-trx 转化 BL21（DE3）菌 BL21（DE3）空菌。37摇菌。2.8.2.2 IPTG（测 OD600 =0.4 0.6 即能诱导表达）编号稀释前 OD6000.7280.7720.667稀释后 O

44、D6000.4810.5100.480100g/mL（0.5L/mL）IPTG不添加 IPTG2.8.2.3 150-170r/min 摇菌，设置浓度梯度和时间梯度对比。编号加 ITPG 量1.5 L2 L-12L1.5 h2.0 h3.0 h摇菌时间2.5 h2.5 h2.5 h-2-3注：其中、菌形成等时间的浓度梯度对照，-1、-2、-3 菌形成等浓度的时间梯度对照。2.8.3各取 1.5ml 菌液及未加 IPTG 诱导的菌液 4000rpm 离心 15min，弃上清，收获菌体。将表达后的菌体与 2上样缓冲液按 1:1 混匀于微量离心管中，用 20ulddwater 重悬菌体，加入 20u

45、l 的 2加样缓冲液，煮沸 5min。2.8.4电泳泳道设计 1-10 泳道加样顺序依次为：marker、无 IPTG 空菌 BL21（DE3）、IPTG 空菌 BL21（DE3）、-1、-2、-3、无 IPTG pET-trx-NK。14内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文2.8.5电泳时，10 mA 恒流,120V 电压电泳。直至到条带到支持胶处，改为 20 mA点流，120V 电压电泳。2.8.6染色考马斯亮蓝染色 30min，流水冲掉染料后脱色液脱色 1h，去离子水浸泡过夜。实验结果与分析实验结果与分析1.1.NKNK 基因的基因的 PCRPCR 扩增扩增

46、将实验室提供的 pMD-18-T-NK 质粒进行 PCR 扩增，在 30 个 PCR 循环中，得到 NK 基因的扩增片段，进行琼脂糖凝胶电泳得到图 1 的电泳图。M12345M图 1：pMD19-T-NK基因的 PCR 扩增产物电泳检测注：M:DL2,000TM DNA Maker1-5：NK 的 PCR 产物200010007505002501001.1点样孔 2-5 中，点样的顺序依次为刘杭州组的 NK PCR Product、我组的 NK PCRProduct、我组的 NK PCR Product 阴性对照，田文嘉组的 NK PCR Product、田文嘉组 NK PCR Product

47、 阴性对照。1.2分析：其中我组没有 NK PCR Product。1.2.1在加 PCR 体系的过程中，由于许多小组一起混用 Primer1 和 Primer2，不能避免有污染的可能性。1.2.2 PCR 体系加样过程中，在离心管上所做的标记已经模糊，不能排除体系加混乱的可能性。15内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文2.2.pMD19-T-NKpMD19-T-NK的构建及转化和检测的构建及转化和检测 2.1用已经扩增好的 PCR 产物(NK)与 pMD-19-T（PCR 2.1）载体直接连接。并将连接好的 pMD19-T-NK 质粒导入 DH5感受态菌中，进行

48、诱导鉴定。将转化的 DH5感受态菌，摇菌培养后涂平板。涂到 LB(Amp+)的固体培养基中，过夜培养，进行蓝白斑鉴定。2.2分析：整个大组都没有培养出菌落2.2.1 pMD-19-T 载体是有实验室提供，而且全部试验小组菌未有蓝白菌落的出现。所以不能排除，pMD-19-T 载体质粒出现了问题。2.2.2在加入 LB 培养基，进行摇菌培养时，LB 培养基出现问题，即在摇菌时使用的是LB（Amp+）的培养基。由于 pMD-19-T-NK 刚导入 DH5感受态菌中，导入量很小，能够抗 Amp+的菌中很少，所以用LB（Amp+）的培养基，摇菌会使大量的菌体死亡而导致涂平板时，没有菌落生成。3.pET-

49、trx3.pET-trx、pET-NKpET-NK、pUC-NkpUC-Nk 的酶切与回收的酶切与回收3.1 pET-trx3.1 pET-trx、pET-NKpET-NK、pUC-NkpUC-Nk 质粒提取电泳鉴定质粒提取电泳鉴定上一步中，整体大组没有转化得到所需要细菌，无法直接提取质粒，老师提供之前实验室保存的菌种 pET-trx、pET-NK、pUC-NK 进行质粒的提取，然后电泳鉴定。pET-NKpET-trxpUC-NK1234567图 2：pET-trx、pET-NK、pUC-Nk 质粒提取电泳鉴定注：本次电泳未用 Marker 对照。1 泳道：其他组提取物；2-7 泳道：为提取的

50、质粒。16内蒙古大学生命科学学院生物系 2012 年本科生基因工程大实验论文根据 pUC-NK、pET-trx、pET-NK 的 DNA 链的长度分别为 3.6Kb、3.3Kb、4.1Kb，进行组内对比，分析三种质粒电泳条带所处的位置，可得出三种质粒提取物，是正确的。3.2 pET-trx3.2 pET-trx、pET-NKpET-NK、pUC-NKpUC-NK 胶回收胶回收对所提取的三种质粒进行双酶切，过夜后进行电泳胶回收，质粒 DNA。12345678910111213图 3：pET-trx、pET-NK、pUC-NK 胶回收电泳图注：1-2 泳道：pET-trx 质粒、pET-trx 大