生物检测技术（第二版）第五章电子课件 .ppt

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1、生物检测技术（第二版）第五章电子课件【知识目标】掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理及操作要点。掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及操作要点。理解双向电泳的基本原理及操作方法。掌握纸电泳的基本原理及操作步骤。理解毛细管电泳的基本原理及应用。【能力目标】能较好地利用电泳检测技术检测蛋白质、。能根据实际需求选择相应的电泳检测技术对待测物进行检测。第一节 电泳检测技术总论 一、电泳检测技术介绍电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。一般用于生物大分子物质核酸、蛋白质等的检测。二、电泳检测技术的原理许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动

2、，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。三、电泳的分类按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：滤纸及其他纤维（如醋酸纤维、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电泳；粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳；凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳等；丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式；垂直板式电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳；垂直柱式电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳

3、即属于此类；连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直。第二节 琼脂糖凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是，连结的 半乳糖和，连结的，内醚 半乳糖交替连接起来的长链多糖聚合物。琼脂糖在水中一般加热到 以上溶解，温度下降到 时形成良好的半固体状物质即为琼脂糖凝胶。琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。琼脂糖冷却后成为孔径范围从 到大于 的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛

4、作用，该电泳技术是目前分离、分析 片段的标准方法。二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，主要用于核酸（和）、少部分蛋白等生物大分子的检测。三、核酸琼脂糖凝胶电泳的检测原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为 .，在常规的电泳缓冲液中（约.），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。四、影响核酸琼脂糖凝胶电泳的主要因素（一）核酸的分子大小线状双链 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 分子质量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难以在凝胶孔

5、隙中移动，因而迁移得越慢。具体如图 所示。（二）核酸分子的构象当 分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子质量有关，还和它本身构象有关。相同分子质量的线状、开环和超螺旋质粒 在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋 移动得最快，而开环状 移动得最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条 带难以确定是质粒 不同构象引起还是因为含有其他 引起时，可从琼脂糖凝胶上将 带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的 图谱，则为同一种。具体如图 所示。图 不同类型 分子电泳图（三）电源电压在低电压时，线状 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同

6、分子质量的 片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因电场强度升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于 的 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过 。在一般进行 结果检测时，为了更快地得到检测结果，电压一般设定到 左右进行电泳。但是在加入检测结果条带较多，如进行分子标记结果检测时，一般要求电压 ，这样跑出的电泳条带很清晰且漂亮。（四）离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加 电泳缓冲液），则电导率很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化

7、或 变性。（五）核酸染料在核酸电泳中，最常用的染料是溴化乙锭（，），其能插入 分子中形成复合物，在波长为 紫外光照射下 能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙锭有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如 （双链嵌合荧光染料）、（一种新型核酸染料）、（一种新型核酸染料）等。但是其染色效果总的来说都不如溴化乙锭好。（六）不同类别和浓度的凝胶常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于 和 的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于 的分离鉴定和 印迹杂交，因为变性后的 是单链，其泳动速度与相同大小的 分子质量一样，因而可

8、以进行 分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。根据分离核酸片段的大小，在分离时选用不同浓度的琼脂糖凝胶，具体选择参考表 。五、琼脂糖凝胶电泳常用仪器设备琼脂糖凝胶电泳常用的仪器设备主要包括电源、电泳仪、缓冲液（主要是）、琼脂糖凝胶、微量移液器、染料等。具体见图 。六、琼脂糖凝胶电泳的操作步骤（）用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上。（）调整好梳子的高度。（）开始配制琼脂糖凝胶，称取.琼脂糖于 的.中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解。（）冷却到 左右，加入溴化乙锭（）（取自配制的 的 储 备 液，存 放

9、），最 后 浓 度.，摇 匀 后，冷 却 至 时倒入制胶板中，使其厚度约为。（）室温放置 后，溶液凝固形成凝胶，小心拔去梳子，撕下胶带，即制成琼脂糖凝胶板。（）使琼脂糖凝胶板平移至电泳槽中，加样孔在负极，缓慢加入.缓冲液，使液面浸没胶面 左右。（）将电泳样品与上样缓冲液混合，依次点入加样孔中。（）接通电源，使其维持在 左右，一般电压为 ，当溴酚蓝移至阳极端时，关闭电源。（）取出胶板，在 紫外灯下观察，凝胶内加入的 会渗入 分子内，在紫外灯下呈现红色荧光区带，以此确定核酸存在的位置。观察结果，并照相记录。应用举例植物基因组 的琼脂糖凝胶电泳检测第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳一、聚丙烯酰胺凝胶电泳介绍

10、聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。它是一种垂直式电泳，聚丙烯酰胺凝胶分为两部分，上部分是浓缩胶，一般浓度较稀（左右），主要起浓缩样品的作用；下部分是分离胶，一般来说浓度较大（左右），主要起分离样品的作用。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中经常加入离子去污剂和强还原剂（即十二烷基硫酸钠），蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小（可以忽略电荷因素），避免了构象对电泳迁移速度的影响，因此聚丙

11、烯酰胺凝胶电泳又称为 。二、的基本原理 是在蛋白质样品中加入 和 巯基乙醇的样品处理液，是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂 巯基乙醇可以断开二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质完全变性，解聚成单链分子。与解聚后的单链充分结合，形成带有大量负电荷的蛋白质 复合物。蛋白质分子结合 阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除和遮盖了不同种类蛋白质间原有分析构象和电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其原有电荷和形状无关，如图 所示。三、的分离效应.浓缩效应浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在

12、电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔径的浓缩胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔径的分离胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带，如图 所示。.电荷效应当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电荷多少不同，因而迁移率也不同。表面电荷多，则迁移快，反之则慢，因此各种蛋白质因迁移速率不一而以一定顺序排列成一个个区带，在凝胶中得以分离，如图 所示。.分子筛效应电场中，颗粒小，呈球形的样品分子泳动速率快；颗粒大，形状不规则的分子通过凝胶孔洞时受到的阻力大，泳动慢。所以受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，如图 所示。四、聚丙烯酰胺凝

13、胶电泳常用的仪器设备聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的仪器设备主要有电泳槽、电泳仪、凝胶架、玻璃板、插孔梳、固定玻璃板装置、点样辅助梳等，具体如图 所示。五、聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的试剂.凝胶储备液丙烯酰胺.、甲叉双丙烯酰胺.、加双蒸水至、冰箱可保存一个月。.分离胶缓冲液.（.）：.，加入约 双蒸水，用 的 调 到.，用双蒸水定容至最终体积，冰箱保存备用。.浓缩胶缓冲液.（.）：，加入约 双蒸水，用 的 调 到.，用双蒸水定容至最终体积，冰箱保存备用。.甘氨酸电泳缓冲液.，、甘氨酸.、.，加双蒸水至，冰箱保存备用。.样品处理液 （.）、巯基乙醇、.溴酚蓝、甘油。.低相对分子质量标准蛋白质。.过硫酸铵浓度

14、为 过硫酸铵，此溶液需现配现用。.染色液.考马斯亮蓝，加入 甲醇，冰醋酸。.脱色液 甲醇，冰醋酸与 双蒸水混合。.的琼脂.琼脂粉加 双蒸水，加热至沸腾，未凝固前使用。六、主要操作流程聚丙烯酰胺凝胶电泳主要操作过程包括组装电泳操作装置制备分离胶和浓缩胶制备样品加样电泳固定染色脱色观察计算。（）配制 所需的各种试剂。（）将平板玻璃洗净烘干，组装在一起，在缝隙加入.琼脂封边。（）迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加.）。再在胶液面上小心注入一层水（高），以阻止氧气进入凝胶溶液。（）分离胶聚合完全后（约），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。（）制备浓缩胶：按所

15、需浓度需加入的量进行配制，一旦加入，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。（）立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。（）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按 体积比加入样品处理液，在 加热 以使蛋白质变性。（）浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入 甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（）按预定顺序加样，加样量通常为 （.厚的胶）。（）将电泳装置与电源相接，浓缩胶所加电压为 。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到 ，继续电泳直至溴酚蓝到达分离

16、胶底部上方约，然后关闭电源。（）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。（）在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。（）加入固定液中固定 以上，以固定其中的蛋白质成分。（）之后，加入考马斯亮蓝染液，在固定的同时进行染色，染色时间超过 小时为宜。（）换脱色液脱色，在水平摇床上脱色 ，更换多次脱色液，直到背景清楚。（）对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。（）用直尺分别量出标准蛋白质，待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率：以蛋白质相对分子质量标准物的对数相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品

17、的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。相对迁移率 蛋白质样品迁移距离（）/溴酚蓝区带距加样端距离（）七、聚丙烯酰胺凝胶电泳中常见的问题及解决方法.纹理和拖尾现象由于样品溶解不好引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。.蛋白带过宽与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。.指示剂成微笑符号说明凝胶不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致。.凝胶时间不对通常胶在 至 内凝固。如果凝得太慢，可能是、剂量不够或者失效。应该现配现用，不稳定，易被氧化成黄色。如果凝得太快，可能是 和 用量过多，此时胶太硬易裂。应用举例聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定牛乳

18、蛋白质的研究第四节 蛋白质双向电泳双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。第一步骤为等电聚焦（），即根据蛋白质的等电点（）差异将蛋白质分离。第二步骤为十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（），即利用蛋白质的分子质量差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个蛋白质点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子质量和含量等信息。目前，这项技术已经成为蛋白质组学研究的一个主要方法，和质谱技术一起成为了鉴定蛋白质差异表达的十分重要的手段。一、双

19、向电泳实验步骤（一）样本制备正确的样本制备对于良好的双向电泳结果是十分重要的。（二）干胶条水化进行等电聚焦电泳（）之前，必须加入恰当的添加物，使 干胶条溶胀。（三）等电聚焦电泳（）第一向 电泳在平板电泳系统中进行，电泳时采用超高电压和主动温度控制。（四）干胶条平衡将样本胶条在含有 的平衡液中进行平衡处理，以便第二向分离。（五）十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（）样本胶条进行第二向 凝胶电泳。（六）显影对第二向凝胶基质上的蛋白质斑点进行染色，使之显影。如果蛋白质经预先标记过，就可以通过放射自显影，或紫外线照射，或荧光显像的方法使蛋白质斑点显影。（七）分析对样本双向电泳斑点结果进行分析。蛋白质双

20、向电泳流程如图 所示。二、双向凝胶电泳各个步骤的原理及注意事项（一）样品的制备要得到良好的双向电泳结果，适当的样本制备是很重要的。尽量使样本中的蛋白质完全溶解、分离、变性、还原。在设计某种样本制备方案时，必须对双向电泳最终要达到怎样的结果有清晰的把握。样本制备过程中，增加步骤能提高电泳最终结果的质量，但同时也能导致一些蛋白选择性的丢失。所以必须充分考虑提高样本质量和样本的完全分离之间的相互关系，权衡利弊。要想在复杂的蛋白质混合物中辨别出特定的蛋白质，必须使那些感兴趣的蛋白质在电泳条件下完全裂解。裂解不同种类的蛋白质样本应采用不同的处理和条件：一些蛋白质在天然条件下与膜、核酸及其他蛋白质形成复合

21、物；一些蛋白质形成各种非特异性的集合体；一些蛋白质一旦离开其正常环境就会发生沉淀。裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法、去污剂的选择以及样本溶液的组成。.细胞破碎、避免蛋白质水解、样本分级为了对细胞内蛋白做全面分析，必须有效地破碎细胞。细胞破碎方法的选择依赖于样本是来源于细胞悬液、实体组织还是其他生物材料，以及是否要分析细胞内所有蛋白质或仅仅是细胞内的一部分蛋白质。当细胞被破碎后，蛋白酶就被释放出来或被激活。由于蛋白酶的作用，会使蛋白质分解，使双向电泳的最后结果复杂化，所以，必须避免这个问题。如果可能的话，应直接将样本在强变性液中裂解，用 尿素、或 来抑制蛋白酶。低温下蛋白酶

22、的活性低，因此建议在样本制备时尽可能地在低温下进行。此外，样本在制备过程中，通常在 碱、碳酸钠或碱性载体两性电解质存在的条件下，蛋白酶能得以有效抑制。如果只对组织或细胞中的一部分蛋白质感兴趣，在样品制备过程中可以采取样本分级的方法。如果想要分析的蛋白质来源于某一亚细胞单位（如细胞核、线粒体、质膜等），可以在蛋白质裂解之前采取差速离心或其他方法将感兴趣的细胞器纯化。还可以在双向电泳前，将样本在不同的提取条件下利用溶解性的不同进行样本分级。.蛋白质的沉淀和去除干扰物质在全细胞裂解液中，各种蛋白质的浓度范围差异很大，并呈动态变化，这种情况下，高丰度蛋白质就有可能掩盖低丰度蛋白质。有效的蛋白质组学分析

23、应当既包括将高丰度蛋白质分离，也包括富集低丰度蛋白质以达到可以检测到的水平。通过这种处理，提高了样本分析的分辨率，使双向电泳图像不至于过分拥挤，简化结果分析与解释，增加发现具有诊断或治疗价值蛋白质的机会。沉淀样本中的蛋白质及去除干扰物质并非必需的步骤，是否采用这两个步骤依赖于样本的特性和实验目的。（二）第一向：等电聚焦电泳（）蛋白质是双性分子，会根据 环境不同而带正电荷、负电荷或不带电荷。只有在某一 时，蛋白质的净电荷为零，此 即为该蛋白质的等电点。在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的 环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的 环境中以阳离子形式向负极移动。如果在 梯度环境中将含有各种不

24、同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在 梯度某一位置进行聚集，聚焦部位蛋白质的净电荷为零，测定聚焦部位的 即可知道该蛋白质的等电点。由于 梯度的变化程度和电场的强度决定了分离效果，为了得到最好的效果，一般在变性条件下进行。（三）第二向：十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（）是一种根据蛋白质分子质量分离蛋白质的方法。它是在含有变性剂 的聚丙酰胺凝胶上实现的。是一种阴离子表面活性剂，当在蛋白质溶液中加入足够量的 时，形成了蛋白质 复合物，使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质 复合物都带上相同密度的负

25、电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原来的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的天然电荷差别。在凝胶中的迁移不再受蛋白质原来电荷和形状的影响，而仅取决于分子质量大小，从而可通过 来测定蛋白质的分子质量。第二向电泳包括 步：（）凝胶制备。（）胶条在 缓冲液中的平衡。（）将平衡好的 胶条放在 凝胶上。（）凝胶电泳。（四）染色目前，有很多方法来检测双向凝胶上所分离的蛋白质，主要方法是银染、考马斯亮蓝染色。以下将主要介绍这两种方法。.银染银染是一种非常灵敏的非放射性核素的方法（低于）。银染方法比较复杂，步骤较多，使用的试剂也较多，而且试剂纯度非常重要。最好采用专用的试剂盒，试剂盒中的试剂能够保证银染的

26、特异性。蛋白银染试剂盒是一种灵敏度高、使用方便的试剂盒。在敏化步骤中不加戊二醛，以及在硝酸银溶液中不加甲醛，虽然灵敏度有所降低，但更能与质谱分析兼容。.考马斯亮蓝染色灵敏度比银染低 倍，但方法简单，且比银染定量准确。需要用光密度仪测定蛋白的相对分子质量时，最好使用考马斯亮蓝染色。（五）图像的获取和分析.获取双向凝胶上蛋白质的呈现有多种方法，这些方法都必须具备图像采集技术，能检测出不同的显色、放射性、荧光信号。获得双向电泳凝胶图像的主要设备为文件扫描仪、成像仪、激光密度计。.分析的一般步骤图像成像和操作点的定量与检测点匹配编辑匹配分子质量和等电点校准合成胶与平均胶标准化数据分析凝胶注解应用举例大

27、肠埃希菌双向凝胶电泳图谱的建立第五节 纸 电 泳一、仪器装置包括电泳室及直流电源两部分。常用的水平式电泳室装置如图 所示。包括两个电泳槽 和一个可以密封的玻璃（或相应材料）盖；两侧的电泳槽均用有机玻璃（或相应材料）板 分成两部分；外格装有铂电极（直径.）；里格为可放滤纸 的有机玻璃电泳槽架，此架可从槽中取出；两侧电泳槽 内的铂电极 经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在 ，高压电泳一般在 。二、操作步骤（）配制电泳缓冲液 柠檬酸盐缓冲液（.）：取柠檬酸（）.与柠檬酸钠（）.，加水，使溶解。（）制备滤纸 取色谱滤纸置 甲酸溶液中浸泡不少于，次日取出，用

28、水漂洗至洗液的 不低于，置 烘箱烘干，备用。可按需要裁成长、宽 的滤纸，或根据电泳室的大小裁剪，并在距长度方向一端 处划一起始线，每隔.处做一记号备点样用。（）点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入柠檬酸盐缓冲液（.）中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点，共 点，并留 个空白位置。干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，本法适用于稀的供试品溶液。（）电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液，浸没铂电极，

29、接通电泳仪稳压电源挡，调整电压梯度为 ，电泳约 ，取出，立即吹干，置紫外光灯（）下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。（）含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各准确加入.盐酸溶液，摇匀，放置，用 号砂芯玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药品项下的规定测定吸光度，并按吸收系数计算含量。纸电泳法一般用于小分子电荷物质的分离，如氨基酸、小肽、核苷酸等。由于滤纸纤维素含有大量的羧基，由此引起滤纸纤维素和极性大的样品物质发生广泛的相互作用，从而使得亲水性的样品物质电泳迁移率低，同时小分子物质净电荷较少也影响它们的电泳迁移率，所以有时纸电泳需要在高

30、压下进行（约 ），高压电泳会产生热量，使缓冲液大量蒸发及滤纸干燥，为此必须附有降温设备，或者在低温的条件下进行。应用举例三磷酸腺苷二钠片的含量测定第六节 毛细管电泳 一、毛细管电泳的发现与发展 年，瑞典科学家 用经典电泳法从人血清中分离出白蛋白和球蛋白，并发现样品的迁移方向和速度取决于它所带的电荷和淌度。电泳法是利用电泳现象进行定性、定量的分离分析方法。按形状分类可分为 型管电泳、柱状电泳、平面电泳等；按载体分类又有滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳等。虽然，经典电泳法仍用于医学和生物化学的分离分析，但存在着操作烦琐、分离效率低、定量困难等缺点。为了提高分离效率需增加电场强度，但因电

31、流增加产生焦耳热，限制了电压的增加。年 和 首先在 内径石英毛细管柱内用高电压进行分离，创立了现代毛细管电泳。年 等将胶束引入毛细管电泳，建立了毛细管电泳的重要分支胶束电动毛细管色谱。年 建立了毛细管等电聚焦，和 提出了毛细管凝胶电泳。年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内，由于 符合以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质（包括酶、抗体）、核苷酸乃至脱氧核糖核酸（）的分离分析要求，得到了迅速发展。二、毛细管电泳的分类及特点（一）毛细管电泳的分类毛细管电泳具有多种不同的类型，根据不同的分类方法可以将其分为不同的类别。按填充物质的性状进行分类：自由溶液电泳和非自由溶液电泳。按分离机

32、制进行分类：电泳型、色谱型、电泳 色谱型。按主要分离模式进行分类：毛细管区带电泳，用于分离化合物；蛋白质和多肽、胶束电动毛细管电泳，用于分离中性化合物、核酸和多环芳烃；毛细管凝胶电泳，用于分离蛋白质、核酸等生物大分子；毛细管电聚焦，用于分离多肽和蛋白质；毛细管电色谱，用于分离蛋白质：毛细管等速电泳，用于分离离子化合物、蛋白质和多肽。（二）高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳法的突出特点是简单、高效、快速、样品用量小、易自动化操作，比传统电泳如薄层电泳或柱电泳有强得多的分析功能。.高灵敏度常用的紫外检测器的检测限为 ，激光诱导荧光检测器的为 。高分辨率 其每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至

33、千万，而 一般为几 千到几万。高速度 最快可在 内完成。据报道，有人在 内分离 种蛋白质、1.7 内 分离 种阳离子、内分离 种阴离子。样品进样量少 只需 （）级的进样量。.成本低分析中只需少量（几毫升）流动相和价格低廉的毛细管即可试验。由于以上特点以及分离生物大分子的能力，使 成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。当然 还是一种正在发展中的技术，有些理论研究和实际应用正在进行与开发。此外，操作中 的重复性差也影响了其应用。三、毛细管电泳法和其他分析方法的比较（一）毛细管电泳法和高效液相色谱法的比较 和高效液相色谱法（）相比，其相同处在于都是高效分离技术，仪器操作均可自动化，且两者均有多种不

34、同分离模式。两者之间的差异在于 用迁移时间取代 中的保留时间，的分析时间通常不超过，比 速度快。对 而言，从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数呈正比，对扩散系数小的生物大分子而言，其柱效就要比 高得多，所需样品为 级，流动相用量也只需几毫升。而 所需样品为 级，流动相则需几百毫升乃至更多，但 仅能实现微量制备，而 可做常量制备。（二）毛细管电泳法和传统电泳法的比较 和普通电泳法相比，由于其采用高电场，因此分离速度要快得多。检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外，其他类型检测器均已和 实现了连接检测。一般电泳定量精度差，而 和 相近。操作自动化程度比普通电泳要高得多。毛细管电泳的缺点

35、如下。（）由于进样量少，因而制备能力差。（）由于毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法如紫外吸收光谱法时，灵敏度较低。（）电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性。四、基本原理毛细管电泳以毛细管为分离通道，高压直流电场为驱动力，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而进行高效、快速分离的一种电泳技术，是电泳技术和色谱分离技术结合的产物，是分析科学继高效液相色谱之后的又一重大进展，使分析科学由微升级水平进入纳升级水平，并使单细胞分析成为可能。在外加电场的影响下，带电的胶体粒子或离子在分散介质中做定向移动的现象称为电泳。混合物中不同带电粒子由于荷电量不同，分子大小不同，泳动速度不同，从而获

36、得相互分离。电泳是一种特别适用于带电胶体粒子和离子的分析分离技术。电渗是指在电场作用下，液体整体相对于固体支持物的定向移动。在毛细管电泳中，由于石英毛细管内壁上的硅羟基团（）电离成（）使表面带负电荷，负电荷表面借助静电作用在溶液中积聚相反电荷的对离子形成双电层。处于扩散层中的阳离子在负电荷表面形成一个圆筒形的阳离子鞘。在高电场作用下，双电层中这个阳离子鞘相对毛细管内壁运动，引起整个流体向阴极移动，形成电渗流。五、毛细管电泳仪毛细管电泳仪主要由高压电源、电极槽、进样系统、毛细管柱系统、检测系统及工作站等组成，如图 所示。.高压电源一般采用 连续可调的直流高压电源。为获得迁移时间的高重现性，要求电

37、压输出精度应高于.。.电极槽 的电极通常由直径.的铂丝制成，电极槽通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料瓶（），要便于密封。.进样系统由于毛细管柱的柱体积一般只有 ，因此要求进样系统和检测系统的积只能有数纳升或更少。否则会产生严重的柱外展宽，使分离效率大大降低。一般采用无死体积进样，即让毛细管直接与样品接触，然后通过重力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或进样时间长短来控制，故对应的进样系统必须包含动力控制、计时控制、电极槽或毛细管移位控制等机构。移位控制机构用来改变电极槽或毛细管的状态，使之便于毛细管插入样品溶液或恢复到电泳位置，一般主要通过转动和升降电极槽来实现。进

38、样方法主要有下列三种：（）电动进样 当将毛细管的进样端插入样品溶液并加上电场 时，组分就会因电迁移和电渗作用而进入管内。此法对毛细管内的填充介质没有特别限制，属普适性方法，可实现完全自动化操作，通过改变进样电压和时间能对进样量实现控制。但对离子组分存在进样偏向，即迁移速度大者多进，小者少进或不进，从而降低分析的准确性和可靠性。另外，基质变化也会引起导电性和进样量的变化，影响进样的重现性。（）压力进样 当将毛细管的两端置于不同的压力环境中时，管中溶液就能流动，将样品带入。此法要求毛细管内的填充介质具有流动性。由于没有加电场，不存在进样偏向，但选择性差，样品及其背景都同时被引入管中，对后续分离可能

39、产生影响。利用压缩空气，如钢瓶气可以实现正压进样，并能与毛细管清洗系统共用。（）扩散进样 当将毛细管插入样品溶液时，组分分子因在管口界面存在浓度差而向管内扩散。此法对毛细管内的填充介质没有任何限制，属普适性方法。扩散进样动力属不可控制参数，进样量仅由扩散时间控制，一般在 。.毛细管柱系统毛细管是 分离的心脏，可分为开口毛细管柱、凝胶柱及电色谱柱等类别。为了实现柱上检测，需在毛细管上制作检测窗口。毛细管外涂的聚酰亚胺涂层不透明，所以检测窗口部位的外涂层应剥离除去，剥离长度通常控制在 。剥离方法有硫酸腐蚀法、灼烧法和刀片刮除法等。毛细管首次使用或长时间不用后重新使用时，应清洗管内壁表面并用稀碱液使

40、之活化。使用完毕后，应用水充分冲净，然后用高纯氮气吹干后保存。装填缓冲溶液是 分离的基本要求，对毛细管进行清洗则是保持自由溶液 高效和重现分离的条件之一。采用正压或负压容易实现毛细管的装填或冲洗，其中负压可由泵或注射器（抽）来产生，而正压则可用压缩气或注射器（推）来施加。.检测系统紫外和荧光检测器是 目前最常用的检测器。紫外检测器的通用性较好，但对小直径的毛细管，柱上检测的灵敏度较低。用激光诱导荧光检测，灵敏度高，但样品往往需要衍生化。另外两种具有较高灵敏度和潜在用途的检测器是质谱和电化学（安培和电导）检测器。六、毛细管电泳仪使用中常见问题及解决方法毛细管电泳仪在使用过程中一些常见的问题及处理

41、方法，尽管不同型号的仪器有所不同，但大致可分为以下几类，且解决方法也大致相同。.无电流或电流不稳毛细管电泳运行中如果出现电流突然大幅减小或无电流、电流不稳的情况，可能原因有以下几点：（）柱内存在较大气泡。可重新充入缓冲溶液，或冲洗毛细管进行解决，为了避免气泡的产生，也可以在使用前对缓冲溶液进行脱气处理。（）毛细管堵塞，用水冲洗毛细管，如果不通可更换甲醇冲洗，因为甲醇的黏度小于水，更容易将柱子打通，为避免柱子堵塞，一定要在使用前对样品和缓冲溶液进行过滤。（）毛细管末端没有插入缓冲溶液液面以下，此时可补加缓冲溶液。（）以水为溶剂溶解样品，可能压力进样时有部分水进入缓冲溶液中，为避免这种情况，一般建

42、议用稀释的缓冲溶液作溶剂来配制样品。（）毛细管断裂，此时就只能更换新毛细管柱。（）电流指示为零，就要考虑电极是否弯曲或断裂，如果属于这种情况，则需要拉直或更换电极。（）电流不断变化，则可能是因为环境温度过高或过低造成的，需开空调来调整环境温度。（）电流过大，则需考虑降低缓冲溶液浓度，或焦耳热过大，则检查冷却系统。（）电流不断升高或先波动后稳定，则可能是由于不同样品基底进样体积过大造成的，这属于正常情况，电流会在运行过程中逐渐稳定。（）若使用贝克曼毛细管电泳仪，无电流时还有可能是瓶塞上有液体粘附，需要更换瓶塞。.基线不稳或漂移（）缓冲溶液中有沉淀或污染物存在，此时可通过.滤膜过滤缓冲溶液来解决问

43、题。（）缓冲溶液中有大量小气泡，可通过超声或真空脱气去除气泡。（）样品有沉淀，应事先确定样品是否能较好地溶于缓冲溶液中。（）样品在毛细管内壁有吸附，可通过酸性缓冲溶液冲洗柱子。（）毛细管柱未改性或改性后没有充分老化，如使用未涂层毛细管柱，使用前应用.清洗和平衡柱；若采用涂层毛细管，则需进行适当的老化处理。（）打开检测氘灯时间过短，需预热 后使用。.噪音太大（）毛细管柱检测窗口处有吸光性物质，需要用甲醇或水清洗。（）氘灯使用时间过长，能量不足。一般情况下，光源可使用约，若使用时间过长，则会出现噪音变大的现象。（）背景缓冲溶液在检测波长处有吸收，造成噪音过高，此时则需要更换缓冲体系。（）电极被污染

44、或损坏。需用甲醇超声清洗电极或更换。（）缓冲溶液离子强度过大，更换缓冲体系解决。（）静电问题。若用手接触仪器，噪音变小，则提示是静电问题引起的噪音过高，从仪器任意部位用导线接地可解决问题.无峰或信号较小（）进样量不足，检查样品瓶中是否有气泡，有必要可进行脱气处理。（）样品浓度过低，可更换为压力进样模式以增大进样量，或直接增大样品浓度。（）检测极性设置问题，样品没有经过检测窗口，如样品带负电荷，应从负极向正极迁移，此时如果电渗流较小而同时样品迁移速度又太大，则采用传统的 至 的检测模式（安捷伦显示为，贝克曼显示）可能就检测不到信号，可更换为 至 的检测模式（安捷伦显示，贝克曼显示）。（）检测波长

45、未优化，需重新进行紫外扫描后确定正确的检测波长。（）样品吸附严重、样品变性（如生物样品的反复冻融、多次使用造成的污染等），此时需要更换样品。（）如果是安捷伦的毛细管电泳仪，则还有可能是检测窗口与光源没有对齐，需要重新安装毛细管卡套。（）如果是新更换的毛细管柱，需进行活化后，通过连续进样解决。.迁移时间重现性差电泳峰迁移时间的重现性直接或间接地与毛细管内壁的荷电情况有关。在电泳、温度、缓冲液种类及组成不变的情况下，一般有下面几种原因造成迁移时间重现性差。（）毛细管内壁吸附原因造成其电渗流的改变，此时需对毛细管进行老化或平衡足够长的时间，或用酸性缓冲溶液冲洗柱子。（）毛细管不是同一批次，管子内壁硅

46、羟基含量不同造成电渗流改变，所以应尽可能地使用同批号毛细管柱。（）两个缓冲溶液瓶的液面不等高，造成毛细管内溢流，重现性变差。（）样品过载，特别是对一些采用间接紫外检测的小离子的分析。（）运行时间过长后，缓冲液的组成发生变化，一般每运行十次更换一次缓冲溶液可较好解决这一问题。（）较大的焦耳热引起缓冲溶液黏度及电流的改变，可在两次运行之间使用缓冲溶液平衡柱子，确保每次分离时所使用的缓冲溶液黏度保持一致。.峰面积重现性差（）突然施加的高电压，使缓冲溶液热膨胀造成样品溢出，解决方案：可在进样后再进一段缓冲溶液或使电压梯度上升。（）额外样品进入或零进样，可通过限制最小进样量来控制。（）电动进样时存在样品

47、歧视，可改为压力进样解决。（）样品在毛细管内壁有吸附，可通过改变缓冲溶液，增大缓冲溶液浓度，使用涂层柱，或使用添加剂等方法来抑制样品吸附。（）迁移时间重现性差，可使用校正峰面积（）。（）信噪比太小，峰未分开，可优化积分参数进行解决，或增大样品浓度。（）溶剂挥发造成样品浓度增大，使用密封性更好的样品瓶盖，在安捷伦和贝克曼仪器上对样品盘进行温度控制。（）毛细管进样端不平滑造成进样量差异，应使用具有扁平光滑进样端的毛细管，或灼烧或刮去毛细管进样端的聚合物涂层，在使用凝胶毛细管电泳或无胶筛分毛细管电泳模式时，为了避免黏稠的筛分介质对样品造成污染，可在进样前将毛细管浸没在缓冲溶液或水中进行清洗。（）进样

48、时间太短也会引起峰面积重现性变差，可适当延长进样时间。（）长时间的运行导致缓冲溶液的离子强度发生改变，此时需要更换缓冲溶液进行解决。.峰形不规则（）电泳峰形较宽，可能是由于样品过载造成的，可通过适当降低进样量或减小样品浓度来解决；如果分离过程中产生大量焦耳热不能及时散失，也会造成峰形变宽，可降低电压、减小缓冲溶液的离子强度，或使用内径更细的毛细管。（）峰形歪曲，如前伸或拖尾，可能是由于缓冲溶液 样品的离子性能不匹配造成的，可通过调整使迁移淌度匹配，或背景缓冲溶液和样品导电性能差异最大化；峰形歪曲还有可能是由于样品过载引起的，可降低进样量来改善峰形。（）峰形拖尾。毛细管末端受损、断面不整齐时，由

49、于样品段形状不规则，可造成电泳峰形拖尾，可重新截图；样品在毛细管内壁的吸附也可造成峰形拖尾，可通过下列方法解决：使用高浓度背景缓冲溶液；使用极端；在背景缓冲溶液中使用添加剂，如纤维素等聚合物、，丙二胺等电荷抑制类二胺、.等电荷等反转类表面活性剂；使用涂层柱。.分离度差（）虹吸效应导致分离效率下降，通过使用干净的缓冲溶液池、保证两端缓冲溶液高度相同以消除或降低虹吸效应，保证高分离效率。（）缓冲溶液耗尽，更换新鲜配制的缓冲溶液可保证好的分离效率。七、常见的应用领域与传统的分离方法相比，毛细管电泳的显著特点是简单、高效、快速和微量。此外，毛细管电泳还具备了经济、洁净、易于自动化、一机多用和环境污染少

50、等优点。所有这些特点使得毛细管电泳迅速成为一种极为有效的分离技术，广泛应用于分离多种化合物，如氨基酸、糖类、维生素、农药、有机酸、无机离子、燃料、表面活性剂、药物、多肽和蛋白质、神经递质、低聚核苷酸、和 片段。如今，同、一样，通过多种模式在各个领域成为重要分析手段。.分离手性化合物手性药物的立体选择性差异已被证实，对映体中，一种异构体可以是药物的有效成分，而另一种则低效、无效或有毒，但长期以来多数手性药物以消旋体供药，这显然会给药物生产和疾病治疗带来严重影响，为此，手性化合物的分离备受关注。毛细管电泳用于手性化合物的分析已被证明是最简单高效的分析方法。手性分离可分为间接拆分和直接拆分，用 直接