生物检测技术（第二版）第三章电子课件 .ppt

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1、生物检测技术（第二版）第三章电子课件【知识目标】理解抗原抗体反应的基本原理和特点以及抗原抗体的结合力。掌握免疫凝集试验的基本原理及方法。掌握免疫沉淀技术的基本原理及操作要点。掌握免疫印迹技术的基本原理及操作方法。掌握酶联免疫检测技术的基本原理及方法。【能力目标】掌握免疫凝集试验、免疫沉淀技术、免疫印迹技术和酶联免疫检测技术的具体操作方法。第一节免疫学检测基本原理一、抗原抗体之间特异性结合（一）抗原抗体的互补性与亲和性抗原与抗体特异性结合是基于抗原决定簇（亦称抗原表位）和抗体超变区分子间具有互补性与亲和性之上。这两种特性是由抗原、抗体分子的空间构型决定的。（二）抗原抗体的结合力疏水作用力在水溶液

2、中两个疏水基团相互接触，由于对分子排斥而趋向聚集所产生的力称为疏水作用力。电荷引力（库仑引力或静电引力）电荷引力是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基与羧基基团之间相互吸引的力，又称库仑引力或静电引力。范德华力抗原和抗体相互接近时，由于分子的极化作用而出现的吸引力。实际上也是电荷引起的引力，但能量小于静电引力。氢键结合力氢键是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。（三）亲水胶体转化为疏水胶体抗体是球蛋白，大多数抗原亦为蛋白质，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。这种亲水胶体的形成机制是因蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，这些残基在溶液中带有电荷。二、抗原、抗体反应的特点

3、（一）特异性（二）比例性（三）可逆性（四）阶段性三、影响抗原、抗体反应的因素（一）反应物自身因素抗原抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类均可影响抗原抗体反应结果。抗体（）来源来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。（）特异性与亲和力特异性与亲和力是影响血清学反应的两个关键因素，它们共同影响实验结果的准确程度。（）抗原结合价抗原抗体特异性结合后，二者比例适当时，多价和双价抗体形成可见反应，且多价型抗体（如）比双价型抗体（如）结合牢固；单价抗体则不出现可见反应，称为不完全抗体。（）浓度合适的浓度能使抗原抗体达到反应的最适化，才出现明显的反应现象。（二）外界环境电解质抗原与抗体发生特异性结合后，虽

4、由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。酸碱度与抗原抗体的等电点有关。抗原抗体反应一般在为范围内进行。温度在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。第二节免疫凝集试验一、直接凝集试验颗粒性抗原在适当的电解质参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼可见的凝聚现象，称为直接凝聚试验。常用的细胞性抗原是细菌和红细胞，有时也用白细胞、血小板、螺旋体等。直接凝聚试验中的抗原称为凝集原，相应的抗体称为凝集素。（一）玻片凝集试验使颗粒性抗原与相应抗体在玻片上直接结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集现象，称为玻片凝集试验。诊断血清（已知抗体）和细菌或者红细胞

5、悬液各一滴，在玻片上混匀，室温数分钟后即可用肉眼或者低倍镜观察，出现颗粒凝集者为阳性。此法简便、快速，单敏感度较低。常用于菌种鉴定与血清学分型、红细胞 血型鉴定等。临床有时用该方法进行定量检测前抗原（例如土拉弗菌、布鲁菌等抗原）筛选，先用玻片凝集试验初步观察病人血清中有无相应的抗体，如为阳性再用试管凝集试验检测其效价。（二）试管凝集试验使颗粒性抗原与相应抗体在试管内直接结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集现象，称为试管凝集试验。在微生物感染的血清学诊断中，常将病人待检测血清进行系列倍比稀释，加入一定量诊断菌液，均匀混合后进行孵育，观察每管内的凝集程度，通常以产生明显凝集现象（）的血清最高稀释度

6、为该血清中所含抗体的效价。一般来说，凝集现象分为以下五个级别：很强，颗粒性抗原全部凝集，管内液体澄清，管底有大片边缘不整齐的凝集物，轻轻摇动时可见有明显的凝集颗粒，呈薄片状或者絮状。：强，颗粒性抗原大部分凝集，液体轻度浑浊，管底有边缘不整齐的凝集物，轻轻摇动时也可见明显的颗粒、薄片或者絮状凝集物。：中等强度，颗粒性抗原部分凝集，液体较浑浊，管底有少量颗粒状凝集物。：弱，颗粒性抗原少量凝集，液体浑浊，管底凝集呈细小颗粒状，不容易观察。：不凝集，液体浑浊度、管底沉积物同对照管相似。二、间接凝集试验用人工方法将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联于与免疫反应无关的颗粒性载体上，使之成为致敏颗粒，再与相应

7、抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质条件下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集试验，又称被动凝集试验。（一）间接凝集试验所用载体常用载体有红细胞（人 型红细胞或绵羊红细胞）和聚苯乙烯胶乳颗粒，其次为明胶颗粒、活性炭、白陶土、离子交换树脂等。（二）间接凝集试验的类型根据致敏载体用的是抗原还是抗体以及反应方式，可将间接凝集试验分为以下四类。正向间接凝集试验用可溶性抗原致敏载体，检测标本中相应抗体，其原理如图 所示。2反向间接凝集试验用特异性抗体致敏载体，检测标本中相应的抗原，其原理如图 所示。间接凝集抑制试验以可溶性抗原致敏的载体及相应抗体作为诊断试剂，检测标本中是否含有与致敏载体上抗原相同的抗原组分

8、。先将抗体试剂与待检标本混合，再加入抗原致敏载体，若标本中没有与所加抗体特异性对应的抗原，则抗体试剂与后加入的抗原致敏载体结合，出现凝集；若标本中含有与所加抗体相对应的抗原，则抗体先与之结合，后加入的抗原致敏载体将无抗体结合，凝集现象被抑制（图 ）。如果用已知抗体致敏载体及相应可溶性抗原作为诊断试剂，则可检测标本中的抗体，称为反相间接凝集抑制试验。4协同凝集试验协同凝集试验所用载体为金黄色葡萄球菌。多数金黄色葡萄球菌细胞壁含有 蛋白（，），一个 分子有 个相似的活性部位，可与人及多种哺乳动物（猪、兔、豚鼠等）的 段非特异性结合，利用该特性将金黄色葡萄球菌与 连接在一起，成为抗体致敏的颗粒载体，

9、抗体的 段暴露于葡萄球菌菌体表面，仍保持其与相应抗原决定簇特异结合的活性。将之与相应抗原接触，进行反向间接凝集试验。应做阴性对照，防止金黄色葡萄球菌自凝造成假阳性。可用于微生物的快速诊断、定种及定型，协助感染性疾病的早期诊断。（三）间接凝集试验常用方法间接血凝试验间接血凝试验也称为被动血凝试验，是指将可溶性抗原（或抗体）吸附于人 型红细胞或绵羊、家兔的红细胞上，制成抗原致敏红细胞，与相应抗体（或可溶性抗原）作用，在一定电解质条件下孵育后，可出现肉眼可见的红细胞凝集。间接血凝试验敏感性高于直接凝集试验和胶乳凝集试验，简便易行、快速，且成本低廉。胶乳凝集试验以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体，用可溶性抗原（

10、或抗体）与之结合（致敏）后，与待检标本中抗体（或可溶性抗原）发生凝集反应，称为胶乳凝集试验（，）。所用胶乳颗粒为人工合成载体，性能较红细胞稳定，均一性好，但与蛋白质结合的能力不及红细胞，因此敏感性不如间接血凝试验。（四）间接凝集试验的临床应用间接凝集试验敏感、快速、操作简便，且无需特殊试验设备，因此在临床检验中仍应用较多。可用之检测抗原、抗体。抗原检测用反向间接凝集试验检测病原体的可溶性抗原及各种蛋白质抗原成分。如检测乙型肝炎病毒表面抗原、甲胎蛋白抗原、尿中绒毛膜促性腺激素（）、纤维蛋白原等血浆蛋白成分等。间接凝集试验的敏感度虽较沉淀反应高，但低于免疫标记技术。以尿 测定为例，胶乳凝集试验敏感

11、度约为，胶乳凝集抑制试验敏感度约为。停经 以上的孕妇可测得阳性结果。抗体检测可用于检测病人血清中细菌、病毒、寄生虫等病原感染后产生的抗体，如间接血凝试验检测沙门菌抗体、沙眼衣原体及支原体相应抗体、抗链球菌溶血素“”抗体、乙型肝炎病毒表面抗体、血吸虫抗体等。还可用于自身免疫病患者血清自身抗体检测，如胶乳凝集试验检测类风湿因子，间接血凝试验检测抗 抗体、抗甲状腺球蛋白抗体、抗核抗体等。也有用于变态反应性疾病相关抗体测定，如青霉素抗体、某些花粉抗体等。第三节免疫沉淀技术根据沉淀反应介质和检测方法不同，将其分为液相内沉淀试验，凝胶内沉淀试验和凝胶免疫电泳技术三大基本类型（图）。但这些试验结果通过染色凭

12、肉眼观察结果以致灵敏度较低。根据沉淀反应中抗原抗体结合使反应系统透光度发生改变，据此建立了以测定透光度为特征的多种免疫浊度法。现代免疫技术（各种标记免疫技术）多是在沉淀反应的基础上建立起来的，因此沉淀反应是免疫学方法的核心技术。一、液相内沉淀试验液相内沉淀试验是指以含盐缓冲液为反应介质的抗原抗体特异性结合的沉淀试验。根据实验方法不同所形成的免疫复合物呈现的沉淀现象不一。将液相内沉淀试验分为 类：絮状沉淀试验絮状沉淀试验是一项经典实验技术。基本原理：在适当条件下，可溶性抗原、抗体在液相中发生特异性结合，形成肉眼可见的絮状沉淀物。技术要点如下：抗原稀释法：将可溶性抗原做一系列倍比稀释后，每管加入恒

13、定浓度的等量抗血清，混匀，置孵育直至肉眼可见沉淀物出现。沉淀物的形成量随抗原量的变化而不同，以出现沉淀物最多的最高稀释管为抗原最适比例管。抗体稀释法：将抗体做一系列倍比稀释，与恒定浓度的抗原等量混合反应，以出现沉淀物最多的最高稀释管为抗体的最适比例管。棋盘滴定法：又称方阵滴定法。将抗原和抗体进行一系列倍比稀释后，取不同稀释度的抗原抗体等量混合，可一次找出抗原抗体反应的最适比例。此方法操作简单，设备要求低。但受抗原抗体比例的影响非常明显，因而常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。环状沉淀试验该方法是 于 年建立的，该试验是经典的血清学定性试验之一。主要用于鉴定微量抗原如鉴定血迹，诊断炭疽。原

14、理是将抗原溶液叠加在细小玻管中抗体溶液上面，因抗血清蛋白浓度高，相对密度大，在两液交界的清晰界面上形成白色沉淀环为阳性反应。免疫浊度试验经典的免疫沉淀试验是抗原和相应抗体在反应终点时判定结果，方法学上存在费时、繁琐、敏感度低（）、难以自动化等缺陷，世纪 年代出现了微量免疫浊度试验，即透射比浊法、散射比浊法和免疫胶乳浊度法，借助多种自动化分析仪器来完成临床体液蛋白的检测。（）透射比浊法可溶性抗原与抗体，在一定缓冲液中形成的复合物，经一定时间后聚合出现浊度，导致入射光在透过反应液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，其光量减少的程度与复合物的含量成正比，可用吸光度表示。当抗体

15、量固定时，与待测抗原量成正比。用比浊仪测定，已知浓度的标准参考品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。（）散射比浊法分为终点射散比浊法和速率散射比浊法。终点散射比浊法实质上是透射比浊法的一种改良，原理是在抗原抗体反应基础上达到平衡时测定复合物的量。速率散射比浊法：所谓速率是指抗原抗体结合反应在每一单位时间内的速度，连续测定各单位时间的反应速度即为动态观察。速率法是测定最大反应速率，以后复合物产生的速率又逐渐下降，其峰值的高低与抗原的含量成正比，因此只要捕捉峰值，经数据处理即可得到抗原的浓度，峰值的出现通常在，因此检测速度明显加快。（）免疫胶乳浊度法在上述比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊

16、度，为解决快速反应及微量化的要求，发展了免疫胶乳浊度法。选择一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒，使其吸附特异性抗体，制成具有免疫活性的免疫微球，当微球与相应抗原发生免疫反应后，不溶性抗原抗体复合物快速在胶乳表面形成，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝聚时，则使透过光减少。免疫微球凝聚的程度为被测物浓度的函数，由此可测出标本中被测物含量。该法精确度和灵敏度都达到了放射免疫测定法要求。其操作简便，稳定性好，试剂低廉，且所用仪器可与普通分光光度计、自动生化分析仪通用。二、凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验主要是指琼脂糖扩散或称为凝胶扩散。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。

17、根据抗原与抗体反应的方式和特性，可将凝胶内沉淀试验分为：单向琼脂扩散试验；双向琼脂扩散试验。单向琼脂扩散试验（）原理将定量抗体混匀在琼脂凝胶中，继加待测的抗原溶液使其单独在凝胶中扩散，在抗原抗体相遇比例合适的部位，两者结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原的浓度成正相关。（）技术要点将抗体和 琼脂糖 混合，即刻倾注成平板。待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原液和不同浓度的抗原标准品，让其自由扩散，孔周围出现沉淀环，沉淀环的直径与待测标本内含量相关。本法稳定、简便，不需仪器设备，重复性和线性较好。但本法灵敏度较差，约为.。单向琼脂扩散试验有时可出现双重沉淀环现象，可能是抗原组分不纯或由于抗原性

18、相同但扩散率不同的两个组分所致。单向琼脂扩散试验过去被广泛用于各种免疫球蛋白和补体等的定量测定。但由于该法灵敏度低、影响因素多、反应时间长等不足，现临床已不再推荐使用该法来进行定量测定。双向琼脂扩散试验（）原理将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，让两者均在凝胶中自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。（）技术要点先在平板玻璃上倾注一均匀的凝胶薄层，打制 的小孔，分别加入抗原或抗体。温育，可出现不同沉淀线。该法操作简便，无特殊设备，特异性高，结果可靠。但该法灵敏度较低，结果出现晚，不能精确定量，目前临床上已逐渐被其他技术替代三、凝胶免疫电泳技术免疫电泳（，）（）原理

19、先用区带电泳技术将蛋白质抗原按其所带电荷，分子质量和构型不同，在凝胶中电泳分成不同区带，然后与电泳方向平行，挖一条型槽，加入相应抗血清，置室温或，使抗原和抗体呈双相扩散而在相应位置上形成肉眼可见的弧形沉淀线，根据沉淀弧（图 ）的数量、位置和形态，可分析样品中所含抗原成分及性质（）技术要点取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖糟。用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。电泳条件以电压 或电流 为宜，电泳 。电泳完毕后，用毛细滴管在槽内加入含相应抗原的混合抗原，孵育，使抗原抗体双相扩散，形成沉淀线。观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、染色、脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。火

20、箭免疫电泳火箭免疫电泳（，）技术是把抗原置于含有抗体的凝胶内电泳，实际上是一种通过电泳进行加速的单相免疫扩散技术，年由 建立，由于其沉淀形似火箭，故称为火箭电泳（图）。（）原理当抗原与凝胶中抗体在电场作用下移动，逐渐形成梯度浓度，在抗原抗体比例适当时形成不溶性免疫复合物沉淀线而沉淀，随着抗原量的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭峰样沉淀带，峰形高低与抗原量成正比。（）技术要点制备抗体琼脂糖凝胶板：将已融化的.巴比妥缓冲琼脂糖冷却至左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。打孔：在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径，孔距。置琼脂板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样。电泳：样品孔放负极侧，电压 或电

21、流 ，电泳。观察沉淀峰，电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。绘制标准曲线图：以峰高为纵坐标，浓度为横坐标（对数坐标），绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度。该法操作简便省时，重复性好，灵敏度高，定量检测抗原可达 以上的含量，若采用放射性核素标记做免疫自显影，可测出达 的抗原浓度。该技术可用于抗原蛋白定量检测，如、及其裂解产物和 等的测定。对流免疫电泳（）原理对流免疫电泳（，）实质上是定向加速的电泳技术与免疫双向扩散技术的结合。在 的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，带微弱的负电荷，且分子质量较大，因此电泳力小，小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白常带较强的负电荷，且分子

22、较小，电泳力大，泳向正极电泳时，抗原放负极侧孔，抗体放正极侧孔，抗原抗体相对泳动，在两孔间相遇，比例合适时形成肉眼可见的沉淀线。若抗原浓度超过抗体，沉淀线靠近抗体孔（图）。（）技术要点：制备.巴比妥琼脂凝胶板。在琼脂板上成对打孔，孔径，孔距。于阴极侧孔内加入待检血清或阳性对照血清，阳极侧孔内加抗血清。电泳：电泳条件 宽，电泳。观察结果或在室温放置数小时后观察沉淀线。本试验简便、快速，灵敏度比双向免疫扩散法高 倍，可测出蛋白质的浓度达.，但分辨率低于双向免疫扩散试验。第四节免疫印迹技术一、免疫印迹技术的基本原理蛋白质样品经过 或非变性电泳（）等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其他膜的

23、表面，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，利用抗原与抗体结合的特异性，与相应的一抗孵育，用二抗放大一抗检测到的信号，并显示检测信号，从而判断膜上有无待测蛋白质抗原及量的多少。二、免疫印迹技术的主要过程免疫印迹实验一般包括四个步骤：蛋白质在固相基质上固定化，一般从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上；用非特异性、非反应活性分子封闭固相基质上未吸附蛋白质的区域；免疫杂交，即利用抗原抗体特异性反应检出固相基质上的目的蛋白质；显色分析。具体见图。三、免疫印迹的几种方法蛋白质印迹有四种基本方法：点印迹、扩散印迹、溶剂流印迹（毛细管印迹）和电泳印迹。点印迹点印迹通常用微量移液器把小体积的样品溶液（）直接加在固相膜

24、上。可用于摸索新的印迹条件或测定蛋白质浓度。扩散印迹扩散印迹是将凝胶放在两张固相膜之间，浸在缓冲液中，使分子自由扩散。分子扩散是多向的，扩散，便得到两张镜像对称的转移谱。由于扩散与温度正相关，此技术又称为“温度印迹”。扩散印迹方法适合于大孔凝胶。该方法简便，但耗时长，且分辨率较低。溶剂流印迹溶剂流印迹由 转移的毛细管印迹发展而来，适用于低分子质量的蛋白质和大孔凝胶。凝胶与固相膜靠近，膜上加一叠滤纸，滤纸上面加 的玻璃板，缓冲液借助毛细管流从贮液腔中通过凝胶和固相膜，带动凝胶中的蛋白质垂直向上运动滞留在膜上。电泳印迹电泳印迹又称电泳转移，是目前广泛使用的印迹方法，由 等于年提出。该方法通过电场将

25、凝胶中的蛋白质转移到膜上，转移速度快，转移效率高，转移条件容易控制，重复性好，并可保持凝胶电泳的分辨率。其转移效率取决于分离蛋白质的凝胶系统和蛋白质的相对分子质量。四、免疫印迹所使用的固定化膜用于固定蛋白质的固相基质通常称为固定化膜。固定化膜应具有如下性质：膜能与目的蛋白质分子相结合；蛋白质固定于膜之后，对随后的检测无影响；膜应准确反映电泳分离的结果。现在常用的固定化膜有硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜等。硝酸纤维素膜硝酸纤维素（，）膜是蛋白质印迹实验最常用的固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与 膜发生疏水相互作用而结合在一起，易于封闭，因而得到了广泛的应用。

26、根据被转移的蛋白质分子质量大小，要选择不同孔径的 膜，因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子质量蛋白质的结合就越牢固。通常采用.和.两种规格的硝酸纤维素膜，大于 的蛋白质可以用 的膜，小于 的蛋白质用.的膜，小于 的蛋白质选择.的膜。尼龙膜尼龙膜也能用于蛋白质和核酸的转移。尼龙膜软且结实，比硝酸纤维素膜容易操作。尼龙膜的灵敏度高，结合蛋白质的能力强，结合量达 。缺点是背景高，不能用阴离子染料在带正电的尼龙膜上做专一性染色。带正电的尼龙膜能有效地结合低浓度的小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白质多糖。聚偏二氟乙烯膜聚偏二氟乙烯（，）膜可以结合蛋白质，结合强度比 膜强 倍。因为硝酸纤维素膜在 试剂中会

27、降解，而 膜稳定、耐腐蚀，因此可替代 膜用于蛋白质的序列测定。与 膜相比 膜有很高的机械强度，操作方便，化学稳定性好，可适用于各种溶剂配制的样品，特别适合于糖蛋白的转移、检测和蛋白质测序。膜在使用之前必须先用 甲醇浸润，再用无离子水浸泡方可使用。五、电泳转移湿式转移是一种传统方法，将转移槽的负极板（黑色）朝下，依次叠放转移缓冲液浸泡过的海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵，各层接触后均用玻璃棒赶出之间的气泡，正极板朝上，合上转移槽的正负极板。务必使凝胶一侧面向负极，膜一侧面向正极，以保证带负电的蛋白质向正极转移到膜上，将叠放好的图(3-10)放入转移电泳槽的缓冲液内，冰箱中进行电泳转移。经过电泳转

28、移之后，蛋白质样品固定于膜上。该法花费时间长，需要大量缓冲液，湿式转移一般在恒压下进行。六、封闭转移后，为了减少探针的非专一性结合，需要封闭膜上的自由结合区，以防止检测时的高背景，通常将膜放在如下溶液系统中：.的牛血清蛋白溶液、.的去污剂和 的脱脂乳粉。七、探针杂交很多蛋白质和配体可作为探针标记印迹蛋白，如外源凝集素能探测糖蛋白上的糖结构信息，配体能用于探测它们相应的受体。核酸能检测相应的结合蛋白，抗体能够检测抗原等。在蛋白质免疫印迹实验中，探针通常是待测蛋白抗原的单克隆抗体或者多克隆抗体，探针结合时所用缓冲液应适合目的蛋白与探针的专一性结合，同时使非专一性结合降低到最小。杂交待测蛋白质转移到

29、固相膜，经过封闭之后，即可用专一的抗体孵育，称为杂交。具体见图。杂交所用抗体是以待测蛋白质为抗原免疫动物（小鼠或兔）获得的多克隆抗体，称为第一抗体。漂洗除去多余的一抗后，再用第二抗体孵育。第二抗体通常是高度纯化的，用放射性同位素或金属胶体或酶进行标记的，称为标记二抗，可从试剂公司购买到。购买时切记，若以免疫小鼠制备一抗，则二抗须是抗鼠抗体，若以免疫兔制备一抗，则二抗须是抗兔抗体。抗体的标记天然的抗体本身均不带任何标记，抗原和抗体的反应结果无法显示，因此，必须对抗体进行相应的标记，以指示抗原抗体的特异性反应。采用生物化学方法将蛋白质（抗原或抗体）与酶蛋白、铁蛋白、荧光素、化学发光物质、生物素、同

30、位素等结合成稳定且有特殊效应的复合物，称为标记化合物。标记化合物主要是标记具有抗体活性的免疫球蛋白，在免疫化学中称为标记抗体。比较常见的标记物主要有放射性同位素（如）、荧光素、酶和生物素等。（）放射性同位素标记技术用于标记抗体的放射性同位素主要是，因为 衰变时可发出易于检测的低能 射线和 射线，而且 的半衰期是，适用于实验室科学研究。用同位素标记抗体进行免疫分析具有很高的灵敏度，但由于同位素对人体存在潜在的危害，其应用受到一定限制。（）荧光素标记技术荧光素是在蓝光或紫外线照射下发出绿色荧光的一种黄色染料。用于抗体标记的荧光素应具备能与蛋白质分子形成稳定的共价键结合的化学基团，荧光效率高，标记抗

31、体后不影响抗原抗体反应，标记方法简便，游离的荧光素易与标记后的抗体分离等特点。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白等。（）酶标记技术酶标记抗体技术是蛋白质标记中发展快、应用广的技术之一。常用于抗体标记的酶主要有辣根过氧化物酶（，）、碱性磷酸酶（，）等。以酶标记抗体，使抗原抗体反应的特异性与酶促反应有机结合起来，酶促显色反应产物的色泽程度即可体现抗原抗体反应的情况。辣根过氧化物酶是从辣根植物中提取得到的过氧化物酶，由酶蛋白和辅基（正铁血红素）结合而成，能催化过氧化物（如）对某些物质的氧化。反应过程中释放出的氧将无色的供氢体，如邻苯二氨（）、四甲基联苯胺（）

32、、二氨基联苯胺（）氧化成有色的产物。（）生物素标记技术生物素也称辅酶 或维生素，是有机体内许多羧化酶的辅酶。活化的生物素通过侧链上的羧基与抗体分子上的 氨基形成酰胺键连接。一般生物素标记抗体的偶联率高，不影响抗体的生物活性。生物素化的分子可用酶标亲和素或荧光染料 链霉亲和素复合物检测。八、显色蛋白质免疫印迹常用的显色方法主要有增强化学发光法和化学显色法。增强化学发光法是在辣根过氧化物酶、存在情况下，氧化化学发光物质鲁米诺（，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂的存在下，光强度可以增强 倍。通过将印迹膜放在 胶片上感光，即可检测出辣根过氧化物酶的存在。化学显色法常用的为辣根过氧化物酶法和碱性磷酸

33、酶法。碱性磷酸酶法可以将无色的底物 溴 氯吲哚磷酸盐（）转化成蓝色产物。辣根过氧化物酶可以 为底物，将二氨基联苯胺（，）或四甲基联苯胺（，）氧化成褐色产物，也可以将 氯萘酚（）氧化成蓝色产物。此方法简单、方便，一般实验室常用。九、免疫印迹技术的优缺点由于一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（如变性构象或天然构象），但在免疫印迹中靶蛋白是彻底变性的，因此并非所有单克隆抗体都适合作为免疫印迹的探针；另一方面，多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物，通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知，因此无法预测多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。十、免疫印迹技术

34、的应用（一）在基础研究中的应用 用于提纯过程中纯度的检测纯化的蛋白质通常在 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子质量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。用于未知蛋白质分子质量的测定在同一凝胶上对一系列已知分子质量的标准蛋白质及未知蛋白质进行电泳，测定各个标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子质量的对数作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白的电泳距离（或者迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子质量。（二）与流行病

35、学的关系及应用 蛋白谱用于不同菌株的分型分类细菌消化后存在的多肽分析是一种有效的技术，菌体蛋白是由细菌染色体上基因控制的，并遵循如下规律：观察到的蛋白或多肽越多，电泳谱就越能代表细菌基因组的电泳谱，因此，此技术间接反映着菌株的基因型。蛋白质的电泳分析已经证实蛋白图谱可提供与 杂交分辨力相似的结果，某些种的图谱具有高度相似性。免疫印迹谱用于微生物的指纹图分析免疫印迹是一种非常有用的技术，最近研究表明，此法可用于微生物的指纹图分析。在流行病学研究中的主要价值在于可用于鉴定凝胶染色很难全分开的电泳运动性的成分。例如，在金黄色葡萄球菌中，全菌蛋白谱分析很接近，但如将这些分离的成分转移至硝酸纤维素滤膜上

36、后，用抗体杂交，就可以观察到菌株间明显的不同。在这一试验中，既可用高效免疫抗体亦可用正常免疫血清，对抗血清的选择影响着利用此技术获得信息的多少。在新发传染病中的应用自 年 月在中国广东发现第一起严重急性呼吸系统综合征（，）病例以来。到 年 月 日，世界卫生组织报道该病已波及 多个国家和地区，累计患病人数达 人，死亡人数达到 人。经各国科学家合作研究一般认为该病的病原体为一种冠状病毒的变异体，把它命名为 冠状病毒（）。目前，的病原学检查主要包括病毒分离培养、病毒核酸及抗 抗体检测，由于病毒的分离培养和核酸检测技术相对较复杂，且阳性率较低，因此常用酶联免疫法（）和间接荧光法（）检测血清中抗 和 作

37、为 感染的血清学诊断。在自身免疫缺陷型疾病诊断中的应用国内学者刘军锋等人用免疫印迹技术对系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、干燥综合征、弥漫性硬皮肤病、多发性肌炎、类风湿性关节炎等自身免疫病患者进行可提取性核抗原多肽抗体谱检测，结果发现，上述六种疾病的可提取性核抗原谱阳性率依次为.、.、，除出现单项目自身抗体阳性外，均出现了两种或者两种以上的阳性结果，说明患者血清中含有多种自身抗体。利用免疫印迹技术检测可提取性核抗原自身抗体操作方法简便、省时、特异性好、重复性好、用血量少，不需要特殊设备，可同时完成对 种自身抗体的识别和过筛，对提高自身免疫性疾病的诊断水平有较大的帮助。在早期肿瘤诊断中的应用国内

38、学者李艳等人利用抗胸腺激酶单克隆抗体建立点免疫印迹发光法分析乳腺肿瘤患者、非肿瘤患者和体检健康者血清胸腺激酶的水平，发现三者体内的血清胸腺激酶水平具有显著的差异，该种方法可以作为乳腺癌的辅助诊断手段。第五节酶联免疫检测技术一、酶联免疫检测技术的基本原理其基本过程是先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。二、酶联免疫检测技术的方法类型 可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不同，有以下

39、三种类型的常用方法。（一）间接法此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标二抗）和底物进行测定。具体见图 （）图。其具体步骤如下：（）用已知抗原包被固相载体。（）加待检标本，经过温育（，），使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质。（）加酶标二抗，再次温育（，）与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标二抗。（）加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测光密度值定量测定。（二）双抗夹心法此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合。温育后洗涤，加入酶标二抗和

40、底物进行测定。具体见图（）图。其具体步骤如下：（）用已知特异性抗体包被固相载体。（）加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质。（）加酶标二抗，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体。（）加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。（三）竞争法此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。具

41、体见图，具体步骤如下。（）用已知特异性抗体包被固相载体。（）测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分。（）加底物显色。对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物显色反应较弱。分别测定两管的光密度（）值，根据对照管与测定管 值之比，计算标本中待测抗原含量。三、方法的技术要点（一）固相载体和免疫吸附剂的制备 法最常用

42、的固相载体是聚苯乙烯，其对蛋白质有较强的物理吸附性能，不影响抗体和抗原的免疫活性；且价格低廉，并可制成各种形状的制品。与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被，由于载体不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、包被时的温度和时间等多种因素的影响。（二）抗原和抗体如同免疫荧光技术和放射免疫测定一样，用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较高的比活性。如将抗体 用木瓜蛋白酶水解为 片段，再与酶连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。单克隆抗

43、体（，）的应用，进一步提高 法的特异性和灵敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种 分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位点夹心法，测定时可以将待检标本和酶标抗体同时加入，简化了操作程序。通常采用特异性较高的 作为固相包被抗体，与酶标记的多克隆抗体相结合进行检测，效果更好。（三）常用的酶及其底物在 法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计（酶标仪）测量光密度值，借以定量测定样品中待检抗原或抗体的含量。中常用的酶主要有辣根过氧化物酶（）、碱性磷酸酶（）、半乳糖苷酶。其底物分别有邻苯二胺（）、四甲基联苯胺（）、氨基水杨酸

44、（）、鲁咪诺、萘酚、氧基 乙基卡唑、氯 萘酚、对硝基苯磷酸酯、甲基伞形酮 半乳糖苷等。四、所用的试剂和器材（一）试剂 包被缓冲液（.,.碳酸盐缓冲液）.；.；加蒸馏水至。洗涤缓冲液（.）.；.；.；.；吐温.；加蒸馏水至。稀释液牛血清白蛋白（）.，加洗涤缓冲液至，或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成 使用。终止液（）蒸馏水.，逐滴加入浓硫酸（）.。底物缓冲液（.磷酸氢二钠 柠檬酸）.（.）.；.柠檬酸（.）.，加蒸馏水。（四甲基联苯胺）使用液（无水乙醇）.底物缓冲液（.），.。，联氮 二（乙基 苯并噻唑 磺酸）二铵盐 使用液.；底物缓冲液（.）；。抗原、抗体和酶标记抗体（二）器材（）聚苯乙烯塑

45、料板（简称酶标板）孔或 孔，检测仪，及 加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。（）小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。（）冰箱，孵育箱。五、的操作步骤（一）用于检测未知抗原的双抗体夹心法包被 用.碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加.，过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗 次，每次（简称洗涤，下同）。加样 加一定稀释的待检样品 于上述已包被的反应孔中，置 孵育。然后洗涤（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。加酶标抗体 于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）.。孵育.，洗涤。加底物液显色于各反应孔中加入临时配制的 底物溶液.，。终止反应于

46、各反应孔中加入 硫酸.。结果判定可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“”“”号表示。也可测 值：在 检测仪上，于 处（若以 显色，则于处），以空白对照孔调零后测各孔 值，若大于规定的阴性对照 值的.倍，即为阳性。（二）用于检测未知抗体的间接法用包被缓冲液将已知抗原稀释至 ，每孔加.，过夜。次日洗涤 次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）.于上述已包被的反应孔中，置孵育，洗涤。同时做空白、阴性及阳性孔对照于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗.，孵育，洗涤，最后一遍用洗液洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的、。六、的应用酶免疫测

47、定具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可测值达 甚至 水平。与放射免疫分析相比，酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定，且无放射性危害。因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。但酶免疫测定在日常检验中的普及应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。酶免疫测定步骤复杂，试剂制备困难，只有用符合要求的试剂和标准化的操作，才能获得满意的结果。均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。则应用更为广泛，可用以检测的项目包括以下几个方面：病原体及其抗体广泛应用于传染病的诊断。病毒如肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如链球

48、菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和布氏杆菌等；寄生虫如弓形虫、阿米巴虫、疟原虫等。蛋白质各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（例如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）、各种血浆蛋白质、同工酶（如肌酸激酶）、激素（如、）。非肽类激素如、雌激素、皮质醇等。药物和毒品如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。应用【本章小结】免疫检测技术一直以来用于临床疾病诊断检测方面。事实上，任何化合物只要能得到其相应的抗体，就可用免疫学技术进行检测。因此，免疫检测技术的应用范围越来越广，目前除用于诊断疾病外，还广泛应用于生物制品、食品安全等方面的检测，已成为各级医疗卫生机构、医药科研机构、农业、工业及边防检疫等各领域广为采用的重要技术手段。本章主要讲述了免疫学检测技术的基本知识，主要包括免疫学检测技术的基本原理，四种主要的免疫反应现象。包括免疫凝集试验、免疫沉淀检测技术、免疫印迹技术和酶联免疫检测技术，并利用实例阐述了这些免疫检测技术在实际中的应用。