第六章 微生物的生长与控制.ppt
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1、第六章 微生物的生长与控制第章微生物的生长与控制微生物的生长与控制六1.掌握微生物生长的概念,个体生长与群体生长的关系;2.了解环境条件对微生物生长的影响;3.了解工业上常用的微生物连续培养技术。知识目标1.会灵活运用微生物生长曲线各阶段特点指导食品发酵工艺生产实践;2.能利用各种化学物质和物理因素对微生物生长、繁殖进行有效地控制。技能目标第一节 微生物的生长u微生物生长的概念微生物生长的概念u微生物生长量的测定微生物生长量的测定一、微生物生长的概念生长生长是指微生物细胞吸收营养物质,进行新陈代谢,当同化作用大于异是指微生物细胞吸收营养物质,进行新陈代谢,当同化作用大于异化作用时,生命个体的重
2、量和体积不断增大的过程。化作用时,生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖繁殖是指是指生命个体生长到一定阶段,通过特定方式产生新的生命个体,生命个体生长到一定阶段,通过特定方式产生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生物学过程。即引起生命个体数量增加的生物学过程。个体生长个体生长是指微生物细胞个体吸收营养物质,进行新陈代谢,原生质与是指微生物细胞个体吸收营养物质,进行新陈代谢,原生质与细胞组分的增加为个体生长。细胞组分的增加为个体生长。群体生长群体生长是指群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度是指群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。来衡量。个体生长个体生长个
3、体繁殖个体繁殖群体生长群体生长群体生长群体生长=个体生长个体生长+个个体繁殖体繁殖二、微生物生长量的测定二、微生物生长量的测定二、微生物生长量的测定(一)(一)(一)(一)稀释平板菌落计数法稀释平板菌落计数法稀释平板菌落计数法稀释平板菌落计数法 是一种最常用的活菌计数法。是一种最常用的活菌计数法。是一种最常用的活菌计数法。是一种最常用的活菌计数法。是一种最常用的活菌计是一种最常用的活菌计是一种最常用的活菌计是一种最常用的活菌计数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在数法。取一定体积的稀释菌液与合适
4、的固体培养基在其凝固前均匀混合,或涂布于已凝固的固体培养基平其凝固前均匀混合,或涂布于已凝固的固体培养基平其凝固前均匀混合,或涂布于已凝固的固体培养基平其凝固前均匀混合,或涂布于已凝固的固体培养基平板上。在最适条件下培养后,从平板上(内)出现的板上。在最适条件下培养后,从平板上(内)出现的板上。在最适条件下培养后,从平板上(内)出现的板上。在最适条件下培养后,从平板上(内)出现的菌落数乘上菌液的稀释度,即可计算出原菌液的含菌菌落数乘上菌液的稀释度,即可计算出原菌液的含菌菌落数乘上菌液的稀释度,即可计算出原菌液的含菌菌落数乘上菌液的稀释度,即可计算出原菌液的含菌数。在一个数。在一个数。在一个数。
5、在一个9cm9cm直径的培养皿平板上,一般以出现直径的培养皿平板上,一般以出现直径的培养皿平板上,一般以出现直径的培养皿平板上,一般以出现5050500500个菌落数为宜数。个菌落数为宜数。个菌落数为宜数。个菌落数为宜数。技术要求技术要求:样品充分混匀,操作熟练快速:样品充分混匀,操作熟练快速(1520min1520min完成操作),严格无菌操作完成操作),严格无菌操作注意事项注意事项:每一支吸管只能用于一个稀释:每一支吸管只能用于一个稀释度,样品混匀处理,倾注平板时的培养基温度,样品混匀处理,倾注平板时的培养基温度度适用范围适用范围:中温、好氧和兼性厌氧、能在:中温、好氧和兼性厌氧、能在营养
6、琼脂上生长的微生物营养琼脂上生长的微生物误差误差:多次稀释造成的误差是主要来源,:多次稀释造成的误差是主要来源,其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作不当操作(二)血球计数板法(二)血球计数板法(二)血球计数板法(二)血球计数板法原理原理将将1cm20.1mm的薄层空间划分为的薄层空间划分为400小格,从中均小格,从中均匀分布地选取匀分布地选取80或或100小格,计数其中的细胞数目,小格,计数其中的细胞数目,换算成单位体积中的细胞数换算成单位体积中的细胞数。适用范围适用范围个体较大细胞或颗粒,如血球、酵母菌等。个体较大细胞或颗粒,如血球、酵母菌等。
7、特点特点简便、直接、快速、准确简便、直接、快速、准确(三)称干重(三)称干重(三)称干重(三)称干重 l将将一一定定量量的的菌菌液液中中的的菌菌体体通通过过离离心心法法或或过过滤滤法法分分离离出出来来,然然后后烘烘干干(干干燥燥温温度度可可采采用用105、100或或80)、称称重重。一一般般干干重重为为湿湿重重的的10%20%,而而一一个个细细菌菌细细胞胞一般重约一般重约10-1210-13g。l这这种种方方法法较较适适合合于于丝丝状状微微生生物物的的生生长长量量的的测测定定,对对于于细细菌菌来来说说,一一般般在在实实验验室室或或生生产实践中较少使用。产实践中较少使用。(四)比浊法原理原理是在
8、一定范围内,菌悬液中的细胞浓度与混是在一定范围内,菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比,即与光密度成正比,菌数越多,光浊度成正比,即与光密度成正比,菌数越多,光密度越大。因此,借助于分光光度计,在一定波密度越大。因此,借助于分光光度计,在一定波长下测定菌悬液的光密度,就可反应出菌液的浓长下测定菌悬液的光密度,就可反应出菌液的浓度。这种方法的度。这种方法的特点是快速、简便;但易受干扰。特点是快速、简便;但易受干扰。第二节 微生物的生长规律细菌的个体生长和同步生长细菌的个体生长和同步生长微生物生长曲线微生物生长曲线一、细菌的个体生长和同步生长由于微生物细胞极其微小,研究其个体生长存在着技术上由于微生物
9、细胞极其微小,研究其个体生长存在着技术上的困难。的困难。同步生长的概念:一个细胞群体中各个细胞都在同一时间同步生长的概念:一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态,称为同步生长,进行同步分裂的细胞称进行分裂的状态,称为同步生长,进行同步分裂的细胞称为同步细胞。为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相,彼同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相,彼此间形态、生化特征都很一致,因而是细胞学、生理学和此间形态、生化特征都很一致,因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。生物化学等研究的良好材料。获得获得同步生长的方法同步生长的方法主要有两类:主要有两类:环境条件
10、诱导法环境条件诱导法:变换温度、光线、培养基:变换温度、光线、培养基 等。可能造成与正常细胞周期不同的周期变化。等。可能造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法选择法:选择性过滤、梯度离心。物理方法,:选择性过滤、梯度离心。物理方法,随机选择,不影响细胞代谢。由于诱导法可能随机选择,不影响细胞代谢。由于诱导法可能造成与正常细胞循环周期不同的周期变化,所造成与正常细胞循环周期不同的周期变化,所以不及选择法好。在选择法中,有代表性的是以不及选择法好。在选择法中,有代表性的是Helmstetter-Cummings技术。技术。Helmstetter-Cummings技术原理:原理:一些细菌细胞会一些
11、细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。孔滤膜上。步骤:步骤:菌悬液通过微孔菌悬液通过微孔滤膜,细胞吸附其上;滤膜,细胞吸附其上;反置滤膜,以新鲜培养反置滤膜,以新鲜培养液通过滤膜,洗掉浮游液通过滤膜,洗掉浮游细胞;除去起始洗脱液细胞;除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞,即为下来的新生细胞,即为同步培养。同步培养。A-适应期适应期,B-对数增长期对数增长期,C-稳定期稳定期,D-衰亡期衰亡期二、微生物生长曲线该生长曲线只适用于单细胞微生物,包括细菌和酵母菌该生长曲线只适用于单细胞微生物,包括细菌和酵母菌。微生物的典微生物的典型生长曲线型生长
12、曲线适应期的特点:生长繁殖的速度几乎等于零生长繁殖的速度几乎等于零细胞形态增大,杆菌的长度增加。细胞形态增大,杆菌的长度增加。细胞内的细胞内的RNA尤其是尤其是rRNA含量增高,原生质呈嗜碱性。含量增高,原生质呈嗜碱性。合成代谢活跃,核糖体、酶类和合成代谢活跃,核糖体、酶类和ATP的合成加快,易产的合成加快,易产生诱导酶生诱导酶对外界不良环境条件例如对外界不良环境条件例如NaCl溶液浓度、温度和抗生溶液浓度、温度和抗生素等化学药物敏感。素等化学药物敏感。原因原因:适应新的环境条件,合成新的酶,积累必要的中:适应新的环境条件,合成新的酶,积累必要的中间产物。间产物。菌种的菌龄菌种的菌龄:如果以对
13、数期的:如果以对数期的“种子种子”接种,接种,则子代培养的适应期就短。则子代培养的适应期就短。接种量接种量:一般来说,接种量大,适应期就短,:一般来说,接种量大,适应期就短,反之则长。因此在发酵工业上,为缩短适应反之则长。因此在发酵工业上,为缩短适应期,一般采用期,一般采用1/10的接种量。的接种量。培养基成分培养基成分:接种到营养丰富的天然培养基中:接种到营养丰富的天然培养基中的微生物要比接种到营养单调的合成培养基的微生物要比接种到营养单调的合成培养基中的适应期短。新接种的培养基与菌种的原中的适应期短。新接种的培养基与菌种的原培养基越接近,适应期就越短。培养基越接近,适应期就越短。发酵工业上
14、需尽量缩短该期,以降低生产成本。发酵工业上需尽量缩短该期,以降低生产成本。在食品工业上,尽量在此期进行消毒或灭菌在食品工业上,尽量在此期进行消毒或灭菌 影响适应期长短的因素:影响适应期长短的因素:生长繁殖的速度很快,活菌的数目呈对数增长,因而细胞生长繁殖的速度很快,活菌的数目呈对数增长,因而细胞每分裂一次所需的代时每分裂一次所需的代时(世代时间世代时间)或原生质增加或原生质增加1倍所需的倍所需的时间最短。时间最短。细胞进行平衡生长,菌体内各种成分最均匀。细胞进行平衡生长,菌体内各种成分最均匀。酶系活跃,代谢旺盛。酶系活跃,代谢旺盛。在此时期内,菌细胞的形态特征均匀一致,最代表种的特在此时期内,
15、菌细胞的形态特征均匀一致,最代表种的特征。征。此时期内的微生物的生化特性均匀一致,并且典型。此时期内的微生物的生化特性均匀一致,并且典型。指数期的特点:指数期的特点:影响指数期微生物增代时间的因素:菌种:菌种:不同菌种的代时差别极大。不同菌种的代时差别极大。营养成分:营养成分:同一种细菌在营养物丰富的培养基中生长,同一种细菌在营养物丰富的培养基中生长,其代时较短,反之则长。其代时较短,反之则长。营养物的浓度:营养物的浓度:在营养物浓度很低的情况下,营养物在营养物浓度很低的情况下,营养物的浓度才能影响生长速率,随着营养物浓度的增高,的浓度才能影响生长速率,随着营养物浓度的增高,生长速率不受影响,
16、而只影响最终的菌体产量。如果生长速率不受影响,而只影响最终的菌体产量。如果进一步提高营养物浓度,则生长速率和菌体产量均不进一步提高营养物浓度,则生长速率和菌体产量均不受影响。受影响。培养温度:培养温度:温度对微生物的生长速率有极其明显的影温度对微生物的生长速率有极其明显的影响。响。发酵工业上尽量延长该期,以达到较高的菌体密度。发酵工业上尽量延长该期,以达到较高的菌体密度。食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 稳定期特点:特点:1.生长速率常数生长速率常数R等于等于0。2.菌体产量达到了最高值。菌体产量达到了最高值。3.合成次生代谢产物。合成次生代谢产物。
17、4.细胞内出现储藏物质,细胞内出现储藏物质,芽孢杆菌内开始芽孢杆菌内开始产生芽产生芽孢。孢。产生原因:产生原因:1.营养物尤其是生长限制营养物尤其是生长限制因子的耗尽。因子的耗尽。2.营养物的比例失调,如营养物的比例失调,如碳氮比不合适。碳氮比不合适。3.有害代谢废物的积累有害代谢废物的积累(酸、醇、毒素等)。(酸、醇、毒素等)。4.物化条件(物化条件(pH、氧化还、氧化还原势等)不合适。原势等)不合适。微生物生长与代谢产物形成的关系 微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为:的过程并不总是一致的。一般认为:初级代谢初级代谢
18、是给予生物能量和生成中间产物的过程,是给予生物能量和生成中间产物的过程,初级初级代谢产物代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程的形成往往与微生物细胞的形成过程同步,微生物生长的稳定期是这些产物的最佳同步,微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机;收获时机;次级代谢产物次级代谢产物与微生物的生存、生与微生物的生存、生长和繁殖无关。长和繁殖无关。次级代谢产物次级代谢产物的形成往往与微的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中,生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中,它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。期或衰亡期。衰亡期特点:特点
19、:1.生长速率常数生长速率常数R为负值。为负值。2.细胞的形态发生变化,出现不规则的衰退细胞的形态发生变化,出现不规则的衰退形。形。3.释放次生代谢产物,芽孢等。释放次生代谢产物,芽孢等。4.菌体开始自溶。菌体开始自溶。产生原因:产生原因:生长条件的进一步恶化,使细胞内的分解代生长条件的进一步恶化,使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢,继而导致菌体的死亡。谢大大超过合成代谢,继而导致菌体的死亡。第三节 微生物生长的环境影响及控制一、基本概念一、基本概念防腐:利用一些理化因素使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的状态。消毒:杀死所有病原微生物的措施,可达到防止传染病的目的。具有消毒作用的
20、物质称为消毒剂。灭菌:用物理或化学因子,使存在于物体中的所有生活微生物,永久性地丧失其生活力,包括耐热的细菌芽孢。一、基本概念一、基本概念 商业灭菌商业灭菌:指食品经过杀菌处理后,按照所规定的微生物检验方法,在所检食品中无活的微生物检出,或者仅能检出极少数的非病原微生物,并且它们在食品保藏过程中,是不可能进行生长繁殖的,这种灭菌方法,叫做商业灭菌。无菌无菌:即没有活的微生物存在的意思。死亡死亡:指微生物不可逆的丧失了生长繁殖的能力,即使再放到合适的环境中也不再繁殖。二、微生物生长的环境影响及控制氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响,微生物氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响,微生物对氧的需
21、要和耐受力在不同的类群中变化很大,根据对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大,根据微生物与氧的关系微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群可把它们分为几种类群:专性好氧菌专性好氧菌:好氧菌好氧菌 微好氧菌:微好氧菌:兼性厌氧菌兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌:耐氧厌氧菌:厌氧菌厌氧菌 (专性专性)厌氧菌:厌氧菌:(一)氧气对微生物生长的影响氧浓度对不同微生物生长的影响严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死,而是由于不能解除某些严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死,而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。氧代谢产物的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中,可形成某些有毒的中间产物,例如,过氧在氧还原为水的过程
22、中,可形成某些有毒的中间产物,例如,过氧化氢(化氢(H2O2)、超氧阴离子()、超氧阴离子(O2)等。超氧阴离子为活性氧,兼有)等。超氧阴离子为活性氧,兼有分子和离子的性质,反应力极强,极不稳定,可破坏膜和重要生物大分子和离子的性质,反应力极强,极不稳定,可破坏膜和重要生物大分子,分子,对微生物造成毒害或致死。对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶,如过氧化氢酶、过氧化物酶、好氧微生物具有降解这些产物的酶,如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等,超氧化物歧化酶等,而严格厌氧菌缺乏而严格厌氧菌缺乏SOD,故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自,故易被生物体内极易产生的超氧阴离子
23、自由基毒害致死。由基毒害致死。厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说:H2O+O22 O2 +2H+O2+H2O22H2OO2+eO2(O2 )超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的一种自我超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式。保护方式。兼性厌氧菌兼性厌氧菌E.coli在发生在发生SOD缺失突变后,就会变成一种缺失突变后,就会变成一种“严格厌氧菌严格厌氧菌”。生物体中超氧阴离子的形成与去除生物体中超氧阴离子的形成与去除12SOD好氧生物和耐氧细菌过氧化氢酶 好氧生物过氧化物酶 NADH2NAD耐氧
24、菌专性好氧菌专性好氧菌必须在有分子氧的条件下才能生长,有完整的呼吸链,以分必须在有分子氧的条件下才能生长,有完整的呼吸链,以分子氧作为最终氢受体,细胞含有超氧物歧化酶(子氧作为最终氢受体,细胞含有超氧物歧化酶(SOD,superoxide dismutase)和过氧化氢酶。和过氧化氢酶。绝大多数真菌、多数细菌和放线菌。绝大多数真菌、多数细菌和放线菌。在有氧或无氧条件下均能生长,但有氧情况下生长得更好,在有氧或无氧条件下均能生长,但有氧情况下生长得更好,在有氧时靠呼吸产能,无氧时接发酵或无氧呼吸产能;细胞含在有氧时靠呼吸产能,无氧时接发酵或无氧呼吸产能;细胞含有有SOD和和过氧化氢酶。过氧化氢酶
25、。许多酵母菌和不少细菌。许多酵母菌和不少细菌。微好氧菌只能较低的氧分压下才能正常生长,通过呼吸链并以氧为最只能较低的氧分压下才能正常生长,通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。霍乱弧菌、发酵单胞菌属、弯曲菌属等。终氢受体而产能。霍乱弧菌、发酵单胞菌属、弯曲菌属等。兼性好氧菌兼性好氧菌耐氧菌耐氧菌可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧,分子可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧,分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链,依靠专性发酵获得能量。细胞内存在氧也对它无毒害。不具有呼吸链,依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶,但缺乏过氧化氢酶。和过氧化物酶,但缺乏过氧化氢酶。
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