蛋白质定量及脂蛋白电泳.ppt

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1、实验三实验三 测定蛋白质的比色分析法测定蛋白质的比色分析法双缩脲法双缩脲法LowryLowry氏氏法法教师：王丽华教师：王丽华实验目的实验目的1.1.掌握双缩脲法及掌握双缩脲法及LowryLowry氏法测定蛋白氏法测定蛋白 浓度的原理浓度的原理;2.2.学会使用分光光度计学会使用分光光度计;实验原理实验原理1 1、分光光度法及比色分析法、分光光度法及比色分析法2 2、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律3 3、颜色反应、颜色反应分光光度法及比色分析法分光光度法及比色分析法 应应用用分分光光光光度度计计测测定定溶溶液液的的吸吸收收光光谱谱及及其其对对某某一一波波长长光光线线的

2、的吸吸收收能能力力，可可以以作作为为物物质质定定性性或或定定量量检检查查的的方方法法,称称为为分分光光光度法。光度法。u 紫外分光光度法紫外分光光度法u 比色分析法（可见光分光光度法比色分析法（可见光分光光度法）u 红外光谱法红外光谱法u 荧光光度法荧光光度法u 化学发光分析法化学发光分析法分类：分类：一、物质对光的选择性吸收和吸收光谱一、物质对光的选择性吸收和吸收光谱（一）物质的颜色和光的波长的关系（一）物质的颜色和光的波长的关系光是一种电磁波；光是一种电磁波；自自然然光光是是由由波波长长不不同同的的电电磁磁波波组组成成的的混混合合光，光，在在400-760nm400-760nm范围。范围。

3、光的互补色示意图光的互补色示意图(/nm)/nm)绿500580nm黄580600nm紫400450nm白光青490500nm橙600650nm红650750nm蓝450480nm青蓝480490nm物质的颜色实质是物质的颜色实质是它所吸收的色光的互补色它所吸收的色光的互补色。吸收黄光吸收黄光透过蓝光透过蓝光透过蓝光透过蓝光白光白光人眼人眼CuSOCuSO4 4uu实验证明：实验证明：实验证明：实验证明：CuSOCuSOCuSOCuSO4 4 4 4溶液浓度越高，对黄色光的吸收越溶液浓度越高，对黄色光的吸收越溶液浓度越高，对黄色光的吸收越溶液浓度越高，对黄色光的吸收越 多，表现为透过的蓝色越强

4、，溶液的蓝色也越深。多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深。多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深。多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深。u比较溶液颜色的深浅，实质比较溶液颜色的深浅，实质比较溶液对光的吸收程度比较溶液对光的吸收程度互补色光互补色光如：黄光和蓝光；紫光和绿光。如：黄光和蓝光；紫光和绿光。（二）吸收光谱曲线（二）吸收光谱曲线吸收光谱曲线吸收光谱曲线 横坐标横坐标；纵坐标；纵坐标A A。最大吸收波长最大吸收波长 max max 同种物质：同种物质：C C不同，不同，maxmax相同相同 maxmax二、Lambert-Beer定律I I0 单单色色光光透光度透光度 T

5、=I/I0 D=Lg I/I0=KCL u D D值：光密度（值：光密度（OD.OD.）表示溶液对光线的吸收量。表示溶液对光线的吸收量。亦称为吸收度亦称为吸收度 （A A）u C C：溶液的浓度：溶液的浓度u L L：溶液的厚度：溶液的厚度u K K：常数，称为消光系数：常数，称为消光系数 表示物质对光线吸收的本领表示物质对光线吸收的本领 取决与物质的取决与物质的种类种类和和波长波长。D=KCL u 单色光单色光u 稀溶液稀溶液u 吸收峰值吸收峰值(max)max)u 稳定的溶液稳定的溶液 Lambert-Beer Lambert-Beer定律的适用条件定律的适用条件三、比色分析法三、比色分析

6、法u许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色在加入适当的显色剂后生成有色物质。身无颜色在加入适当的显色剂后生成有色物质。u溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用比较溶比较溶液颜色深浅的方法液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。来测定有色溶液的浓度。u比色分析法：用可见光光源测定有色物质，也称比色分析法：用可见光光源测定有色物质，也称为可见光分光光度法。为可见光分光光度法。以以Lambert-BeerLambert-Beer定律定律为基础为基础比色分析法比色分析法u当溶液的厚度不变当溶液的厚度不变 (L)(L)

7、u对于同一物质和同样波长的单色光，即对于同一物质和同样波长的单色光，即消光系数不变消光系数不变(K)(K)u溶液的光密度和溶液的浓度成正比。溶液的光密度和溶液的浓度成正比。即：即：D D1 1/D/D2 2=C=C1 1/C/C2 2D=KCLD=KCL1 1、标准管法标准管法：D D1 1/D/D2 2=C=C1 1/C/C2 2 （比色分析法的依据比色分析法的依据 ）2 2、标准曲线法：标准曲线法：分析大批样品时。分析大批样品时。3 3、利用消光系数计算。、利用消光系数计算。计算方法：计算方法：分光光度计分光光度计 光源 单色光器 吸收杯测光机构操作一操作一 Lowry Lowry氏法测定

8、蛋白质含量氏法测定蛋白质含量标准曲线法标准曲线法1 1、实验原理实验原理2 2、操作步骤操作步骤3 3、计算方法、计算方法4 4、试剂及器材、试剂及器材操作二操作二 双缩脲法测定血清总蛋白双缩脲法测定血清总蛋白计算法计算法3 3、计算方法、计算方法1 1、反应原理、反应原理2 2、实验步骤、实验步骤4 4、试剂及器材、试剂及器材实验十二实验十二血清脂蛋白的琼脂糖血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳理论知识理论知识血浆脂蛋白血浆脂蛋白血血脂脂与与血血浆浆中中的的蛋蛋白白质质结结合合，以以脂脂蛋蛋白形式而运输。白形式而运输。血脂包括：血脂包括：TGTG、chch和和FFAFFA等等蛋白质：载脂蛋白蛋

9、白质：载脂蛋白(apolipoprotein)(apolipoprotein)乳糜微粒乳糜微粒 CM CM极低密度脂蛋白极低密度脂蛋白 VLDL VLDL低密度脂蛋白低密度脂蛋白 LDL LDL高密度脂蛋白高密度脂蛋白 HDL HDL血浆脂蛋白的分类血浆脂蛋白的分类血浆脂蛋白的结构血浆脂蛋白的结构 疏水性较强的疏水性较强的TGTG及及胆固醇酯胆固醇酯位于位于内核内核。具具极极性性及及非非极极性性基基团团的的载载脂脂蛋蛋白白、磷磷脂脂、游游离离胆胆固固醇醇，以以单单分分子子层层借借其其非非极极性性疏疏水水基基团团与与内内部部疏疏水水链链相相联联系系，极极性性基基团团朝外。朝外。电泳的基本原理电泳

10、的基本原理1 1、概念、概念 指指带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中向向着着与与其其所所带带相反电荷的电极移动的现象。相反电荷的电极移动的现象。2 2、迁移率（泳动度）、迁移率（泳动度）带电颗粒在单位电场中泳动的速度。带电颗粒在单位电场中泳动的速度。3 3、影响电泳速度的因素、影响电泳速度的因素内在因素内在因素:样品自身性质（大小、形状、电荷）样品自身性质（大小、形状、电荷）外在因素外在因素:电场（电压、电流、电阻）电场（电压、电流、电阻）缓冲液（离子强度、缓冲液（离子强度、pHpH值）值）支持介质支持介质4 4、脂蛋白电泳的基本原理、脂蛋白电泳的基本原理 各各种种脂脂蛋蛋白白中中所所含含载载脂

11、脂蛋蛋白白的的种种类类及及数数量量不不同同，各各种种脂脂蛋蛋白白颗颗粒粒大大小小、带带电电荷荷的的数数量量相相差差也也很很大大，因因此此以以琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶为为支支持持物物，在在电电场场中中可可使使各各种脂蛋白颗粒分离开来。种脂蛋白颗粒分离开来。实实 验验 操操 作作3737水浴中染色水浴中染色3030分钟分钟血清：血清：0.2ml0.2ml苏丹黑染色液苏丹黑染色液0.02ml0.02ml摇摇 匀匀1 1、预染血清、预染血清离心（离心（40004000转分）约转分）约5 5分钟分钟2 2、制备琼脂糖凝胶板、制备琼脂糖凝胶板 将将0.5%0.5%琼脂糖凝胶于微波炉中加热融化琼脂糖凝胶于微波炉中加热融化,浇注到电泳槽内，静止待其凝固。浇注到电泳槽内，静止待其凝固。3 3、加样、加样:预染血清预染血清2020微升微升 (注意注意:不要吸取底部的染料颗粒不要吸取底部的染料颗粒)4 4、电电泳泳:样样品品放放于于阴阴极极一一端端。接接通通电电源源，恒恒压压电泳电泳100V100V约约3030分钟，即可见到分离的区带。分钟，即可见到分离的区带。5 5、观察并记录电泳结果、观察并记录电泳结果 CM 前前 血浆脂蛋白的电泳图谱VLDLLDLHDL正常参考值（百分比）：-脂蛋白 25.74.1%(HDL)前-脂蛋白21.04.4%(VLDL)-脂蛋白 53.35.3%(LDL)