园林遗传实验考试.docx

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1、园林遗传实验考试 第一篇：园林遗传试验考试 1， 什么叫核型分析，核型分析过程中应遵守哪些原则？ 2， 根据着丝粒的位置，染色体可分为哪几种类型？ 3， 核型分析试验中，测量染色体总长度时是否应包括随体，次缢痕？ 4， 核型分析试验中，测量染色体短臂长度时是否应包括随体，次缢痕？ 5， 减数分裂按染色体的行为转变可分为哪些时期？各时期具有什么特点？ 6， 减数分裂染色体数目减半发生于第几次减数分裂之后？ 7， 简述有丝分裂和减数分裂的异同点。 8， 用含两对同源染色体一对中着丝粒染色体，一对近端着丝粒染色体的细胞模式图说 明有丝分裂中期与减数分裂中期，中期的染色体行为特征。 9， 染色体制片试

2、验中，对试验材料的选择有什么要求？ 答： 10， 染色体制片试验中，常运用秋水仙素处理试验材料，其作用何在？ 答：通过秋水仙素预处理，来降低细胞质的粘度，促使染色体缩短分散，阻碍纺锤体形成。 11， 染色体显带可分哪几种？ 答：C/G/R/N/T带。 12， 染色体显带有什么意义？ 13， 简述BSG法显示C带的原理？ 答：染色体经过比较湿和的Ba(OH)2,变性处理后DNA众链解开。再在盐液SSC中温育复性，复性时异染色质较常染色质快，可以优先与Giemsa结合，染色较深，而常染色质则着色浅，从而在整条染色体上形成深浅不一的带纹。 14， 简述CTAB法提取DNA的原理。 答：CTAB是一种

3、阳离子去污剂，它可以溶解生物膜，使细胞中DNA复合体，释放出来，并使Pro变性，使DNA与Pro分别。最终用乙醇使DNA沉淀。 15， DNA有哪几部分组成，根据其结构组成，可用哪些方法鉴定DNA？ 16， CTAB法提取DNA时，加入氯仿-异戊醇的作用是什么？ 17， 简述DNA和RNA核蛋白溶解性受盐浓度影响的差异。 18， DNA提取试验中，加入氯仿-异戊醇混合液后离心会出现什么现象,每一层分别是什么 物质？ 19， DNA具有紫外吸光性，其最大汲取波峰和最小汲取波谷的波长分别是多少？ 20， 已知OD260=0.800，OD280=0.600，试分析DNA的纯度。 21， 已知纯的双链

4、DNA在260nm的吸光值是0.545，计算双链DNA的浓度。 22， 在DNA提取试验中，最终通常加入什么试剂使DNA沉淀？ 23， 画出DNA在220-300nm的紫外汲取光谱图 24， 在琼脂糖凝胶电泳试验中，影响DNA电泳速率的因素有哪些？ 25， 在琼脂糖凝胶电泳试验中，DNA点样端应放在正极还是负极，为什么？ 26， 在琼脂糖凝胶电泳试验中，DNA一般与什么试剂混匀后点样，该试剂主要有哪些成 分？分别有什么作用? 27， 遗传平衡定律：遗传平衡定律是在一个大的群体中，进行随机婚配而非选择性婚配， 没有自然选择，没有突变发生，没有大规模迁移等条件下，群体中的基因频率和基因型频率在一代

5、代繁殖过程中保持稳定的现象，也称Hardy-Weinber。 28， PTC尝味实力的孟德尔群体进行遗传分析，强味觉显性纯合体的有150人，中味 觉杂合体的有800人，味盲隐性纯合体有50人，计算p、q、D、H、R 其次篇：遗传试验教案学生版 试验 一、 减数分裂3学时 一、试验目的 了解高等植物的花粉减数分裂过程，视察其染色体的动态转变，领悟减数分裂过程在遗传学基本理论中的意义。 二、试验原理 减数分裂的定义 减数分裂各时期的主要特征：前期I:细线期染色体成瘦长的线状，核膜完好；偶线期同源染色体起先配对；粗线期非姊妹染色单体间可能发生交换；双线期出现交叉；终变期交叉端化，染色体最为短粗，是计

6、数染色体最正确的时期。 中期I染色体排列在赤道板上，后期I同源染色体分开移向两极，末期I形成两个子细胞 其次次减数分裂同有丝分裂 遗传学意义：1遗传 2变异 粗线期及后期I可产生变异 三、用具及药品 显微镜、解剖针、盖玻片、载玻片、镊子、醋酸洋红、卡诺固定液、乙醇 四、试验步骤 1、 取材和固定 培育大葱，当花蕾呈嫩绿色外表光滑时进行取材，时间是上午7-10时，将花序总苞剥去，马上投入到卡诺固定业中固定4-24小时，经95乙醇和70乙醇各冲洗30分钟，然后换入70乙醇中保存，4度下可保存一年以上。 2、 染色 取发育程度不同的花序，每个花序按上、中、下不同部位分别镊取2-3个花蕾放于载片上，用

7、解剖针剥出花药，加1滴醋酸洋红染色液，用解剖针反复挤压花药，使花粉母细胞进入染液中，染色5-10分钟。较大的花药可以用刀片横切成3-4段，然后再挤压。 3、 压片 将载玻片放在酒精灯上微烤几次，在材料处加上盖玻片覆以吸水纸，用拇指均匀用力压片。 4、 视察 五、作业 绘出所视察的花粉母细胞减数分裂各个时期的分裂相。 六、留意事项 1、 操作过程尽量削减花粉母细胞的遗失 2、 留意区分第一次减数分裂和其次次减数分裂的细胞第一次细胞为一个大的圆形的细胞，其次次为两个长椭圆型的细胞 3、 区分花粉母细胞和花药壁细胞后者为半月型细胞核均匀 4、 前期、中期区分核膜有无，后期、末期区分细胞板是否形成 需

8、要配制药品： 试验 二、 染色体组型分析6学时 一、试验目的 学习染色体组型分析的方法，了解染色体组型分析的意义 二、试验原理 染色体组genome：一个二倍体生物配子所含有的全套染色体，称为一个染色体组。而染色体组在细胞分裂中期的表型称为染色体组型或称核型，包括染色体数目即基数、形态、大小、着丝点位置及副缢痕、随体的有无等特征。 染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对分组、排列，对组内各染色体的形态进行测量、描述，从而说明生物染色体组成的过程。 染色体组型分析的意义： 1 分析未知生物的染色体数目，推断其倍数。首先计数总的染色体数目，然后根据2 3 染色体的形态特

9、征进行分组、配对。 将未知生物的染色体组型特征与已知生物的染色体组型特征进行比较，进而对未知生物进行分类，归属于具体的门、纲、目、科、属、种、甚至亚种。 染色体组型分析可以用来鉴别染色体变异包括结构变异和倍数性变异。 三、用具与药品 剪刀、镊子、直尺、硬纸板、浆糊等 四、试验步骤 1、 制作有丝分裂中期染色体玻片标本 接受植物根尖如蚕豆、洋葱、大蒜、玉米等去壁低渗法 培育材料预处理前低渗固定酶解去壁后低渗滴片染色 2、 选材与显微摄影 选材：细胞间无重叠，胞内染色体数目完好，每条染色体间无重叠，分散良好，染色体粗细适中，都伸绽开，处于同一平面上，并且染色显明、形态清晰、着丝粒明显，随体可见。

10、选取上述的细胞进行显微照相。取清楚的底片放大成8cm x 4cm左右的黑白照片。 万寿菊7对14条 3、 测量首先对每条染色体随机标号 测量每条染色体的长臂长度和短臂长度。以着丝粒为起点若着丝粒过大将其一分为二分别量至长臂末端和短臂末端以中间为准单位为毫米，有随体的染色体，随体的长度可以记入也可以不记入染色体长度之内，但应说明。另外染色体弯曲不能用直尺测量的，可以先用细线量取与染色体等长的长度，再用尺子量出线的相应长度。 4、 计算 确定长度、相对长度、臂比、着丝粒指数 总长度1/n全部染色体长度之和即染色体组内全部染色体长度之和。相对长度可降低误差，臂比表示两臂相对长度，比值越大，说明二者长

11、度相差越悬殊，进而推断着丝粒位置，长度相近着丝粒位于中心，悬殊时着丝粒靠近短臂末端。 着丝粒指数：为整数如37表示37，即短臂长度占染色体总长的37，用短臂所占的比例来描述着丝粒的位置。 5、 配对 根据：同源染色体特征相像形态、大小、着丝粒位置、随体有无 1 从形态上初步推断 2在形态相像染色体的基础之上比较相对长度 3着丝粒位置，根据臂比值或着丝粒指数推断 4有随体的根据随体的大小和位置推断。 比照片上的染色体进行粗剪并进行配对。 6、 排列 先画始终线，将染色体由大到小，短臂在上，长臂在下，着丝粒在直线上进行排列。等长的染色体以短臂长的在前，带随体的染色体及性染色体排在最终。 7、分类：

12、 根据臂比值或着丝粒指数确定着丝粒位置，进而按照着丝粒的位置将染色体分为四类。 1中部着丝粒染色体M：臂比1.0-1.7 着丝粒指数 37-50 2近中着丝粒染色体SM：1.73.0 2537 3近端着丝粒染色体ST： 3.07.0 1225 4端部着丝粒染色体T： 7.0以上 12一下 8、剪贴 并写出核型公式 如：K=2n106m+2sm+2st核型公式的意义： sat 作业：完成一种作物的染色体组型分析图 试验 三、 Hardy-Weinberg遗传平衡定律的验证3学时 一、试验目的 在调查本班同学某些遗传性状的基础上，学会计算限制各性状的基因频率和基因型频率，驾驭运用Hardy-Wei

13、nberg 遗传平衡定律进行遗传性状分析的方法。 二、试验原理 群体：指一群同种个体所组成的集合。群体遗传学中的群体不是许多个体的简洁集合，而是一种特定的孟德尔群体，特指能进行随机交配的群体。在有性繁殖的生物中，一个物种就是一个最大的孟德尔群体。 随机交配：指在有性生殖的生物中，一种性别的任何一个个体都有同样的机会和相反性别的个体交配的方式称为随机交配。自花授粉植物形成的群体不是孟德尔群体，无性繁殖的群体也不是孟德尔群体。 探讨群体中的遗传结构，主要通过探讨基因频率和基因型频率来表达，使之具有可分析的形式，视察其在上下代之间的转变。 基因频率：指一个群体中某种基因的数量与群体中该基因的全部等位

14、基因的比例。 基因型频率：指群体中某种基因型的数量与该群体中全部等位基因组成的基因型总数之比。 遗传平衡定律：1908年英国数学家Hardy和德国物理学家Weinberg各自独立地运用数学方法探讨基因在群体中的行为规律时得出一样的结论。内容：在一个充分大的Mendel群体中，其个体间进行随机交配，假设没有自然选择的作用，没有新的突变发生，也没有个体的大规模迁移，则群体中的基因频率和基因型频率为一个常数，可以一代代传下去，保持不变。 人类一些相对性状是由一对等位基因限制的，按孟德尔方式遗传，假定某群体在某位点上的基因A的频率为p、基因a的频率为q，如群体处于遗传平衡，则基因频率和基因型频率保持如

15、下关系： 2=p2(AA)+2pq(Aa)+q2(aa) 现分两种状况介绍： 2、 不完全显性时 如人类对PTC尝味实力的差异表现不完全显性的遗传。也就是可以视察到三种表现型，这样就能干脆从三种表现型基因型的视察数算出表现型频率，进而算出基因频率。现假定某人群为： 基因型 AA Aa aa 基因型视察数 P H Q P+H+Q=N 三种基因型的频率为P(AA)=P/N H(Aa)=H/N Q(aa)=Q/N 于是基因频率为p(A)=P+1/2H q(a)=Q+1/2H 或q=1-p 又假定该人群处于遗传平衡状态，根据已估出的p和q即可算出三种基因型的理论频率及其相应人数。再与相应的实际视察人数

16、比较，运用卡方检验，即能得出该人群是否处于遗传平衡状态的结论。 2、完全显性时 另外一些性状，如卷舌与非卷舌，有耳垂与无耳垂，由于基因A对基因a为显性，所以只能区分两种表现型，因此不能用表现型视察数干脆算出基因频率。但我们可以假定该性状处于遗传平衡状态，于是表现型包括AA和Aa的频率为p2+2pq,另一表现型(基因型aa)的频率为q2，由此可用下式分别计算出p和q。 q= p=1-q 根据已算出的p和q值，推算出各基因型频率。最终算出显性表型中纯合体和杂合体的比例。 三、试验用品 苯硫脲PTC溶液1-14号，或乙醇1-13号 称取1.3gPTC定溶于1000ml蒸馏水中，该溶液为1号，按等量对

17、半稀释到14号为止。 取25乙醇为13号，按等量对半稀释到1号为止。 四、试验步骤 1、PTC味盲基因测试 从14-1号逐个品尝，根据尝到苦味的阈值推想基因型。尝试阈值11号为纯合尝味者TT，10-7号为杂合尝味者Tt，7号为味盲型tt。 2、嗅阈测试 从1-13号逐个闻下去，直到有味为止，高度敏感型阈值为第1-6号，中度敏感型为7-11号，不敏感型或嗅盲型为12-13号。 3、卷舌和耳垂的调查 能将舌的两侧卷起呈“U型为卷舌者表型为，非卷舌者为；有耳垂指耳朵下缘与头部连接处向上有凹陷者表型为，无耳垂为。 五、作业 1、分别计算本班嗅觉基因的频率，检验分析该性状在本班是否处于遗传平衡状态。 2

18、、计算卷舌和耳垂的基因型频率，并推算显性表型中纯合体和杂合体的比例。 试验 四、果蝇的性状视察及饲养3学时 一、试验目的 1、了解果蝇生活史及各个阶段的形态特征 2、区分雌雄果蝇及常见突变型的主要特征 3、驾驭果蝇的饲养管理技术 二、试验原理 黑腹果蝇为双翅目昆虫，个体发育为完全变态。用作试验材料有以下优点：1简洁饲养，生活周期短，25度左右10天繁殖一代。2繁殖实力较强，一只受精的雌蝇可产卵400-600个，因此可在短期内获得较大的子代群体，有利于遗传学分析。3突变类型多，有400个以上，且多数为形态特征的变异，便于视察。4唾腺染色体较大。因此，在遗传学探讨中，果蝇作为试验材料被广泛运用。

19、三、材料与用品 1、材料 野生型及突变型果蝇 2、用具及药品 双筒解剖镜，放大镜，麻醉瓶、培育箱、白瓷板、毛笔、棉塞、载片、恒温培育箱、吸水纸；乙醚。 四、试验步骤 1、果蝇生活史的视察 1卵：白色长椭圆型，0.5mm左右，在其反面的前端具有两个触丝。 2幼虫：从卵中孵化出来后即为一龄幼虫，一龄幼虫蜕皮后成为二龄幼虫，二龄蜕皮后成为三龄幼虫，三龄幼虫较大，活动力强，常爬在培育基外表或培育瓶壁上。 3蛹：幼虫经6-7天后即化蛹，附于瓶壁上，呈梭型，初期松软呈淡黄色，以后慢慢硬化变成深褐色，深褐色的蛹就要羽化了。 4成虫：刚羽化出来的果蝇，虫体较长，半透亮乳白色，翅未完全绽开。过12小时后，双翅伸

20、绽开，体色加深，各种性状趋于明显。 5影响果蝇生活史的因素： I、养分条件：果蝇的食物是酵母菌，培育基发酵良好，酵母菌足够即可。 II、温度：相宜温度为10-25度，并随温度上升生活周期缩短，10度57天，15度18天，20度15天，25度10天，低于10度、高于30度果蝇不育或死亡。 2、麻醉果蝇 1制备麻醉瓶：用培育瓶或与培育瓶口径相同的玻璃瓶及橡胶塞棉花图钉组成 2引出果蝇：将有果蝇的培育瓶用手轻拍，使果蝇震落瓶底，快速拔出棉塞，将麻醉瓶与培育瓶的两口相对，培育瓶在上，麻醉瓶在下，用手轻拍瓶壁或轻轻摇摆使果蝇落入麻醉瓶。或培育瓶在下，麻醉瓶在上，并朝向灯光处，双手遮住培育瓶，利用果蝇的趋

21、光性和向上性，将果蝇引人麻醉瓶。 3麻醉：在麻醉瓶瓶塞的棉花上滴1-2滴乙醚，快速塞入麻醉瓶瓶口，0.5-1分钟左右大部分果蝇即被麻醉落入瓶底，摇动麻醉瓶，全部果蝇震落瓶底，之后马上将果蝇倒在白瓷板上，用毛笔留神拨动视察，若翅膀外展45度角说明果蝇已被麻醉致死。若中途有复苏的，需在滤纸上滴加1滴乙醚，并用培育皿盖住。 视察后要将果蝇放回原来的培育瓶，将培育瓶横放，然后用毛笔将果蝇扫入培育瓶中，待果蝇醒悟后再将瓶竖起。 3、成虫雌雄性别的区分： 体型 腹部 第一对足 4、果蝇常见突变型性状的视察 突变名称 白眼 黑檀体 残翅 焦刚毛 雌果蝇 大，末端尖，背部环纹5节，无黑斑 腹片7节 跗节基部无

22、性梳 雄果蝇 小，末端钝，背部环纹3节，有黑斑 腹片5节 跗节基部有黑色鬃毛状性梳 基因符号 W E Vg sn 性状特征 复眼白色 身体成乌木色，黑亮 翅明显退化，部分残留，不能飞 刚毛卷曲如烧焦状 在染色体上座位 X1.5 IIIR70.7 IIR67.0 X21.0 5、果蝇培育基的配制 水 100ml 五、作业 写出果蝇性状视察中的留意事项及原种保存中应留意的事项。 琼脂 1g 玉米粉 10g 蔗糖 10g 酵母粉 0.5g 丙酸 0.5ml 试验 五、果蝇杂交大试验6学时 一、试验目的 验证分别定律、自由组合定律、伴性遗传定律 二、试验原理 1、分别定律 F2分别比3：1 2、自由组

23、合定律 F2分别比为9：3：3：1 3、伴性遗传 正反交结果是否相同 例：培育灰身果蝇过程中出现黑身果蝇，请问1黑身为显性、隐性？ 2该基因位于常染色体还是性染色体？3由几一对等位基因限制？ 4、卡方检验 三、试验步骤 1、设计杂交组合 2、选择处女蝇 因为雌蝇体内有一贮精囊，一次交配后可保存大量精子供多次排卵受精用。刚孵化出的果蝇一般8小时之内不进行交配，所以将雌雄分开，所得的雌蝇即为处女蝇。 3、F1幼虫出现时移去亲本果蝇 4、从F1中选择3-5对转移到新的培育瓶中培育F2代 5、F2幼虫出现时移去F1成蝇 6、视察F2成蝇 7、统计分析 试验 六、果蝇唾腺染色体的视察3学时 一、试验目的

24、 1、练习分别果蝇幼虫唾腺的技术 2、学习唾腺染色体制片方法 3、视察唾腺染色体结构的特点，了解其在遗传学中的意义。 二、试验原理： 双翅目昆虫假如蝇、摇蚊等的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾腺染色体。这些巨大的染色体具有许多重要特征，为遗传学探讨的许多方面如染色体结构、化学组成、基因差异表达等供应了独特的探讨材料。 双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到确定阶段之后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约10004000拷贝的染色体丝，合起来达5m

25、宽、400m长，比一般中期分裂相染色体大得多约100150倍，所以又称为多线染色体和巨大染色体。 唾腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，称为体细胞联会、在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤丝合在一起，紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数位2n=24，其中第II、第III染色体为中部着丝粒染色体，第IV和第IX染色体染色体为端部着丝粒染色体。而唾腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚在一起形成一染色中心，所以在光学显微镜下可见从染色中心处伸出6条配对的染色体臂，其中5条为长臂，1条为紧靠染色中心的很短的臂。 由于唾腺细胞在果蝇幼虫

26、期始终处于细胞分裂的间期状态，每条核蛋白纤丝都处于伸展状态，因此不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同、疏密各异的横纹。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列依次都具有种的特异性。探讨认为，这些横纹与染色体的基因是有确定关系的。从其横纹分布特征可对物种的进化特征进行比较分析，而一旦染色体上发生了缺失、重复、倒位、易位等，也可较简洁地在唾腺染色体上视察识别出来。可见唾腺染色体技术上遗传学探讨中一项基本的技术。唾腺染色体上的横纹宽窄、浓淡是确定的，但在果蝇的特定发育时期会出现不连续的膨胀，称为疏松区。目前人们认为这是这部分基因被激活的标记。 多线染色体的特征：1染色体

27、巨大，远远超过一般体细胞染色体大小；2唾腺细胞始终处于分裂的前中期状态，且同源染色体配对在一起，故视察到的多线染色体数为n；3各条多线染色体上具有异染色质的着丝粒部分互相靠 拢，形成染色中心；4由于DNA螺旋化程度不同，多线染色体上的横纹，表现深浅不同、疏密相间，是基因所在的位置。 三、材料及用品 生理盐水NaCl 7.5g, KCl 0.35g CaCl2 0.21g顺次溶于1000ml蒸馏水中 解离液20HCl ： 45%醋酸3：1或4：1或5：1，1龙胆紫染液 四、试验步骤 1、幼虫的培育 18度，水分多的培育基，酵母菌足够 2、剖取唾腺 3、解离 在唾液腺上加解离液解离3分钟，用吸水纸

28、将解离液吸去，并用蒸馏水冲洗2-3次。 4、染色 滴一滴甲苯胺蓝染色液染色3-5分钟，之后用吸水纸吸去染液，并用蒸馏水冲洗多余的染液。 5、压片 加一滴蒸馏水放上盖片、覆以吸水纸用针柄轻敲几下，然后用拇指用力朝一个方向揉片。 6、视察 光圈尽量调暗些 五、作业 绘出果蝇唾腺染色体图 试验 七、视察不同诱变因素对染色体结构的影响3学时 一、试验目的 1、了解不同诱变因素对遗传物质的效应及诱变机制 2、学习诱发植物染色体结构变异的方法 3、相识畸变的几种类型 二、试验原理 常见畸变有染色体粘着、着丝点区域断裂、破坏纺锤丝形成、染色体或染色单体的断裂，出现环状染色体及“染色体桥和落后染色体异样等现象

29、。 微核：是在理化因素作用下，细胞质内产生的一种小核。在不同的细胞中，这些小核的数目不等。小核中如有核仁则具有合成DNA的实力。微核的来源可能来自染色体损伤后的一些无着丝点断片；也可能是纺锤丝受损后，由各别落后的染色体形成。微核存在于细胞分裂的各个时期，简洁视察。 染色体畸变检测方法：1在有丝分裂中、后期细胞中，统计染色单体断裂、无着丝点断片和桥等的出现频率，这是一种比较客观、精确的遗传毒理学技术。2微核检测法：由于微核可以出如今细胞分裂的全部时期，因此视察时，不必考虑分裂相的多少，这种方法简便、敏感。实践中往往将上述两种方法结合运用，效果可更为精确。 在遗传学探讨、遗传疾病的诊断以及致突变致

30、癌致畸变物质的检测方面应用较多。 三、材料及用品 R射线处理的种子，硫酸二乙脂处理的种子 盐酸酒精解离液 龙胆紫染液 45醋酸 四、试验步骤 1、根尖培育 2、固定 3、解离 根尖解离10分钟水洗45醋酸软化5分钟水洗 4、染色及压片 染色5-8分钟 5、视察 五、作业 1、表达诱变原理及检测方法 2、视察不同诱变统计细胞中畸变频率 3、绘出辐射处理后染色体发生畸变的有丝分裂制片图 试验八 拟南芥的有性杂交 一、试验目的 1. 了解拟南芥作为模式生物的特点 2. 学习并驾驭植物有性杂交的方法 二、试验原理 1. 拟南芥的形态学特征 拟南芥Arabidopsis thaliana为十字花科拟南芥

31、属。一年生细弱草本植物。株高15至30厘米，随生长环境或培育条件转变。基生叶多数，长圆形或椭圆形，呈莲座状排列。茎生叶具短柄或无柄。总状花序顶生，花瓣白色；雄蕊6枚4强2短，花药黄色；雌蕊圆柱状。长角果线形，长约10至16毫米，成熟时开裂。种子呈卵形，长约1毫米，成熟时红褐色。 2. 拟南芥的培育方法 将种子用10%的漂白水或0.5%次氯酸钠消毒20-30分钟，经无菌水冲洗3-4遍后，在无菌条件下播种到MS培育基上，4春化2-4天后，在22,16h光照、相对湿度70%左右的条件下培育，当幼苗具有4-6片真叶时，移入培育土中在温室中生长即可。由于个体小，很简洁在面积有限的温室或人工气候室内大批量

32、地种植；而且，拟南芥对生长条件的要求并不特别严格，这一特点使得在试验工作中很简洁实现拟南芥的栽培管理。 在一般的栽培条件下，完成一个生长周期大约需8周左右的时间。还可人为限制条件如变更温度、延长光照时间缩短生长周期。拟南芥的这一特性使试验工作周期大大缩短，特别是对于许多遗传分析工作，比利用一般的高等植物材料如麦类、豆类作物可以成倍的地节省时间。 3. 拟南芥的遗传学特性 既可以自交、又可人工杂交，在自然条件下，拟南芥是典型的自交繁殖植物，这使得拟南芥在种植繁种过程中得以保持其遗传上的稳定性。同时在试验过程中，根据探讨目的又可 便利地实施人工杂交，使得遗传分析工作很简洁完成。 在培育条件良好的状

33、况下，一个角果可坚固数十粒种子；单株坚固量可达数千粒甚至上万粒之多！这使得很简洁进行后代的遗传分析工作，也很简洁扩增所需突变体的种子库，简洁被诱变产生所需突变体。 二倍体拟南芥有5对染色体，单倍体的基因组总长约为125Mb，已完成全基因组测序。另外，在分子遗传学水平上，拟南芥具有基因组小、重复序列少、易于遗传转化等特点。 三、试验用品 处于开花期的拟南芥植株；尖头镊子；线绳等 四、试验步骤 1. 播种并培育拟南芥至开花期 2. 选择母本 选择刚刚露白的花蕾作为母本。这是杂交胜利与否的关键所在。太幼嫩的花蕾去雄后雌蕊会死亡，而发育稍过的花蕾其内部已在进行或完成自花授粉过程，因此难以达成人工杂交的

34、目的。 3. 去雄 用洁净的尖端稍细的镊子由外向内依次剥去花萼、花瓣、雄蕊共6枚，4长2短；此时雄蕊的长度明显短于雌蕊，尚未进行自花授粉，只留下雌蕊。 留意不要触伤柱头，否则难以完成授粉作用。另外，雄蕊确定要去完全，假如留下一或多根雄蕊，待其次天花柱伸长后照旧可以进行自花授粉作用，使人工设计的杂交失败。 4. 授粉 刚刚去雄的雌蕊柱头还未发育成熟，一般在去雄后其次天，柱头处于膨胀毛茸茸的状态时，为最适合接受花粉的状态。 选择处于盛花期四个花瓣完全绽开呈十字状，花药为鲜黄色的花朵作为父本，用镊子夹住雄蕊柄部取下小花，在母本花的柱头上轻轻擦拭数次，做好标记。为保证授粉胜利率，可以连续两天进行授粉。

35、 一般授粉在上午10点之前进行为宜；下午两三点钟花朵盛开较多时亦可。 5. 视察记录 两三天后，假如柱头明显发育长大，形成瘦长形的角果，则说明杂交胜利。 为了验证杂交结果，一般F1植株还需取材进行鉴定如相应抗性的筛选或者基因组PCR等 五、作业 论述拟南芥有性杂交的意义及杂交过程中的留意事项？ 试验九 根癌农杆菌介导的植物遗传转化 一、试验目的 1. 了解Ti质粒作为基因工程载体的特点及根癌农杆菌介导的植物基因转化的原理。 2. 驾驭浸花法转化拟南芥的方法。 二、试验原理 1. 双元Ti载体 Ti质粒为根癌土壤杆菌菌株中存在的质粒染色体外自主复制的环形双链DNA分子，能够通过感染植物的伤口，将

36、其上一段含有植物激素和冠瘿碱合成酶基因的DNA转移并整合至植物受体的基因组中，自然的Ti质粒整合入植物基因组中的基因能够限制根瘤的形成Ti即tumor-inducing 肿瘤诱发的缩写。 Ti质粒中有2个独立的区域确定DNA转移及整合：T-DNA区transferred DNA 和vir区virlence region。在Vir区基因产物的关心下，T-DNA区能够插入植物基因组中，并随植物基因组复制及遗传给后代。探讨觉察，T-DNA插入植物基因组时，其左右两个边界区是必需的，而中间部分的序列可以去除或替换。利用此特点，可以将目的基因插入该区域内。 基于Ti质粒这个结构特点，1983年Hoeke

37、ma等提出双元载体策略：将去除致瘤基因的T-DNA区从Ti质粒中分别，放置在一个能在农杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒中。这个穿梭载体称为双元Ti载体。Vir区则存在于一个已经除去T-DNA的Ti质粒中，在农杆菌中作为帮助质粒，通过反式激活使T-DNA能转移到植物细胞基因组中。通过基因工程改造，将筛选标记基因、多克隆位点及能在植物中高表达的启动子和终止子等依据确定的依次放入T-DNA区中，即构成Ti衍生载体，作为单、双子叶植物转基因的工程载体。 2.浸花法转化拟南芥 为了得到能够稳定遗传的转基因植物，一般用农杆菌转化的植物材料会选择愈伤组织或者植物的生长点部位。前者可以通过分化和再生得到携带目的

38、基因的转基因植株；而利于转化的生长点部位主要包括根尖分生组织及花分生组织。浸花法转化拟南芥即是用携带目的基因的农杆菌菌液浸泡拟南芥幼嫩花蕾中的分生组织，使得T-DNA区携带目的基因插入到花分生组织细胞基因组DNA中，而花作为拟南芥的生殖器官坚固后产生的种子中即携带目的基因，在繁殖过程中可以将外源基因稳定地遗传给后代。 利用此法转化拟南芥的转化率较高，常可以到达1%即后代中阳性转化植株所占比例甚至更高。事实上，由于拟南芥的种子坚固量大，即便转化率低一些，也还是很简洁从大量的后代中筛选获得转化植株。 三、试验用品 已抽薹但有许多未开花的幼嫩花蕾的拟南芥野生型Clo0哥伦比亚型植株；经带有目的基因的

39、Ti质粒转化的根癌农杆菌；抗性MS培育基等。 四、试验步骤 1. 含有目的基因的Ti质粒的构建及转化受体农杆菌菌株 选择合适的限制性内切酶组合，将目的基因依据正确的方向插入Ti质粒的多克隆位点中。构建好的重组质粒通过化学转化或电转化的方法转入根癌农杆菌感受态细胞中，从而得到含有携带目的基因Ti质粒的农杆菌菌株。 2. 植物材料的准备 将拟南芥种子用0.5%次氯酸钠消毒10-20分钟、用无菌水清洗3-4次后将消毒后的种子在4下春化2至3天，干脆播种于养分土与蛭石的混合物养分土与蛭石的体积比为1:1或2:1，培育室温度限制在22昼/18夜，光周期为12h，光强为80-120mol/m2/s。培育幼

40、苗至2对真叶后间苗，在直径为10cm的花盆中每盆保存4-5株。待植株抽薹至3-5厘米左右高时剪去茎的尖端使次生花序生长，剪切位点应在最顶端茎生叶的上方使腋生花序的茎位于茎生叶的基部。接着培育大约4-5天后的植株可用于转化，此时的植株已有侧枝发生、并已有一些花蕾。 3. 农杆菌准备 将前述用含目的基因的Ti质粒转化的农杆菌接种于含有相应抗生素的YEB或LB培育基中，28,200r震荡培育至菌液混浊，转化前一天接种于含相同抗生素的YEB或LB培育基中扩大培育至OD600为1.2-1.6，离心收集菌体，重新悬浮于转化拟南芥的渗入缓冲液1/2MS盐、5%蔗糖溶液，现用现配，调整农杆菌密度使OD600为

41、0.8。 4. 拟南芥的转化 准备一盛有50ml悬浮液的容器，将前述种有拟南芥的花盆翻转、使植株茎部全部花序均浸入悬浮菌液，保持10-20秒时间，然后将花序取出，使花盆侧躺于托盘中、并用塑料薄膜覆盖。待其次天取下塑料薄膜，直立放置花盆中，浇水，接着培育至收获种子T1代。为提高转化率，可在植物复原正常生长后约3-5天再用同样的方法浸泡花序一次。 5. 转化植株筛选 假如转化试验的目的是要探讨一个稳定插入的外源基因的表达状况，那么就有必要从未转化的材料中筛选出真正转化的转基因植株。运用最多的选择性标记基因是编码抗生素或除草剂的抗性基因。例如，编码抗生素抗性的基因有新霉素磷酸转移酶基因nptII(具

42、有对卡那霉素、新霉素的抗性)，潮霉素磷酸转移酶基因hpt(具有对潮霉素抗性)和氨基糖苷酰基转移酶基因aadA具有对链霉素抗性。编码除草剂抗性的基因有膦丝素乙酰转移酶基因bar具有对膦丝菌素和双丙氨膦的抗性和突变型5-稀醇丙酮酰草酸3-磷酸合酶EPSPS。本试验所用的抗性筛选基因是潮霉素磷酸转移酶基因。 制备MS选择平板，将T1代种子用0.5%次氯酸钠消毒20分钟，再用无菌水清洗3-4次后，将种子平铺在含有20ug/ml潮霉素的MS选择培育板上密度为1000-2000粒种子/皿，4下春化2-3天后移入生长箱中，7天后选择转化植株。转化植株的生长正常，真叶健康呈深绿色，根伸长至培育基中；而非转化植株基本不能生长，萌