高中生物微生物的培养.ppt

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1、1.了解有关培养基的基础知识，掌握无菌操作技术的有关内容。2.了解消毒和灭菌常用的方法及二者的区别。3.学会以大肠杆菌为材料进行微生物培养与分离纯化的方法。一 目标导航一、培养基与无菌技术1培养基(1)概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供其_的_。(2)成分：一般含有_、_、_、_，此外还要满足微生物对_(即生长因子)、_以及氧气的需求。营养物质生长繁殖 营养基质水 无机盐碳源 氮源特殊营养物质pH营养物质定义 作用 主要来源碳源能提供所需_的物质构成生物体的_和一些_，有些是异养生物的_无机化合物：CO2、NaHCO3等；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源能提供所需_的物

2、质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的_酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂微量有机物碳元素细胞物质代谢产物能源物质氮元素(1)不同种类的微生物，对碳源的需要差别较大。(2)微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。(3)对异养微生物来说，含 C、H、O、N 的化合物既

3、是碳源又是氮源和能量来源。(4)微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。备注：拓展深化.葡萄糖、氨基酸、氨气、牛肉膏、玉米粉等物质在微生物营养中的作用？葡萄糖提供C 源和能源,构成生物体的细胞物质和代谢产物.氨基酸 提供生长因子,N源,C源和能源氨气提供N 源和能源（硝化细菌的化能合成作用）微生物培养与植物组织培养的营养成分区别？大肠杆菌、硝化细菌、乳酸菌等微生物营养类型。牛肉膏天然培养基，主要提供C 源、磷酸盐和维生素、N 源。玉米粉主要提供C 源与能量植物组织培养 微生物培养培养基成分水、矿质元素、蔗糖、维生素、有机添加物和植物激素等水、无机盐、碳

4、源、氮源等大肠杆菌：异养兼性厌氧型 硝化细菌：自养需氧型乳酸菌：异养厌氧型根据不同的微生物营养类型不同，选择配制不同的培养基。由可以得到什么结论？1 不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是()A 氮源物质为该微生物提供必要的氮素 B 碳源物质也是该微生物的能源物质C 无机盐是该微生物不可缺少的营养物质 D 水是该微生物的营养要素之一营养型 碳源 氮源 生长因子 举例自养型微生物CO2、NaHCO3N2、NH3、铵盐、硝酸盐等一般不需要硝化细菌异养型微生物糖类、脂肪酸等铵盐、硝酸盐、蛋白胨等有些种类需要乳酸菌自养微生物与异养微生物

5、的营养什么区别呢？(3)培养基的种类划分标准培养基种类 特点 用途物理性质_ 培养基加凝固剂，如_半固体培养基 观察微生物的运动、分类、鉴定_ 培养基微生物_、_、活菌计数、保藏菌种化学成分_ 培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产_ 培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴定用途_ 培养基培养基中加入某种化学物质，以_ _ 不需要的微生物的生长，_ 所需要的微生物的生长培养、_ 出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素或链霉素；培养固氮菌可用无氮培养基)_ 培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品_ 不同种类的微生物，如可用伊红 美

6、蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)液体固体工业生产分离 鉴定琼脂天然合成选择 抑制促进分离鉴别鉴别纯化大肠杆菌、分离分解尿素微生物、分离细菌与真菌混合菌的培养基类型是什么？拓展深化病毒目前的利用人工培养基来培养方法？需接种在动、植物组织细胞中才能繁殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。2下列说法正确的是()A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B培养基只有两类：液体培养基和固体培养基C除水以外的无机物只能提供无机盐 D无机氮源不可能提供能量选择培养基植物组织培养技术、微生物培养技术和无土栽培技术的比较植物组织培养 微生物培养 无土栽培含义培养基成分特殊

7、操作要求在无菌条件下，将离体的植物体器官或组织接种在适当的培养基上进行培养，最终发育成完整植物体在无菌条件下，在适宜的营养和环境条件下对微生物的培养将植物生长发育过程中所需各种矿质元素按一定比例配成营养液，并利用这种营养液栽培植物水、矿质元素、蔗糖、维生素、有机添加物和植物激素等水、无机盐、碳源、氮源（异养微生物还加生长因子）等水、必需矿质元素严格控制无菌操作，在培养过程中要更换培养基，调节细胞分裂素和生长素的比例和添加顺序。严格控制无菌操作，整个培养过程无需更换培养基适宜的环境条件，基质垫底并固定幼苗，不需要保证无菌条件，注意溶氧和矿质元素的浓度。3.下列关于植物组织培养、微生物培养和无土栽

8、培技术的比较的有关说法中，不正确的是（）A 微生物培养和无土栽培技无需更换培养基，植物组织培养需更换培养基B 植物组织培养、微生物培养需要严格控制无菌操作，植物组织培养不需要C 三者都需要加入水、矿质元素和一些必要的有机物D 三者培养的目的和原理各不相同1.加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌 2.加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌3.不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌4.不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物5.如何鉴定饮用水和奶制品中含有大肠杆菌？加入伊红-美蓝试剂，如果菌落出现深紫色并伴有金属光泽，就证明有大肠杆菌。【配对练习 2】关于配制培养基的叙述中，正确的是()A

9、 制作固体培养基必须加入琼脂B 加入青霉素可得到放线菌C 培养自生固氮菌不需氮源D 发酵工程一般用半固体培养基解析：固体培养基需加入凝固剂，琼脂是常用的，但不是唯一的；青霉素可抑制细菌和放线菌的生长；发酵工程一般用液体培养基；自生固氮菌能够将空气中的氮还原成氨，故培养基配制时不需加氮源。答案：C(1)概念：防止一切外来杂菌的侵入，并保持灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为无菌技术。注意在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是_，_。(2)无菌技术的具体内容对实验操作的_、操作者的_ 进行清洁和消毒。将用于微生物培养的_、接种用具和培养基等进行_。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在_

10、 进行。实验操作时应避免已_ 处理的材料用具与周围的物品相接触。(3)消毒和灭菌的概念消毒：消毒是指使用_ 的物理或化学方法杀死物体表面或内部的_(不包括芽孢和孢子)。灭菌：灭菌是指使用_ 的理化因素杀死物体内外_，包括_。消毒与灭菌的区别：两者最大的区别是_。2 无菌技术防止杂菌污染保证培养的纯度空间衣着和手器皿灭菌酒精灯火焰附近灭菌较温和部分微生物强烈所有的微生物 芽孢和孢子芽孢和孢子是否存活拓展深化某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形的抗逆性休眠体，称为芽孢。每个细菌细胞仅形成一个芽孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。芽孢的休眠能力十分惊

11、人，可保持几年到几十年的生活力。孢子是微生物产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的营养体，能直接发育成新个体。(4)消毒与灭菌的常用方法方法 条件 作用对象消毒100，煮沸5 6 min杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢70 75 煮30 min 或80 煮15 min 不耐高温的液体（如牛奶）70%的酒精 对双手消毒50%的石炭酸、来苏水 对空气消毒一定浓度的乳酸、食醋 通过熏蒸对空气进行消毒紫外线法紫外线照射30 min 物体表面或空气中的微生物煮沸法巴氏消毒法化学药剂法灭菌在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧对接种环、

12、接种针或其他金属工具灭菌，也可以对试管口、瓶口灭菌在干热灭菌箱内，160 170 条件下，加热1 2 h耐高温且需保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等在高压蒸汽灭菌锅内，121，100 kPa，灭菌15 30 min30 W 照射30 min 小型接种室、接种箱等紫外线灭菌灼烧灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌(一)配制培养基1 配制原则(1)_(根据微生物的种类、培养目的等)，如培养基可由简单的无机物组成；生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。(2)_，注意各种营养物质的浓度和比例。(3)_，各种微生物适宜生长的pH 范围不同，细菌6.5 7.

13、5、放线菌7.5 8.5、真菌5.0 6.0。二、实验操作目的要明确营养要协调pH 要适宜判断下列各项是否需要消毒或灭菌。如需要，选择合适方法。（1）豆浆（2）游泳池（3）超净工作台（4）玻棒、试管、吸管、锥形瓶（5）培养细菌用的培养皿（6）无菌水（7）牛肉膏蛋白胨培养基（8）接种针和接种环（9）实验操作者的双手灭菌（灼烧）消毒（巴氏）消毒（化学）消毒（先化学后紫外线）消毒（化学）消毒（化学）灭菌（干热）灭菌（高压蒸汽）灭菌（高压蒸汽）)【例 3】下列操作与灭菌无关的是(A 接种前用火焰灼烧接种环B 接种前用酒精擦拭双手C 接种在酒精灯火焰旁完成D 将平板倒置，放入培养箱中培养无菌操作是微生物

14、培养的必要前提，学生必须树立“无菌概念”。前三项都是无菌操作的规范要求，第四项将平板倒置(为了防止皿盖上的冷凝水落入培养基中，造成污染)，放入培养箱中培养与灭菌无关。【答案】：D注意不同微生物对营养需求不同，因此，首先根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用，另外，培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为4 1 时，菌体大量繁殖，而产生的谷氨酸少；当碳源与氮源的比为3 1 时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大

15、增。2 配制方法(以制备牛肉膏蛋白胨固体培养基为例)培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏5.0 g 碳源、磷酸盐和维生素蛋白胨10.0 g 氮源和维生素NaCl 5.0 g 无机盐H2O 定容至1 000 mL氢元素、氧元素琼脂(1)培养异养菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基的营养构成(2)实验流程倒平板计算称量溶化调节pH分装灭菌先加牛肉膏少量水，加热，溶化取出称量纸；再加蛋白胨和氯化钠，玻棒搅拌溶解；加琼脂，玻棒搅拌，完全熔化，补加蒸馏水至100毫升。合格的培养基必须灭菌效果好。培养基配制好后，要放在恒温箱中保温1 2 d，若无菌落生长则说明制备的培养基是合格的。提醒4 下列为某同学在培养金黄色葡萄

16、球菌实验中的部分操作步骤，其中正确的是()A 培养基中蛋白胨、牛肉膏溶化后，直接补充蒸馏水至100 mLB 培养基配制完毕可直接使用C 加压至100 kPa 之前，要彻底排出锅内的冷空气D 将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，灭菌后立即伸入菌液试管内挑取少量菌种纯化大肠杆菌就是为了获得大肠杆菌的纯种菌落，这需在培养时，尽量使菌落中的菌体来自于一个大肠杆菌的分裂，即这个菌落的细菌群体由一个大肠杆菌繁殖而来，这就需接种时尽量接种单个的大肠杆菌。(二)纯化大肠杆菌1 微生物接种的方法微生物接种的方法最常用的是_ 和_ 两种。(1)_ 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到

17、培养基的表面。将_ 放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的_。将试管口通过酒精灯的_。将已冷却的接种环伸入菌液中，_ 一环菌液。将试管口通过酒精灯的火焰，并迅速塞上棉塞。_ 将培养皿皿盖打开一条缝隙，_ 将沾有菌种的接种环迅速伸入_，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将_ 的划线与_ 相连。将_，放入培养箱中培养。平板划线法 稀释涂布平板法平板划线法接种环棉塞火焰沾取左手 右手平板内最后一区 第一区平板倒置(2)_ 则是将菌液进

18、行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。系列稀释操作a 取盛有9 mL水的6 支试管灭菌，并按101106的顺序编号。b 用_ 吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。c 从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管内吹吸均匀，获得102倍液。依此类推。涂布平板操作a 将_ 浸在盛有酒精的烧杯中。b 取不超过0.1 mL的_，滴加到培养基表面。c 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810 s。d 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转

19、动培养皿，使菌液分布均匀。稀释涂布平板法移液管涂布器菌液2 注意事项(1)平板划线法操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行_，划线操作结束时，仍需灼烧_。从第二次以后的划线操作总是从_ 开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落(2)稀释涂布平板法稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“_”，应特别注意：酒精灯与培养皿的距离要合适。吸管头不要接触任何其他物体。吸管要在酒精灯火焰周围使用。3 微生物分离纯化培养的结果作出分析与评价(1)培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。(2)在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，

20、为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。(3)培养12 h 和24 h 后的菌落大小不同，菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大，而菌落的位置不动，只是菌落数增多。(4)频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4 冰箱中，第3 6 个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，菌种容易被污染或产生变异；后者将菌种与无菌甘油等量混合后保存在20 的冷冻箱中。火焰灼烧灭菌接种环上一次划线末端无菌4 菌种的保存为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。对于频繁使用的菌种，我们可以采用_ 法；对于需要长期保存的菌种，可以采用_ 法。将

21、菌种放在低温环境中保藏的目的是_，但时间长了菌种还是要老化的，因此对临时保存的菌种_ 个月后需重新接种。4 有关平板划线操作的叙述，不正确的是()A 第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物B 每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上的菌种C 在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液D 划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者临时保藏甘油管藏降低微生物的新陈代谢速率3 6一、选择题1 关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，叙述错误的是()A 操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B 将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧

22、杯C 待培养基冷却至50 左右时进行倒平板D 待平板冷却凝固约5 10 min 后，将平板倒过来放置2 金黄色葡萄球菌有很强的致病力，常引起骨髓炎等，还可能引起食物中毒，下述实验结束后的做法错误的是()A 对接种环进行灼烧处理B 带菌培养基必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后才能倒掉C 带菌培养基必须经加热后才能倒掉D 接种后双手必须经肥皂洗净，再用75%的酒精棉球擦拭3 防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是()A 实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒B 接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌C 在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一

23、定要洗手，以防止被微生物感染D 使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境4 下列叙述错误的是()A 右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为避免污染需放在酒精灯火焰附近B 倒平板整个过程应在火焰旁进行C 打开培养皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖D 为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置5 有关稀释涂布平板法的说法中，错误的是()A 用移液管把菌液从一支试管转移到下一支试管后，要用手指轻压移液管的橡皮头，吹吸三次，目的是使菌液与水充分混匀B 移液管需经过灭菌C 试管口与移液管应在离火焰1 2 cm 处D 涂布时可转动涂布器，使菌液涂布均匀6 以下关于

24、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序正确的是A 计算称量倒平板溶化灭菌B 计算称量溶化倒平板灭菌C 计算称量溶化灭菌倒平板D 计算称量灭菌溶化倒平板7 为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是()A 对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法B 临时保藏的菌种一般是接种到试管的斜面培养基上C 临时保藏的菌种容易被污染或产生变异D 对于需要长期保存的菌种，可以采用低温4 保藏的方法8 有关平板划线操作的叙述，正确的是()A 使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌B 打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞C 把皿盖打开，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板

25、内，划三至五条平行线即可D 最后将平板倒置，放入培养箱中培养二、简答题9 某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料：_、_、_、_、_。其中提供氮源的是_；提供碳源的主要物质是_。(2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，故配制培养基时各成分要有合适的_。在烧杯中加入琼脂后要不停地_，防止_。(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上

26、牛皮纸并用皮筋勒紧放入_ 中灭菌，压力_kPa，温度_，时间_。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到0 时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管_。(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入_，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。(5)从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要在酒精灯_(“内”或“外”)焰灭菌，并且待接种环_ 后蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管放入_ 冰箱中保藏。牛肉膏牛肉膏蛋白胨 水 无机盐琼脂 蛋白胨琼脂糊底引起烧杯破裂比例搅拌废弃高压蒸汽灭菌锅100 121 15 30 min 适量水外冷却410 下表是用于从土壤中分离纯化土

27、壤细菌的牛肉膏蛋白胨培养基的配方。请回答：试剂 用量牛肉膏 5.0 g蛋白胨 10.0 gNaCl 5.0 g琼脂 20.0 g水 1 000 mL(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是_ 和_。培养基配制完成以后，一般还要调节pH 并对培养基进行_ 处理。(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是_ 和_ 两种。在接种过程中，接种针或涂布器的灭菌方法是_。(3)假设某同学发现培养基上细菌数目过多地连成一片，可能的原因是什么？。菌液浓度过高；培养过程中被杂菌污染；利用接种针划线时，划下一个区域前没有对接种针进行灭菌处理牛肉膏 蛋白胨

28、灭菌平板划线法稀释涂布平板法蘸取酒精；引燃灭菌目标导航1.研究培养基对微生物的选择作用。2.进行微生物数量的测定。第2 课时土壤中分解尿素细菌的分离与计数一、研究思路1 筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理人为提供有利于_ 生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时_ 或_ 其他微生物生长。(2)选择培养基在微生物学中，将允许_ 种类的微生物生长，同时_ 或_ 其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。目的菌株抑制 阻止特定抑制阻止(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是_，提供氮源的是_，琼脂的作用是凝固剂。该培养基对微生物具有选择作用。其选择机

29、制是_ 才能在该培养基上生长。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成_，将尿素分解的反应式是_。Taq 细菌能忍受93 左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据_。2 统计菌落数目的方法(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的_，通过统计平板上的_，就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作葡萄糖 尿素只有能够以尿素作为氮源的微生物脲酶CO(NH2)2H2O CO22NH3脲酶它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找一个活菌菌落数第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确

30、性。将待测样品经一系列10 倍稀释，然后选择_ 稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出_。第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在_ 的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。计算公式：每克样品中的菌株数C/VM，其中C 代表_ _，V 代表_ _(mL)，M 代表_。(2)显微镜直接计数法原理：此法利用特定的_ 或_，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块

31、特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm 的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25 个(或16 个)中格，每个中格进一步划分成16 个(或25 个)小格，计数室由_ 个小格组成。三个菌落平均数30 300某一稀释度下平板上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液的体积稀释倍数细菌计数板 血细胞计数板400操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4 5 个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。计数公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000 稀释倍数。(3)设置重复和对照设置重复：培养过程

32、中应设置重复组，同一稀释度下应涂布_ 个平板，才能增强实验的说服力与准确性。设置对照：实验中应设置对照，主要目的是_ 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如_ 对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置_ 培养基，观察选择培养基是否具有_ 作用。二、实验设计实验步骤1 土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm 左右，迅速取土壤并装入_ 密封或事先准备好的_ 中。至少3排除实验组中非测试因素空白完全 筛选无菌信封烧杯2 制备培养基：制备_ 培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为_，用来判断选择培养基是否具有_。放宽稀释范围，如稀释倍数为103107范围内的要分别涂布

33、，而每个稀释度下需要_ 个选择培养基、_ 个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15 个选择培养基和5 个牛肉膏蛋白胨培养基。两种培养基应各有一个作为_ 对照，此外还需准备8 个灭菌的试管和1 个灭菌的移液管。3 样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有_ mL生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107103稀释度的顺序分别吸取_mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。牛肉膏蛋白胨实验组选择作用31空白90.1说明：图中的

34、1、2、3 平板是_，4 为_ 作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否_。4 将涂布好的培养皿放在30 温度下培养，及时观察和记录。5 挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含_ 培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基含有杂菌酚红指示剂6 细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在_ 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3 个平板进行重复计数，然后求出_，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。7 统计表格表一平板上的菌落数记录表稀释

35、倍数 1031041051061071 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 412330 300平均值表二菌落特征记录表 菌落种类形状 大小隆起程度颜色123注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，_ 表现出_ 的菌落特征。三、操作提示1 取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要_。2 应在_ 旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入_ 中，塞好棉塞。3 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在_ 旁操作。4 实验时要对_ 做好标记。注明_ 等。5 为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当_。同种微生物 稳定.灭菌火焰锥形瓶火焰培养皿培

36、养基类型、培养时间、稀释度、培养物事先规划时间内容 结论分析 有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中_ 菌落生长未被杂菌;污染培养物中菌落数_ 被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入_ 选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目_ 选择培养基的数目选择培养基具筛选作用，已筛选出一些菌落 样品的稀释操作 得到2 个或2 个以上菌落数目在_ 的平板操作成功，能进行菌落的计数 重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应_；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因 四、结果分析与评价无偏高其他氮源大于30 300接近菌落计数规则：选择平均菌落数在30300

37、间的平板1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）1）若0.5 比值2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告。2）若2 比值或比值 0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。3、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；所有菌落数均不在30300 间，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数（个/ml）

38、备注10-110-210-31 1365 164 20 16400或1.6104两位以后的数字采取四舍五入的方法去掉2 2760 295 46 1.637750或3.81043 2890 271 60 2.227100或2.71044无法计数1650 513 513000或5.11055 27 11 5 270或2.71026无法计数305 12 30500或3.1104特别注意:测定真菌放线菌与细菌数量时,稀释度的选择2.放线菌一般选择10-3,10-4,10-51.真菌一般选择10-2,10-3,10-43.细菌一般选择10-4,10-5,10-6五、课题延伸在细菌分解尿素的化学反应中，细

39、菌合成的_ 将尿素分解成了_。氨会使培养基的碱性增强，_ 升高。因此，我们可以通过检测培养基_ 来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_ 指示剂，培养某种细菌后，如果pH 升高，指示剂将_，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。脲酶氨pHpH 的变化酚红变红知识点一研究思路1 下表为本课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下面的问题。KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O 0.2 g葡萄糖 10.0 g尿素 1.0 g琼脂 15.0 g用蒸馏水定容到1 000 mL(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_。(2)按

40、物理性质划分该培养基属于_ 培养基，理由是培养基中含有_；该类培养基常用于微生物的_ 等。葡萄糖和尿素固体琼脂纯化、分离、计数(3)由于_，所以该培养基只能用于能够合成_ 的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出_ 的细菌。(4)在微生物学中，将_ 的培养基，称作选择培养基。2 广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的C4 植物，单位面积产量很高，种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗榨汁(蔗糖)酵母发酵蒸馏成品(燃料酒精)。(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过

41、筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意 和_，加琼脂后灭菌，制成固体平板。步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。培养基中只有尿素一种氮源脲酶分解尿素允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类微生物生长添加高浓度蔗糖(葡萄糖)调低pH步骤4：根_，筛选出突变菌。(2)上述步骤2、3 和4 的依据分别是_是否能在选择培养基上生长提供高糖和酸性的筛选环境；获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性知识点二实验设计3 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应

42、稀释倍数为106 的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A 涂布了1 个平板，统计的菌落数是230B 涂布了2 个平板，统计的菌落数是215 和260，取平均值238C 涂布了3 个平板，统计的菌落数分别是21、212 和256，取平均值163D 涂布了3 个平板，统计的菌落数分别是210、240 和250，取平均值2334 在本实验操作中对使用的平板和试管要进行标记，以下说法正确的是()A 对培养皿仅需注明培养基的种类即可B 一般在使用之后进行标记C 由于试管用的较多，只需对试管进行标记即可D 标记的目的主要是为了防止实验中平板、试管等的混淆一、选择题1 在缺乏氮源的培养基上，大部分

43、微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出()A 乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌B 固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C 固氮细菌、霉菌、放线菌D 固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌2 请选出下列正确的操作步骤()土壤取样称取10 g 土壤，取出加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A B C D 3 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是()A 筛选出能分解尿素的细菌B

44、 对分离的菌种作进一步鉴定C 作细菌的营养成分D 如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素4 下面对“从土壤中分离分解尿素的细菌过程中灭菌”的理解，不正确的是()A 防止杂菌污染 B 消灭全部微生物C 稀释土壤溶液的过程中必须在火焰旁操作D 灭菌必须在接种前进行5 下列不属于菌种记数方法的是()A 平板划线法 B 稀释涂布平板法C 显微镜检法 D 滤膜法6 下列有关配制培养基的叙述中，正确的是()A 制作固体培养基必须加入琼脂B 加入青霉素可得到乳酸菌C 培养自生固氮菌不需要氮源D 发酵工程一般用固体培养基7 用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个

45、平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是()A 菌落数最多的平板B 菌落数量最少的平板C 菌落数量适中的平板D 取若干个平板菌落数量的平均值8 土壤中分解尿素的微生物所需氮源为()A 硝酸 B 氨 C 尿素 D 蛋白胨二、简答题9 在现代农业中，常在饲料中加入一定量的尿素去饲养牛等牲畜。因其有特殊的器官瘤胃，在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素作唯一氮源。某一同学设计了如下实验，对能分解尿素的细菌进行分离和计数。.取样：到屠宰场，在刚宰杀的牛的瘤胃中取样，将样品装入事先准备好的信封中密封。.制备培养基：制备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上

46、生长的菌落数应明显多于选择培养基上的数目。由于初次实验，选择了一个较宽的稀释范围，并且每个稀释度下需要3 个选择培养基，1 个牛肉膏蛋白胨培养基。.微生物的培养与观察：按稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。将涂布好的培养皿放在30 下培养，并且需要无氧条件。比较两种培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红指示剂的培养基中，观察是否产生颜色反应。.细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取平板计数。请回答下列问题：(1)制备牛肉膏蛋白胨培养基的目的是什么？_。(2)为什么每个稀释度下需要3 个选择培养基？_。(3)上述培养时，为什么需要无氧条件？_。

47、(5)选择菌落在30 300 的平板进行计数。根据平板所对应的稀释度，对3 个平板进行重复计数，然后求出平均值，以此估算样品中细菌的数目作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用每个稀释度下涂布3 个平板，是作为重复组，以增强实验结果的由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气会死亡(4)应用含酚红指示剂的培养基的目的是什么？结果会呈现出什么样的颜色反应？原理是什么？鉴别培养基，看是否有分解尿素的细菌存在。结果会变红。原理是分解尿素的细菌产生并催化下列反应CO(NH2)2H2O CO22NH3，因产生NH3，培养基pH 升高，酚红指示剂呈红色反应说服力与准确性脲酶(5)计数时应选什么样的平板进

48、行计数？怎样计算出样品中的细菌数目？选择菌落在30 300 的平板进行计数。根据平板所对应的稀释度，对3 个平板进行重复计数，然后求出平均值，以此估算样品中细菌的数目10 有人送来一支芽孢杆菌菌种，其中一部分芽孢杆菌有抗青霉素的能力，另一部分没有抗性。请你把对青霉素有抗性的芽孢杆菌分离出来。(1)现有条件：无菌牛肉膏培养基两个、无菌接种台、接种工具齐备、医用青霉素两支。(2)实验过程取两个培养基，分别标号为A、B，向A、B 两个培养基中分别加入_，加入过程一定要进行_ 操作。青霉素无菌向A 培养基中接种_。接种后，将A 培养基放入恒温箱培养两天。从_ 中挑取生长良好的芽孢杆菌，接种到B 培养基中。适量芽孢杆菌菌种A 培养基的菌落接种后，将B 培养基放入恒温箱内培养两天，即可获得较多抗青霉素芽孢杆菌。第两个步骤的目的是 获得纯度高的抗青霉素芽孢杆菌(分离出对青霉素有抗性的芽孢杆菌)