流式细胞术原理与应用简介.ppt

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1、流式细胞术流式细胞术原理与应用简介原理与应用简介湖北中医学院中医药实验中心 田代志流式细胞术发展史1930年年Caspersson和和Thorell开始致力于开始致力于细细胞计数胞计数的研究的研究1934年年Moldaven最早设想细胞检测自动化，最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根用光电仪记录流过一根毛细管毛细管的细胞的细胞1940年年Coons提出结合提出结合荧光素荧光素的的抗体抗体去标记去标记细胞内的特定蛋白细胞内的特定蛋白1949年年WallaceCoulter申请了在申请了在悬液中计数悬液中计数粒子粒子的方法的专利的方法的专利1950年年Caspersson用显微用显微UV-

2、VIS检测细胞检测细胞流式细胞术发展史1953年年Croslannd-Taylor应用应用分层鞘流分层鞘流原理，原理，成功设计红细胞光学自动计数器成功设计红细胞光学自动计数器1969年年VanDilla及其同事在及其同事在LosAlamos,NM发明第一台发明第一台荧光荧光检测细胞计检测细胞计1972年年Herzenberg研制出研制出细胞分选细胞分选器器1975年年Kohler等提出等提出单克隆抗体单克隆抗体技术，为技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂细胞研究提供大量的特异免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪大量厂家不断生产流式细胞仪流式细胞术发展史目前国内主要流式细胞仪厂家：目前国内主要流

3、式细胞仪厂家：BecktonDickinson(BD)公司公司BACKMANCOULTER公司公司流式细胞仪构造流式细胞仪流式细胞仪(FlowCytometer，FCM)的结构的结构分五部分：分五部分：流动室及液流驱动系统流动室及液流驱动系统激光光源及光束成形系统激光光源及光束成形系统光学系统光学系统信号检测与存贮、显示、分析系统信号检测与存贮、显示、分析系统细胞分选及浓缩系统细胞分选及浓缩系统流式细胞术流式细胞术(FlowCytometry，FCM)图示如下页：图示如下页：流式细胞仪构造模式图流式细胞仪构造示意图流动室与液流驱动系统流动室流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相是仪器核心部

4、件，被测样品在此与激光相交。交。流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过。供单个细胞通过。流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体流体动力学聚焦动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。，从而得到准确的细胞荧光信息。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。动。流动室与液流驱动系统激光光源及光束成形系统目前台式机目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激，大多采用氩离子气

5、体激光器。光器。激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约焦，形成约2266m的光斑，的光斑，这样激光能激光能量量较强强，以激，以激发荧光染料。光染料。台式机的整个光路是封台式机的整个光路是封闭的，在安装的，在安装时由由工程工程师调试完完毕后，无需用后，无需用户作任何作任何调节，使用十分方便。使用十分方便。激光光源及光束成形系统光学系统FCM的光学系的光学系统由若干由若干组透透镜、滤光片和光片和小孔小孔组成，它成，它们将不同波将不同波长的的荧光信号分光信号分别送入到不同的送入到不同的电子子测控器。控器。主要光学原件：主要光学原件：滤光片光片(Filter

6、)长通通滤片片LongPassFilter,LP短通短通滤片片ShortPassFilter,SP带通通滤片片BandPassFilter,BP长通滤片短通滤片带通滤片信号检测与分析当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间空间360度立体角发射，产生度立体角发射，产生散射光散射光和和荧光荧光信号。信号。以激发光光源波长以激发光光源波长488nm为例示意图：为例示意图：荧光信号示意图散射光信号散射光信号不依赖任何样品的

7、制备技术散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。（如染色），因此称为细胞的物理参数。前向散射角前向散射角(ForwardScatter，FSC)：与细胞的与细胞的大小有关，在大小有关，在FCM应用中，常取应用中，常取FSC作阈值，作阈值，来排除样品中的各种碎片。来排除样品中的各种碎片。侧向散射角侧向散射角(SideScatter，SSC)：与激光束正与激光束正交交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。正相关。散射光信号波长与激光相同。散射光信号波长与激光相同。散射光信号示意图Right Angle Light Dete

8、ctora a Cell ComplexityForward Light Detector a a Cell Surface AreaIncident Light Source荧光信号一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称荧光信号，称自发荧光自发荧光。一种是经过特异荧光素标记后，受激发光一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量就能了解所研究细胞参数号的检测和定量就能了解所研究细胞参数的存在与定量。的存在与定量。常用荧光染料目前台式机目前台式机FCM配置配置488nm激

9、光管常用染料有激光管常用染料有PI(PropidiumIodide)PE(Phycorey-thrin)FITC(FluoresceinIsothiocyanate)PerCP(PeridininChlorophyllProtein)PE-CY5等等633nm激光管常用染料有激光管常用染料有APCAPC-CyFCM测量数据的存贮、显示和分析目前目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。列表排队方式，可节省存贮空间。数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数数据文件为二进制文

10、件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式：据的显示常用以下几种方式：直方图直方图散点图散点图等高线图等高线图密度图密度图三维图三维图直方图直方图直方图(DistributionHistogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。单位是道数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。纵坐标一般是细胞数。散点图散点图散点图(DotPlot)X坐标为该细胞一参数相对含量，坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。等高线图和密度图三维图

11、设门分析可以通过设可以通过设“门门”(Gate)，分析、分，分析、分选感兴趣的细胞。选感兴趣的细胞。FCM的分辨率分辨率是衡量分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常测量精度的指标，通常用变异系数用变异系数CV表示。表示。一般要求一般要求CV8，最好，最好CV15%DNA倍体分析：倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，

12、意义尤为重要。胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性反映了肿瘤的生长速度和侵袭性正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT)多发性骨髓瘤FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志变的一个重要标志在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良

13、恶性的辅助指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标指标细胞凋亡分析细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段细胞凋亡的主要检查手段形态学检测形态学检测Ladders实验实验流式细胞术检测流式细胞术检测与凋亡相关的病理过程与凋亡相关的病理过程HIV自身免疫性疾病自身免疫性疾病肿瘤肿瘤细胞凋亡分析细胞凋亡的主要指标细胞凋亡的主要指标细胞内酶改变：细胞内酶改变：Caspase-3活化活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI细胞核细胞核DNA的断裂

14、改变：的断裂改变：TUNNEL实验实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白：FasBcl-2细胞凋亡PI分析PI-FluorescenceEvents调亡细胞调亡细胞正常正常G0/G1期细胞期细胞细胞凋亡ActiveCaspases-3细胞凋亡Caspases-3细胞凋亡AnnexinV细胞凋亡AnnexinV细胞凋亡BrdUFCM的应用免疫学淋巴细胞免疫分型淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析CD4绝对计数绝对计数HIV的诊断与研究的诊断与研究淋巴细胞淋巴细胞CD4/CD8分析分析CD4绝对计数绝对计数T细胞活化细胞活化细胞移植的交叉配型和免疫状态

15、监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测FCM的免疫学应用免疫功能和免疫调控的研究免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化淋巴细胞和单核细胞的活化细胞因子的研究细胞因子的研究淋巴细胞的增殖淋巴细胞的增殖树突状细胞的研究树突状细胞的研究HLA-B27检测检测淋巴细胞亚群分析使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析各淋巴细胞亚群的各淋巴细胞亚群的百分含量百分含量淋巴细胞亚群的淋巴细胞亚群的绝对计数绝对计数临床意义了解在不

16、同情况下体内免疫功能状态了解在不同情况下体内免疫功能状态辅助临床疾病的诊断辅助临床疾病的诊断探索疾病的发病机理、病程、预后探索疾病的发病机理、病程、预后监测、指导临床治疗方案监测、指导临床治疗方案免疫系统疾病免疫系统疾病免疫缺陷病，免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测肿瘤病人化疗后免疫力检测肿瘤病人化疗后免疫力检测淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关T淋巴细胞淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关总总T和总和总B可以用

17、来判断某些免疫缺陷和自身免疫可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病性疾病NK细胞细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。染细胞的细胞毒性作用。SimulTESTIMK-Lymphocyte试剂盒试剂盒CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰 1/2a，阴性对照，阴性对照：确定淋巴细胞的阴

18、性界值，：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色评估实验的非特异染色CD3/CD19：分析：分析T淋巴细胞和淋巴细胞和B淋巴细胞淋巴细胞CD3/CD4：分析：分析T辅助辅助/诱导细胞诱导细胞CD3/CD8：分析：分析T抑制抑制/细胞毒性细胞细胞毒性细胞CD3/CD16+56：分析：分析T淋巴细胞和淋巴细胞和NK细胞细胞淋巴细胞双色分析LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定淋，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性巴细胞门，并评估门的有效性淋巴细胞双色分析AIDS病人T细胞亚群分析FCM的应用血液病学白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病残留白血病造血干细胞计数

19、造血干细胞计数PNHPNH诊断诊断网织红细胞分析网织红细胞分析血小板分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化血小板活化网织血小板分析网织血小板分析FCM的应用分子生物学分选细胞后进行分选细胞后进行FISH分选细胞后进行分选细胞后进行PCR流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液）结合测定血液CD4细胞中细胞中HIV特异的特异的DNA或或RNA流式荧光原位杂交（流式荧光原位杂交（Flow-FISH）测定）测定染色体端粒长度染色体端粒长度性别选择FCM在中医药研究中的应用我科室开展较多

20、的有如下几个方面的应用：我科室开展较多的有如下几个方面的应用：中药对肿瘤细胞的中药对肿瘤细胞的细胞周期及凋亡细胞周期及凋亡影响，抗肿瘤影响，抗肿瘤中药成份的筛选中药成份的筛选中药对细胞表面（细胞因子、激素）中药对细胞表面（细胞因子、激素）受体表达受体表达的的影响影响中药对细胞中药对细胞粘附分子粘附分子表达的影响表达的影响中药对中药对淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群（反映免疫状态）的影响（反映免疫状态）的影响针灸及中药对针灸及中药对细胞内细胞内酶的表达影响酶的表达影响中药对中药对生精细胞生精细胞的影响研究的影响研究中药治疗中药治疗艾滋病艾滋病的研究（我实验室仅提供技术支的研究（我实验室仅提供技术支持）持

21、）本实验室流式细胞仪及应用介绍生产厂家：美国生产厂家：美国BECTONDICKINSON(BD)公司公司型号：型号：FACSCalibur激光器：激光器：488nm和和633nm各一个各一个荧光通道（共荧光通道（共4通道通道6参数）参数）FSC及及SSC：480-495nmFL1：515-545nmFL2：564-606nmFL3：670nmFL4：653-667nm技术参数技术参数分析速度分析速度10000个个/秒，分选速度秒，分选速度700个个/秒。秒。常用荧光染料光谱学特征常用荧光染料光谱学特征细胞周期分析PI单染细胞周期分析PI单染细胞周期分析ModiFit 分析细胞周期分析ModiF

22、it 分析大鼠生精细胞分析PI单染细胞凋亡PI加AnnexinV双染双染FITC-Annexin VPI淋巴细胞亚群分析CY5.5-CD3FITC-CD4PE-CD8培养细胞表面粘附分子表达培养细胞表面粘附分子表达FCM样品来源需要制备细胞悬液需要制备细胞悬液血液、体液等液体样品血液、体液等液体样品培养的细胞培养的细胞活体组织样品活体组织样品冰冻组织冰冻组织固定的组织样品固定的组织样品直接应用直接应用分离后使用分离后使用样品制备细胞分离方法细胞分离方法直接离心沉淀直接离心沉淀物理方法分离（超声波、筛网等）物理方法分离（超声波、筛网等）酶消化酶消化如果是固定的组织，先脱蜡，再用物理或化如果是固定

23、的组织，先脱蜡，再用物理或化学方法分离学方法分离样品染色步骤PBS洗细胞洗细胞12次次加（荧光）单抗，暗处孵育加（荧光）单抗，暗处孵育1530分钟分钟如果必需，加荧光二抗，暗处孵育如果必需，加荧光二抗，暗处孵育1530分钟分钟PBS洗细胞一次洗细胞一次过过300目尼龙网目尼龙网上机检测上机检测PI单染测细胞凋亡步骤制备细胞悬液制备细胞悬液PBS洗细胞洗细胞1次，次，1000rpm离心离心10min，去，去上清。上清。加加PI染液（含染液（含PI50mg/ml,Rnase50ug/ml)，暗处孵育，暗处孵育30分钟分钟过过300目尼龙网目尼龙网上机检测上机检测淋巴细胞亚群分析实验淋巴细胞亚群分析实验步骤采集血液样品采集血液样品取三色标记抗体或三种单色标记混合抗体取三色标记抗体或三种单色标记混合抗体20l至至Eppendorf管，加血样管，加血样50l，混匀后避，混匀后避光保存光保存20min。加入加入1红细胞溶解液红细胞溶解液450l，混匀避光保存，混匀避光保存10min，500g离心离心5min，去上清，加，去上清，加PBS1ml洗洗1次后加次后加PBS0.5ml摇匀。摇匀。过过300目尼龙网，上机检测。目尼龙网，上机检测。更多相关实验内容请见本实验室网页谢谢！谢谢！