原核细胞的原生质体融合.ppt

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1、3.53.5 原核细胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合3.5.13.5.1 革兰氏阳性菌的原生质体融合革兰氏阳性菌的原生质体融合芽孢杆菌的原生质体融合芽孢杆菌的原生质体融合 黄色短杆菌的原生质体融合黄色短杆菌的原生质体融合 棒状杆菌的原生质体融合棒状杆菌的原生质体融合 非定向融合与定向融合非定向融合与定向融合3.5.2 革兰氏阴性菌的原生质体融合革兰氏阴性菌的原生质体融合 芽孢杆菌的原生质体融合芽孢杆菌的原生质体融合研究意义研究意义许多工业上重要的酶的产生菌许多工业上重要的酶的产生菌通过遗传操纵，改良性状，改善现有发酵过程、开通过遗传操纵，改良性状，改善现有发酵过程、开发新发酵过程发新发酵

2、过程许多芽孢杆菌缺乏已知遗传信息的转移系统，无法许多芽孢杆菌缺乏已知遗传信息的转移系统，无法通过转化、转导、接合作用等方法进行遗传性状的通过转化、转导、接合作用等方法进行遗传性状的改良改良原生质体融合原生质体融合、原生质体转化原生质体转化，受到了广泛重视，受到了广泛重视，在菌种选育和改良上已取得很大的成功，同时对了在菌种选育和改良上已取得很大的成功，同时对了解这类细菌的遗传结构起到很大的推动作用解这类细菌的遗传结构起到很大的推动作用 特特点点：所所用用亲亲本本菌菌株株的的特特点点是是带带有有各各种种遗遗传传标标记记的的突突变变型型，包包括括营营养养缺缺陷陷、对对抗抗生生素素的的抗抗性性、温温度

3、度敏敏感感、呼呼吸吸缺缺陷陷、形形态态及及颜颜色色标标记等记等类型：类型：融合类型有种内融合与种间融合融合类型有种内融合与种间融合种种内内融融合合：同同种种芽芽孢孢杆杆菌菌不不同同菌菌株株之之间间的的原原生生质质体体融融合合，如如巨巨大大芽芽孢孢杆杆菌菌两两种种菌菌株株间间的的原原生生质质体体融融合合。种种内内重重组组率率极极高高，可可以以不不用用引入遗传标记引入遗传标记种种间间融融合合：属属内内不不同同种种的的芽芽孢孢杆杆菌菌的的原原生生质质体体融融合合，如如枯枯草草杆杆菌菌与与地地衣衣芽芽孢孢杆杆菌菌间间的的原原生质体融合生质体融合融合过程融合过程细菌培养：两亲本菌分别于高渗丰富营养培养细

4、菌培养：两亲本菌分别于高渗丰富营养培养液液HNBHNB中中3030培养过夜，于对数晚期或稳定前培养过夜，于对数晚期或稳定前期收获培养物，转至新鲜的期收获培养物，转至新鲜的HNBHNB培养液中继续培养液中继续培养，至培养，至A A650650 0.3-0.4 0.3-0.4，测定活细胞数，收集测定活细胞数，收集菌体菌体原生原生质质体制体制备备v采用采用SMMSMM缓缓冲液冲液系统系统（蔗糖蔗糖镁镁顺顺丁丁烯烯二酸二酸），），制制备备原生原生质质体、原生体、原生质质体稀体稀释释液、配制溶菌液、配制溶菌酶酶及及PEGPEG的溶液的溶液v临临用前加入用前加入DNaseDNase至至终浓终浓度度5 5g

5、/mlg/ml制成制成SMMDSMMD。DNaseDNase的作用在于消化的作用在于消化DNADNA，排除排除DNADNA介介导导的的转转化或化或转转染染v收集的菌体悬浮于收集的菌体悬浮于SMMDSMMD溶液中，加入溶菌溶液中，加入溶菌酶至最终浓度酶至最终浓度200200g/mlg/ml，3737或或4242水水浴浴3030分钟，用相差显微镜观察原生质体的分钟，用相差显微镜观察原生质体的形成形成v离心收集原生质体，用离心收集原生质体，用SMMADSMMAD或或SMMDSMMD（A A牛血清白蛋白）悬浮牛血清白蛋白）悬浮v涂布在含有两亲本生长所必需的营养因子涂布在含有两亲本生长所必需的营养因子的

6、再生培养基的再生培养基RDRD平板上，测定有活力的原平板上，测定有活力的原生质体数与未原生质体化的细菌数生质体数与未原生质体化的细菌数 原生质体融合：原生质体融合：两种原生质体等量混合，两种原生质体等量混合，加入加入40%40%PEG6000PEG6000，混匀，室温作用混匀，室温作用1-21-2分钟，分钟，立即用立即用SMMADSMMAD溶液稀释融合物，然后平板涂布溶液稀释融合物，然后平板涂布进行重组子的筛选进行重组子的筛选重组子的筛选重组子的筛选涂布选择性涂布选择性RDRD平板，直接选择重组子平板，直接选择重组子非选择性非选择性RD/RD/丰富高渗丰富高渗RDRD平板涂布，使两亲本平板涂布

7、，使两亲本和重组子都再生长成菌落，再影印至选择性和重组子都再生长成菌落，再影印至选择性RDRD平板上，筛选出重组子平板上，筛选出重组子这这种方法制种方法制备备的原生的原生质质体形成率体形成率为为99.9%99.9%，再，再生率生率为为3.30%3.30%，融合率，融合率为为2.28102.2810-5-5。获获得的得的重重组组子子产产量提高幅度可达量提高幅度可达130%130%再生影响因素再生影响因素 通常原生质体的再生率的范围是通常原生质体的再生率的范围是0.1-0.1-10%10%，不同微生物的原生质体再生率差异很大，不同微生物的原生质体再生率差异很大，高的可达高的可达100%100%。影

8、响因素很多，包括温度、影响因素很多，包括温度、PEGPEG作用时作用时间、渗透压稳定剂、细胞壁的消化程度、菌间、渗透压稳定剂、细胞壁的消化程度、菌种本身的特性、原生质体制备条件、再生培种本身的特性、原生质体制备条件、再生培养基组分、再生培养条件等都是重要的影响养基组分、再生培养条件等都是重要的影响因素因素温度：温度：细细菌菌生生长长温度温度与溶菌与溶菌酶酶处处理理温度都温度都可能影响原生可能影响原生质质体的再生，体的再生，这这两个温度的两个温度的差异会增加再生率与重差异会增加再生率与重组组率率PEGPEG作用作用时间时间：原生：原生质质体融合体融合时时PEGPEG处处理若理若超超过过5 5分分

9、钟钟，再生率会，再生率会显显著下降著下降 渗透渗透压稳压稳定定剂剂：再生培养基中必：再生培养基中必须须加入渗加入渗透透压稳压稳定定剂剂，原生原生质质体体对对渗透渗透压压很很敏感敏感，在低渗透在低渗透压压条件下容易破碎条件下容易破碎 细细胞胞壁壁的的消消化化：细细胞胞壁壁的的消消化化如如果果太太彻彻底底，原原生生质质体体再再生生率率会会大大幅幅度度下下降降，细细胞胞壁壁的的部分保留有助于细胞壁的再生部分保留有助于细胞壁的再生再再生生培培养养基基组组分分：重重组组子子的的选选择择方方式式直直接接影影响响原原生生质质体体再再生生率率，包包括括营营养养成成分分、药药物浓度物浓度菌种本身的特性菌种本身的

10、特性黄色短杆菌的原生质体融合黄色短杆菌的原生质体融合 黄色短杆菌的原生质体制备比芽孢杆菌黄色短杆菌的原生质体制备比芽孢杆菌困难得多，仅用溶菌酶不能除去细胞壁，困难得多，仅用溶菌酶不能除去细胞壁，需要在溶菌酶除去细胞壁之前用需要在溶菌酶除去细胞壁之前用青霉素青霉素处理对数生长期的细胞处理对数生长期的细胞 棒状杆菌的原生质体融合棒状杆菌的原生质体融合 棒状杆菌是工业上棒状杆菌是工业上氨基酸氨基酸生产菌，用产生产菌，用产生不同氨基酸的菌株融合，可得到产生生不同氨基酸的菌株融合，可得到产生多种不同氨基酸的融合子多种不同氨基酸的融合子，提高产量、，提高产量、降低成本降低成本非定向融合与定向融合非定向融合

11、与定向融合非非定定向向融融合合：以以上上三三种种细细菌菌的的融融合合均均为为活活原原生生质质体体间间的的融融合合，此此为为非非定定向向融融合合，此此时时两两种种原原生质体同为受体与供体生质体同为受体与供体定定向向融融合合：亲亲本本之之一一用用药药物物、加加热热或或紫紫外外线线灭灭活活，使使其其成成为为遗遗传传物物质质的的供供体体，另另一一亲亲本本为为活活性性原原生生质质体体，成成为为遗遗传传物物质质的的受受体体。该该方方法法的的优优点点是是只只需需对对受受体体活活性性亲亲本本作作标标记记，供供体体虽虽然然灭灭活活，仍仍可可融融合合，融融合合结结果果趋趋于于定定向向，供供体体灭灭活活亲亲本本不不

12、能能生生长长，筛筛选选效效率率得得以以提提高高。其其缺缺点点是融合率明显下降是融合率明显下降3.5.2革兰氏阴性菌的原生质体融合革兰氏阴性菌的原生质体融合 革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌存在结构革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌存在结构上的差异上的差异,革兰氏阴性菌细胞壁上含有大革兰氏阴性菌细胞壁上含有大量量脂多糖与蛋白质脂多糖与蛋白质溶菌酶对含有脂多糖与蛋白质的复杂外溶菌酶对含有脂多糖与蛋白质的复杂外层不起作用，导致细胞壁清除不彻底，层不起作用，导致细胞壁清除不彻底，影响原生质体融合。因此需要改进原生影响原生质体融合。因此需要改进原生质体制备方案质体制备方案 改改 进进 方方 案案 一一：取取 对对 数

13、数 期期 细细 胞胞，用用TrisClTrisCl缓缓冲冲液液洗洗涤涤，再再直直接接加加入入蔗蔗糖糖TrisClTrisCl溶溶液液，搅搅拌拌，加加入入溶溶菌菌酶酶，搅拌，加入搅拌，加入EDTAEDTA改进方案二：采用甘氨酸溶菌酶改进方案二：采用甘氨酸溶菌酶EDTAEDTA结合的方法。在细菌培养过程中，结合的方法。在细菌培养过程中，添加一定浓度的甘氨酸，能部分干扰细添加一定浓度的甘氨酸，能部分干扰细胞壁的合成，利于原生质体的制备胞壁的合成，利于原生质体的制备 3.6 3.6 真核细胞的原生质体融合真核细胞的原生质体融合 3.6.1 3.6.1 酵母菌的原生质体融合酵母菌的原生质体融合 3.6.

14、2 3.6.2 丝状真菌的原生质体融合丝状真菌的原生质体融合 3.6.1 3.6.1 酵母菌的原生质体融合酵母菌的原生质体融合融合种类融合种类 原原生生质质体体与与原原生生质质体体的的融融合合：种种内内融融合合、种间融合与属间融合，成功达数十种种间融合与属间融合，成功达数十种原生质体与核融合原生质体与核融合原生质体与线粒体融合原生质体与线粒体融合原生质体与核融合原生质体与核融合供供体体菌菌原原生生质质体体裂裂解解，蔗蔗糖糖梯梯度度离离心心，获获得得细细胞核胞核细细胞胞核核与与受受体体菌菌的的原原生生质质体体混混合合，核核被被摄摄入入受受体体菌菌的的原原生生质质体体内内，实实现现遗遗传传重重组组

15、。经经过过选择选择培养基培养基筛选筛选，获获得得杂杂种菌落种菌落特特点点：不不改改变变受受体体菌菌细细胞胞质质基基因因结结构构，培培育育出出具具有有杂杂种种基基因因组组的的菌菌株株，设设计计与与改改良良产产业业用菌株用菌株原生质体与线粒体融合原生质体与线粒体融合v线粒体线粒体-真核微生物进行呼吸代谢的重要细真核微生物进行呼吸代谢的重要细胞器，能单独进行蛋白质合成胞器，能单独进行蛋白质合成v一般真核微生物若无线粒体就不能生存，但一般真核微生物若无线粒体就不能生存，但啤酒酵母的呼吸缺陷型啤酒酵母的呼吸缺陷型可依靠可依靠糖酵解糖酵解能量来能量来生存。从啤酒酵母的呼吸正常菌生存。从啤酒酵母的呼吸正常菌

16、P P中取出线中取出线粒体，导入完全丧失线粒体粒体，导入完全丧失线粒体DNADNA的呼吸缺陷型的呼吸缺陷型P P0 0的原生质体中，使缺陷型的原生质体中，使缺陷型P P0 0的线粒体缺失得的线粒体缺失得到恢复，呼吸性能正常稳定，提高生物活性到恢复，呼吸性能正常稳定，提高生物活性 技术要素技术要素原生质体的制备原生质体的制备v脱脱壁壁酶酶：所所用用的的脱脱壁壁酶酶中中，以以zymolyasezymolyase效效果果最最好好，但但价价格格昂昂贵贵。广广泛泛使使用用的的有有蜗蜗牛牛酶酶、纤纤维维素素酶酶、壳壳质质酶酶等等，应应用用时时常常常常几几种种酶酶联联合合使使用用效果较好效果较好v前前处处理

17、理：收收集集对对数数生生长长期期的的细细胞胞，用用EDTAEDTA、巯巯基基乙乙醇醇进进行行前前处处理理，切切断断细细胞胞壁壁蛋蛋白白质质的的S-SS-S链链；必必要要时时，培培养养基基中中加加入入少少量量2-2-脱脱氧氧D-D-葡葡萄萄糖糖，阻碍细胞壁的形成阻碍细胞壁的形成v基本培养基：在基本培养基上生长的菌体，原基本培养基：在基本培养基上生长的菌体，原生质体形成率高于完全培养基生质体形成率高于完全培养基 原生质体融合原生质体融合 用低浓度用低浓度PEGPEG（20-35%20-35%）或聚乙烯醇或聚乙烯醇PVAPVA作为促融合剂，融合时间较长，作为促融合剂，融合时间较长，3030作用作用1

18、5-3015-30分钟分钟。CaCl CaCl2 2的最适浓度为的最适浓度为5-505-50mMmM K K+、NaNa+与磷酸盐缓冲液与磷酸盐缓冲液 再再生生：十十分分困困难难，10%10%，在在不不加加营营养养物物质质的的基本培养基上几乎不能再生。基本培养基上几乎不能再生。v用用明胶明胶代替琼脂作培养基固形剂代替琼脂作培养基固形剂v在再生培养基中加入在再生培养基中加入牛血清白蛋白牛血清白蛋白（BSABSA）、）、小牛小牛血清血清、明胶明胶等等v将原生质体先用藻酸钙将原生质体先用藻酸钙凝胶包埋凝胶包埋，再于液体培养，再于液体培养基中再生基中再生v再生时原生质体再生时原生质体密度密度不宜过高，

19、以免相互抑制不宜过高，以免相互抑制v预处理时巯基乙醇浓度不宜过高预处理时巯基乙醇浓度不宜过高v控制控制酶酶作用时间作用时间融合子的检测融合子的检测v常用常用营养缺陷型营养缺陷型与与抗药性抗药性v经经过过细细胞胞质质融融合合、核核融融合合，最最后后形形成成融融合合体体或或异核体异核体v融融合合体体：杂杂合合双双倍倍体体或或单单倍倍的的重重组组体体，稳稳定定原原养养型型v异异核核体体：暂暂时时融融合合状状态态，经经过过体体细细胞胞分分离离，最最终终成为亲本类型。成为亲本类型。真正的融合子，必须进行数代的自然分离与选择真正的融合子，必须进行数代的自然分离与选择v选选择择方方法法：直直接接选选择择法法

20、、间间接接选选择择法法、钝钝化化选选择法择法融合子的分析融合子的分析v核型标记（如营养缺陷型）、细胞质型标核型标记（如营养缺陷型）、细胞质型标记（如呼吸缺陷）分析核内外遗传基因动记（如呼吸缺陷）分析核内外遗传基因动向向vDAPIDAPI荧光染色，清楚地观察核相，判断异荧光染色，清楚地观察核相，判断异核体是保持原状还是融合成一个核；核体是保持原状还是融合成一个核；v细胞细胞DNADNA含量、细胞体积、形态、倍数体含量、细胞体积、形态、倍数体应用应用酵母是食品、医药行业上用途广泛的工业酵母是食品、医药行业上用途广泛的工业微生物微生物酵母不但在种内酵母不但在种内,而且在种间、属间甚至而且在种间、属间

21、甚至在门间都可实行细胞融合，广泛组合了在门间都可实行细胞融合，广泛组合了各各种基因型种基因型，实现种属以上，实现种属以上超远缘杂交超远缘杂交理论研究理论研究：进行核与细胞器的导入、质：进行核与细胞器的导入、质粒的转移，细胞学、遗传学基础理论粒的转移，细胞学、遗传学基础理论实际应用方面实际应用方面：不需要进行深入的遗传学基：不需要进行深入的遗传学基础研究，仪器设备要求低，重组效率比较高，础研究，仪器设备要求低，重组效率比较高，工业微生物育种的重要手段。成功事例很多工业微生物育种的重要手段。成功事例很多v酿酒酵母和糖化酵母酿酒酵母和糖化酵母种间融合成功，融合子具有种间融合成功，融合子具有糖化与发酵

22、的双重能力糖化与发酵的双重能力v糖化酵母和出芽短枝霉糖化酵母和出芽短枝霉的融合株能直接发酵可溶的融合株能直接发酵可溶性淀粉性淀粉v酿酒酵母的单倍体与二倍体进行融合获得的营养酿酒酵母的单倍体与二倍体进行融合获得的营养互补的互补的三倍体三倍体，其酒精产率和生长速率均比亲株提，其酒精产率和生长速率均比亲株提高高1-21-2倍倍 3.6.2 3.6.2 丝状真菌的原生质体融合丝状真菌的原生质体融合 特点特点与酵母相似，其原生质体再生比细菌困难与酵母相似，其原生质体再生比细菌困难遗传重组率低遗传重组率低融合产物的鉴定也比细菌复杂，需要进行细融合产物的鉴定也比细菌复杂，需要进行细胞学、生物化学和遗传学的分

23、析，确定其遗胞学、生物化学和遗传学的分析，确定其遗传稳定性和倍性传稳定性和倍性种内种内、种间均可进行融合，但种间融合率低、种间均可进行融合，但种间融合率低得多，约低得多，约低5 5个级数个级数 技术要素技术要素原生质体制备与融合原生质体制备与融合v选选择择对对数数生生长长早早期期的的菌菌丝丝体体，用用硫硫醇醇化化物物如如DTTDTT预预处处理理菌菌丝丝，可可有有效效降降低低二二硫硫化化物物的的形成形成v采采用用来来源源容容易易的的蜗蜗牛牛酶酶，酶酶处处理理液液中中须须加加入入CaClCaCl2 2，必必须须排排除除NaNa+、K K+；PEGPEG最最适适浓浓度度为为25-30%25-30%。

24、原生质体再生原生质体再生v再再生生培培养养基基采采用用选选择择性性基基本本再再生生培培养养基基，异异核核体体在在完完全全再再生生培培养养基基或或无无正正相相选选择择的的培培养养基基上上生生长长时时，会会很很快快导导致致亲亲本本型型的的分分离离v遗遗传传标标记记多多采采用用抗抗药药性性标标记记与与非非选选择择性性标标记记（如如菌菌落落形形态态、孢孢子子颜颜色色、代代谢谢产产物物）来筛选融合子来筛选融合子应用应用丝状真菌产生的丝状真菌产生的-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素是临床上最是临床上最重要的抗生素，疗效高，毒副作用小重要的抗生素，疗效高，毒副作用小菌种改良的目的：提高菌种改良的目的：提高重要代

25、谢产物的质和量重要代谢产物的质和量。采用种内原生质体融合，已取得很大成效采用种内原生质体融合，已取得很大成效产生产生青霉素青霉素的产黄青霉菌的产黄青霉菌产产头孢菌素头孢菌素的顶头孢霉的顶头孢霉产产柠檬酸柠檬酸的黑曲霉的黑曲霉通过种内原生质体融合，提高菌株的生长速度、改良通过种内原生质体融合，提高菌株的生长速度、改良菌株形态特性、提高了产品质量。原生质体融合技菌株形态特性、提高了产品质量。原生质体融合技术对工业丝状真菌菌株改良潜力巨大术对工业丝状真菌菌株改良潜力巨大 3.7 3.7 原生质体技术中的一些特殊原生质体技术中的一些特殊技术技术 3.7.1 3.7.1 电融合技术电融合技术 3.7.2

26、 3.7.2 脂质体脂质体(liposome)liposome)技术技术 3.7.3 3.7.3 原生质体转化及诱变原生质体转化及诱变3.7.4 3.7.4 原生质体技术的应用原生质体技术的应用 3.7.1 3.7.1 电融合技术电融合技术电融合技术结合电学与生物化学技术，电融合技术结合电学与生物化学技术，提高融合效率，成为遗传工程和细胞操提高融合效率，成为遗传工程和细胞操作的有效手段作的有效手段电融合技术原理电融合技术原理电电降解降解双向双向电电泳泳 电电降解降解电降解电降解：在强度范围非常：在强度范围非常狭窄狭窄、时间间隔、时间间隔非常非常短短的高频电场脉冲环境下，细胞膜的的高频电场脉冲环

27、境下，细胞膜的透性增加，形成微孔透性增加，形成微孔可逆电降解：可逆电降解：电场诱发的电场诱发的微孔面积微孔面积和和数目，数目，与细胞膜总表面积相比较小时，经过一段时间，与细胞膜总表面积相比较小时，经过一段时间，微孔可以重新封闭微孔可以重新封闭不可逆电降解：不可逆电降解：当脉冲的时间间隔过长、电当脉冲的时间间隔过长、电场强度过大时，会导致微孔增大，数目增多，场强度过大时，会导致微孔增大，数目增多，可逆电降解变为不可逆电降解可逆电降解变为不可逆电降解电流和电场电流和电场同细胞内的结构和成分（蛋同细胞内的结构和成分（蛋白质与核酸）的相互作用及通电时的白质与核酸）的相互作用及通电时的热热效应效应均会产

28、生有害的副作用，导致细胞均会产生有害的副作用，导致细胞的损伤的损伤要实现可逆电降解，应该用极短的电场要实现可逆电降解，应该用极短的电场脉冲（时间为几脉冲（时间为几微秒微秒或更少）。发生电或更少）。发生电降解的膜电压为降解的膜电压为1 1V V，对于对于4 4mmmm的球形细胞的球形细胞来说，对应的电场强度约为来说，对应的电场强度约为3 3KVcmKVcm-1-1，若若电极间距离为电极间距离为200200mmmm，所用电压应为所用电压应为6060V V 双向双向电电泳泳细细胞胞膜膜上上产产生生微微孔孔，还还不不足足以以使使原原生生质质体体彼彼此此融融合合，作作为为电电融融合合的的另另一一条条件件

29、是是需需要要原原生生质体质体紧密接触紧密接触双向电泳技术双向电泳技术双双向向电电泳泳原原理理：细细胞胞受受到到一一种种非非均均匀匀交交流流电电场场的的作作用用而而呈呈现现出出来来的的特特征征性性的的漂漂移移，结结果果形成链状的细胞聚集物形成链状的细胞聚集物电电融融合合技技术术：在在原原生生质质体体混混合合后后，在在100100V/cmV/cm的的高高频频交交流流电电场场作作用用下下，形形成成项项链链状状构构型型，再再用用1-51-5KVcmKVcm-1-1脉脉冲冲/微微秒秒降降解解原原生生质质膜膜，并并诱诱发原生质体融合发原生质体融合 电电融合技融合技术术的的优优点点易易于于挑挑选选：可可在在

30、显显微微镜镜下下观观察察追追踪踪，辨辨认杂种并移到培养基上进行培养。认杂种并移到培养基上进行培养。融融合合率率高高:融融合合率率可可达达70-80%70-80%，甚甚至至100%100%。安安全全：一一定定强强度度的的脉脉冲冲处处理理短短暂暂的的时时间间对对原原生生质质体体无无毒毒害害，电电融融合合的的细细胞胞活活力力很高，杂种成活率高很高，杂种成活率高用途广泛用途广泛原生质体融合原生质体融合释释放放细细胞胞内内物物质质；如如氨氨基基酸酸、激激素素、蛋蛋白白质质药药物物导导入入；将将药药物物如如抗抗生生素素通通过过电电融融合合技技术术导导入入红红血血球球和和淋淋巴巴细细胞胞中中，再再输输入入到

31、到生生物体内预定部位物体内预定部位生生物物大大分分子子的的导导入入；蛋蛋白白质质、核核酸酸均均可可通通过该途径导入细胞内过该途径导入细胞内3.7.2 3.7.2 脂质体脂质体(liposome)liposome)技术技术 脂脂质质体的体的结结构构脂脂质质体体：人人工工模模拟拟的的原原生生质质体体，根根据据生生物物膜膜的的成成分分和和结结构构，模模拟拟制制造造的的人人工工膜膜。膜膜内内包包裹裹着着核核酸酸等等大大分分子子物物质质，通通过过与与细细胞胞质质膜膜融融合合，实现大分子物质的转移实现大分子物质的转移细细胞胞质质膜膜的的主主要要成成分分是是磷磷脂脂分分子子和和蛋蛋白白质质，磷磷脂双分子层构

32、成细胞质膜的骨架。脂双分子层构成细胞质膜的骨架。磷磷脂脂悬悬浮浮在在水水中中，高高能能声声波波处处理理时时，磷磷脂脂分分子子聚集，形成密集的小泡囊状结构聚集，形成密集的小泡囊状结构-脂质体脂质体 外部水相外部水相 内部水相内部水相 脂质体壁脂质体壁 取脂质体壁的一部分放大取脂质体壁的一部分放大 生物膜上磷脂生物膜上磷脂 排列的排列的X-衍射图衍射图 脂脂质质体的分体的分类类l多多层层泡泡囊囊MLVMLV：最最早早最最简简单单的的脂脂质质体体，其其特特点点是大小不均匀，约为是大小不均匀，约为0.10.11010mm。l单单层层泡泡囊囊SUVSUV：多多层层泡泡囊囊MLVMLV经经过过超超生生波波

33、处处理理或挤压产生的小而均匀的颗粒即为单层泡囊或挤压产生的小而均匀的颗粒即为单层泡囊SUVSUV。l大大单单层层泡泡囊囊LUVLUV：通通过过乙乙醚醚注注射射、CaCa2+2+-EDTA-EDTA镶嵌、去污剂透析制备而成的脂质体镶嵌、去污剂透析制备而成的脂质体l反反向向蒸蒸发发脂脂质质体体REVREV：大大单单层层泡泡囊囊LUVLUV经经过过反反相蒸馏而制备而成的脂质体相蒸馏而制备而成的脂质体 种类种类大小大小包裹率包裹率（ml/molml/mol脂质脂质体）体）特点特点MLVMLV不均匀，不均匀，0.10.11010mm5 5 1010最早最简单广泛最早最简单广泛SUVSUV小而均匀，小而均

34、匀，20202525nmnm0.10.10.50.5太小，用处不大太小，用处不大LUVLUV0.10.10.60.6mm1000100050005000效率高，多用效率高，多用REVREV0.10.11 1mm更高更高效率高，应用广效率高，应用广泛泛四种脂质体的性能比较四种脂质体的性能比较脂脂质质体体优优点点 一种简单、安全、有效的核酸传递技术一种简单、安全、有效的核酸传递技术 性能稳定：包裹核酸的脂质体，可在性能稳定：包裹核酸的脂质体，可在44、惰性环境中（氮气或氩气）保存一直到使惰性环境中（氮气或氩气）保存一直到使用为止，因此做成功一批包裹用为止，因此做成功一批包裹DNADNA的脂质体，的

35、脂质体，可以用来进行一系列的实验可以用来进行一系列的实验与细胞质膜相似的结构，使它能与受体细与细胞质膜相似的结构，使它能与受体细胞膜融合胞膜融合 结构简单，没有细胞质、细胞器等结构，结构简单，没有细胞质、细胞器等结构，是单纯的核酸转移，无影响因素是单纯的核酸转移，无影响因素与转化方式（裸露与转化方式（裸露DNADNA的转移）相比，其的转移）相比，其优点在于可保护内部核酸不受受体细胞所优点在于可保护内部核酸不受受体细胞所分泌的核酸酶的消化以及其它物理、化学分泌的核酸酶的消化以及其它物理、化学因素的因素的剪切降解剪切降解包裹包裹过过程程安全，安全，不会引起不会引起DNADNA性性质质的明的明显显改

36、改变变 脂质体技术的应用脂质体技术的应用 传递核酸传递核酸 传递蛋白质、抗体、药物、细胞毒素通过传递蛋白质、抗体、药物、细胞毒素通过脂质体的传递作用，药物能直接作用于靶脂质体的传递作用，药物能直接作用于靶细胞，提高治疗效果，减少药物毒性对机细胞，提高治疗效果，减少药物毒性对机体细胞的损害体细胞的损害 脂质体技术现已越来越多地应用到生脂质体技术现已越来越多地应用到生物学及药学领域，在细胞膜的研究、遗传物学及药学领域，在细胞膜的研究、遗传育种、药效研究等方面起着重要的作用育种、药效研究等方面起着重要的作用传递核酸传递核酸核酸转移传递的方式有很多（接合作用、核酸转移传递的方式有很多（接合作用、转化、

37、转导、融合），对特定的细胞，每转化、转导、融合），对特定的细胞，每种方法都行之有效，但各种方法都有其限种方法都行之有效，但各种方法都有其限制条件，存在一定的局限性制条件，存在一定的局限性脂质体传递核酸，为改变生物的遗传性状脂质体传递核酸，为改变生物的遗传性状提供了一个新的途径提供了一个新的途径对对微生物微生物细胞的核酸传递细胞的核酸传递v链霉菌链霉菌细胞很难通过转化的途径实现细胞很难通过转化的途径实现DNADNA的转的转移。采用脂质体包裹链霉菌染色体移。采用脂质体包裹链霉菌染色体DNADNA，与链与链霉菌营养缺陷型原生质体保温，加入霉菌营养缺陷型原生质体保温，加入PEGPEG促使促使其融合，再

38、生子代中有其融合，再生子代中有2 21010的菌落带有供的菌落带有供体体DNADNA的遗传标记的遗传标记v乳酸杆菌乳酸杆菌(在工在工业业中广泛用于乳制品的中广泛用于乳制品的发发酵酵)的菌种改良不能采用的菌种改良不能采用DNADNA重重组组技技术术，因，因为为乳酸乳酸菌在培养菌在培养过过程中分泌大量的核酸程中分泌大量的核酸酶酶。采用。采用REVREV脂脂质质体包裹法克服了体包裹法克服了这这个困个困难难，实现实现了菌种了菌种的改良的改良 对对哺乳动物哺乳动物细胞的传递细胞的传递v通过通过脂脂质质体体DNADNA传递传递系系统统，对于缺乏常规遗传交换，对于缺乏常规遗传交换体制，或引进体制，或引进DN

39、ADNA重组技术尚未成功的哺乳动物细重组技术尚未成功的哺乳动物细胞型进行遗传研究胞型进行遗传研究v通过脂质体的通过脂质体的DNADNA传送及其在细胞中的表达，制作传送及其在细胞中的表达，制作灵敏的鉴别探针，来研究脂质体与细胞的相互作用，灵敏的鉴别探针，来研究脂质体与细胞的相互作用，测定促进细胞吸收传递物质的因素测定促进细胞吸收传递物质的因素v从从HGPRTHGPRT的鼠人杂种细胞中分离得到中期染色体，的鼠人杂种细胞中分离得到中期染色体，用脂质体包裹，与用脂质体包裹，与HGPRTHGPRT-的的A A9 9细胞融合，其转移细胞融合，其转移频率达频率达10105 5，比裸露染色体转化高，比裸露染色

40、体转化高1010多倍。所得转多倍。所得转化子能稳定地表达化子能稳定地表达HGPRTHGPRT活性（活性（HGPRTHGPRT：次黄嘌呤鸟次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）嘌呤磷酸核糖转移酶）对对植物细胞植物细胞的传递的传递 以脂质体为媒介把核酸导入植物细胞原生以脂质体为媒介把核酸导入植物细胞原生质体，效果比对动物细胞的传递更好。在质体，效果比对动物细胞的传递更好。在PEGPEG的的作用下，更易实现融合作用下，更易实现融合传递整个细胞核：将整个核包裹进入脂质体中，进传递整个细胞核：将整个核包裹进入脂质体中，进而实现整个核的转移而实现整个核的转移传递质粒：传递质粒：DNADNA、噬菌体噬菌体T T7

41、7DNADNA、pBR322pBR322等一些纯等一些纯化的化的DNADNA分子均已成功包裹入脂质体，转化入细胞的分子均已成功包裹入脂质体，转化入细胞的过程中，能有效对抗过程中，能有效对抗DNaseDNase的消化作用的消化作用 传递蛋白质、抗体、药物、细胞毒素传递蛋白质、抗体、药物、细胞毒素 通过脂质体的传递作用，药物能直通过脂质体的传递作用，药物能直接作用于靶细胞，提高治疗效果，减少药接作用于靶细胞，提高治疗效果，减少药物毒性对机体细胞的损害物毒性对机体细胞的损害 脂质体技术现已越来越多地应用到脂质体技术现已越来越多地应用到生物学及药学领域，在细胞膜的研究、遗生物学及药学领域，在细胞膜的研

42、究、遗传育种、药效研究等方面起着重要的作用传育种、药效研究等方面起着重要的作用原生质体转化原生质体转化 外源外源DNADNA转化原生质体，在细菌、链霉菌、转化原生质体，在细菌、链霉菌、真菌都取得成功，用真菌都取得成功，用PEGPEG短时间处理，可使转短时间处理，可使转化频率大大提高化频率大大提高 原生质体原生质体诱变诱变 由于原生质体没有细胞壁，因此更易获得由于原生质体没有细胞壁，因此更易获得诱发突变体。用紫外线诱变苏氨酸产生菌的原诱发突变体。用紫外线诱变苏氨酸产生菌的原生质体，使生质体，使L L苏氨酸产量由苏氨酸产量由1515mgmgmlml提高至提高至21.5 21.5 mgmgml ml

43、 3.7.3 3.7.3 原生质体转化及诱变原生质体转化及诱变以以枯枯草草杆杆菌菌为为供供体体，提提取取染染色色体体DNADNA，转转化化地地衣衣芽芽孢孢杆杆菌菌，转转化化率率最最高高可可达达10102 2，大大高于融合频率（大大高于融合频率（2.28102.28105 5）真真菌菌原原生生质质体体转转化化要要点点：CaCa2+2+、PEGPEG必必须须存存在在，外外源源DNADNA通通常常为为线线状状或或环环状状双双链链DNADNA（dsDNAdsDNA），转转化化DNADNA量量约约1 12020mgmg；原原生质体浓度为生质体浓度为10108 810109 9mlml 传递细胞器传递细胞

44、器传递传递病毒病毒核的转移核的转移质粒转移质粒转移耐热性研究及菌种筛选耐热性研究及菌种筛选改良菌种改良菌种抗生素研究抗生素研究酶的研究酶的研究3.7.4 3.7.4 原生质体技术的应用原生质体技术的应用传递细胞器传递细胞器线粒体的传递线粒体的传递 叶绿体的传递。叶绿体的传递。PEGPEG诱导诱导菠菜叶菠菜叶绿绿体体转转入入粗糙粗糙链孢链孢霉的原生霉的原生质质体，每个原生体，每个原生质质体可体可以接受以接受4040个叶个叶绿绿体，两个体系在一定体，两个体系在一定时间时间内完整地共内完整地共存存，表达各自的表达各自的功能功能 病毒的传递病毒的传递通通过过原原生生质质体体技技术术可可实实现现病病毒毒

45、的的传传递递，这这个个研研究究主主要要在在真真核核微微生生物物中中进进行行，因因为为原原核核微微生生物物病病毒毒可可以以通通过过病病毒毒与与寄寄主主混混合合培培养养成成功功地地侵侵染染寄主细胞寄主细胞真菌中，有的种感染病毒，有的种不感染病毒。真菌中，有的种感染病毒，有的种不感染病毒。通过真菌原生质体融合，无论是种内融合还是通过真菌原生质体融合，无论是种内融合还是种间融合，可以实现病毒传递，种间融合，可以实现病毒传递，扩大了病毒的扩大了病毒的侵染范围侵染范围。而且病毒的传递稳定而持久，保持。而且病毒的传递稳定而持久，保持着较高浓度着较高浓度 种间病毒传递受核遗传物质的控制，核因子种间病毒传递受核

46、遗传物质的控制，核因子(遗传物质遗传物质)控制着病毒生存和复制，并非单控制着病毒生存和复制，并非单纯的胞质遗传纯的胞质遗传真真菌菌病病毒毒的的复复制制对对寄寄主主核核类类型型的的依依赖赖性性很很强强，同同时时也也说说明明通通过过原原生生质质体体融融合合技技术术，的的确确能能使双亲遗传物质得到交换与重组使双亲遗传物质得到交换与重组病毒传递的应用病毒传递的应用v获得病毒感染寄主细胞的同步体系获得病毒感染寄主细胞的同步体系v扩大真菌病毒的寄主范围扩大真菌病毒的寄主范围v研究病毒与寄主，病毒与病毒间的相互关系研究病毒与寄主，病毒与病毒间的相互关系核的转移核的转移基于原生质体融合技术建立的一种核与原生质

47、体基于原生质体融合技术建立的一种核与原生质体融合方法，实现核的转移融合方法，实现核的转移酶解获得酿酒酵母稳定营养缺陷型菌株的原生质酶解获得酿酒酵母稳定营养缺陷型菌株的原生质体体 使其在低渗溶液中破裂使其在低渗溶液中破裂 释放细胞核释放细胞核 通通过蔗糖密度梯度离心收集细胞核过蔗糖密度梯度离心收集细胞核 核与营养缺陷核与营养缺陷互补的受体菌原生质体混合互补的受体菌原生质体混合 在在PEG和和Ca2+存在存在下进行融合处理下进行融合处理 在基本培养基上选择融合子在基本培养基上选择融合子 实现核的转移实现核的转移研究核与核，以及核与质之间的相互关系，并为研究核与核，以及核与质之间的相互关系，并为育种

48、工作提供了新的模式育种工作提供了新的模式质粒转移质粒转移微生物可通过转化、转导、接合和转染等多微生物可通过转化、转导、接合和转染等多种方式传递遗传信息种方式传递遗传信息对于不具备这些条件的微生物，其遗传物质对于不具备这些条件的微生物，其遗传物质的传递研究和育种工作皆受到一定的限制的传递研究和育种工作皆受到一定的限制由于原生质体融合可在种内、种间甚至属间由于原生质体融合可在种内、种间甚至属间进行，因此可通过原生质体融合将质粒转移进行，因此可通过原生质体融合将质粒转移到非感受态菌株之中，为基因转移和育种提到非感受态菌株之中，为基因转移和育种提供新的途径供新的途径枯草杆菌枯草杆菌BD336(pUBl

49、l0)(try-、thr-、Kmr、Nmr，两两种抗药性来自质粒种抗药性来自质粒)和枯草杆菌和枯草杆菌G1(Smr，抗性来源于抗性来源于染色体基因突变染色体基因突变)为融合亲本进行融合，融合后在含有为融合亲本进行融合，融合后在含有三种抗生素三种抗生素(Km、Nm、Sm)的高渗培养基上选择融合的高渗培养基上选择融合子子v在排除了转化和接合的可能性以后，肯定了质粒的转在排除了转化和接合的可能性以后，肯定了质粒的转移移v33株表现为双亲共有的抗药性及株表现为双亲共有的抗药性及G1的营养需要，在的营养需要，在37传传34代和代和50传传4代后抗药性和营养需要仍保持代后抗药性和营养需要仍保持不变，排除了

50、异核体的可能不变，排除了异核体的可能v取取4株进行质粒消除，发现消除质粒后菌落与株进行质粒消除，发现消除质粒后菌落与G1的形的形态相同，从而说明这种类型的融合子是态相同，从而说明这种类型的融合子是G1获得获得BD336的质粒的质粒pUC110后丢失了其染色体而形成的后丢失了其染色体而形成的耐热性研究及菌种筛选耐热性研究及菌种筛选许多种微生物能在许多种微生物能在4565生存，有的甚至更生存，有的甚至更高。有的种可在高。有的种可在98温泉中生长繁殖。关于微温泉中生长繁殖。关于微生物耐热性的机理尚不明了，但具耐热性却有生物耐热性的机理尚不明了，但具耐热性却有很重要的应用价值很重要的应用价值在酒精酿造