NY_T 554-2023 鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术.docx

《NY_T 554-2023 鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NY_T 554-2023 鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术.docx（15页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、NY/T鸭甲型病毒性肝炎型和型诊断技术范围本文件规定了鸭甲肝病毒型和型在鸭胚中的分离、RTPCR鉴定、RTqPCR鉴定;鸭甲肝病毒型的微量中和试验鉴定、抗体的微量中和试验检测和胚胎中和试验方法;鸭甲肝病毒抗体的胚胎中和试验方法.本文件适用于鸭甲型病毒性肝炎型和型的诊断与检疫.规范性引用文件本文件没有规范性引用文件.术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.缩略语下列缩略语适用于本文件.iirDHAV:鸭甲肝病毒(DuckHepattsAVius)DEF:鸭胚成纤维细胞(DuckEmbryoFibroblasts)DEL:鸭胚肝细胞(DuckEmbryoLiverCels)tisDEEC:鸭胚上

2、皮细胞(DuckEmbryoEpihelalCel)CPE:细胞病变(CytopathicEfect)feastiiDMEM:杜氏改良伊格尔培养基(DulbeccosModiidEagleMedium)TCID:半数细胞培养感染量(MedinTisueCulureInfectveDose)W/V:重量体积比(Weght/Volume)iiiiPiRTPCR:反转录聚合酶链反应(ReverseTranscrptonPolymeraseChanReacton)PBS:磷酸盐缓冲液(hosphateBuferSalne)iiiqRTqPCR:荧光定量PCR(uanttatverealtmePCR)临

3、床诊断􀆰临床症状􀆰􀆰该病主要发生于周龄以内的雏鸭,并且以周龄内的雏鸭为主.感染鸭发病急、传播快、病死率高.􀆰􀆰发病初期,病鸭精神萎靡,食欲减退或废绝,眼半闭呈昏睡状,头触地;hh后,病鸭出现神经症状,表现为运动失调、身体倒向一侧、两脚痉挛,死前头向背部扭曲,两腿伸直、向后张开,呈典型的角弓反张状.􀆰􀆰最急性病鸭常未见任何异常而突然抽搐痉挛死亡.􀆰病理变化􀆰􀆰大体病变主要为肝脏肿大、质地易脆,表面呈黄红色或花斑状,并有

4、特征性的点状出血或刷状出血.􀆰􀆰多数病例可见胆囊肿胀、胆汁充盈,部分病例脾脏肿大.􀆰􀆰急性病例的组织学病变表现为肝细胞坏死、变性和淋巴细胞浸润,慢性病例或耐过鸭常见不同程NY/T度的空泡变性和淋巴细胞聚集.􀆰结果判定凡具有􀆰临床症状和􀆰病理变化的病鸭,初步判定为疑似鸭病毒性肝炎.病毒分离􀆰仪器设备􀆰􀆰冷冻台式离心机.􀆰􀆰照蛋器.􀆰􀆰恒温培养箱.&

5、#1049008;􀆰mL注射器及针头.􀆰􀆰手术剪.􀆰􀆰镊子.􀆰􀆰研钵.􀆰耗材􀆰m细菌滤器.􀆰试剂􀆰􀆰青霉素.􀆰􀆰链霉素.􀆰􀆰卡那霉素.􀆰􀆰PBS溶液,按照附录A的规定配制.􀆰􀆰甘油生理盐水.􀆰胚胎日龄日龄DHAV或DHAV

6、抗体阴性鸭胚.􀆰样品采集􀆰􀆰采集感染初期或发病急性期病鸭的肝脏.􀆰􀆰送检病料置于灭菌的甘油生理盐水中.􀆰样品保存􀆰􀆰采集的样品若在h内处理,可于保存.􀆰􀆰或尽快置于以下保存(储存最好).􀆰样品处理􀆰􀆰组织样品于研钵中研磨后加入倍倍pH􀆰􀆰的PBS溶液,制成组织悬浮液.然后r/min离心min,取上清液作为接种材料.⣺

7、08;􀆰为防止细菌污染,可在样品液中加入青霉素IU/mL、链霉素g/mL和卡那霉素g/mL,于温箱中作用min.或采用􀆰m细菌滤器对上述病料样品液作滤过除菌.􀆰􀆰对处理的样品作无菌检验.􀆰鸭胚接种􀆰􀆰取已处理并且无菌检验合格的样品,经尿囊腔接种日龄日龄的非免疫鸭胚,每枚鸭胚接种􀆰mL病毒液,每个样品接种枚枚鸭胚.将已接种病毒的鸭胚置于恒温培养箱中孵育.􀆰􀆰弃去接种后h内死亡的鸭胚.对h内未死亡的鸭胚,每间隔h观察胚胎

8、的死亡情况.收集hh死亡鸭胚,放入冰箱中静置hh,待鸭胚血管收缩,进行鸭胚剖检.􀆰胚胎病变胚胎大体病变为发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢水肿.胚肝呈黄红色、肿胀,并可能有坏死灶.NY/T􀆰病毒收获无菌收取hh内的死胚或活胚的尿囊液和肝脏,保存备用.RTPCR检测􀆰仪器􀆰􀆰冷冻离心机.􀆰􀆰凝胶成像系统.􀆰􀆰PCR仪.􀆰耗材􀆰􀆰RNaseFree离心管.􀆰h

9、9008;􀆰mL的指形管.􀆰􀆰􀆰mL的指形管.􀆰试剂􀆰􀆰DHAV上下游引物.􀆰􀆰DHAV上下游引物.􀆰􀆰RNA抽提试剂盒.􀆰􀆰逆转录酶.􀆰􀆰dNTPs.􀆰􀆰TaqDNA酶.􀆰􀆰琼脂糖.􀆰􀆰bpDNALadder.h

10、9008;􀆰PBS溶液,按照附录A中A􀆰的规定配制.􀆰􀆰氯仿.􀆰􀆰的乙醇.􀆰􀆰RNaseFreeddHO.􀆰􀆰阳性核酸对照.􀆰􀆰阴性核酸对照.􀆰DHAV的检测􀆰􀆰引物CCDHAVF:AAGAAGGAGAAAATY(或T)AAGGAAGG;DHAVR:TTGATGTCATAGCCCAAS(或G)ACAGC;扩增D基因片段,长度为b

11、p.DHAVF:TGGCTATTGACTTTGGCTT;DHAVR:TGTTATGGACTGGAACCACT;扩增UTR区域,扩增长度为bp.􀆰􀆰病料的处理W以无菌术式收集病鸭的肝脏,或胚胎的肝脏、尿囊液.肝脏样品在组织研磨器中研磨成乳糜状,加PBS制成(/V)悬浮液.肝脏悬浮液或尿囊液经r/min离心min,取上清液备用.􀆰􀆰病毒核酸的抽提􀆰􀆰􀆰用RNA抽提试剂盒提取病毒的RNA.取L尿囊液或肝组织研磨上清液于一新的RNaseFree离心管中,加入L裂解液,剧烈振荡,

12、室温下静置min.􀆰􀆰􀆰随后加L氯仿,剧烈振荡s,室温下放置min.NY/T􀆰􀆰􀆰r/min离心min,取上清液于另一支离心管中.加入等体积的乙醇,混匀.再将溶液转移到吸附柱中.􀆰􀆰􀆰r/min离心s,弃掉滤液(溶液较多的情况下,可多次进行).向吸附柱中加入L去蛋白溶液,r/min离心s,弃掉滤液.􀆰􀆰􀆰向吸附柱中加入L漂洗液,静置min.r/min离心s,弃掉滤液(重复次).&#

13、1049008;􀆰􀆰r/min离心min,弃掉滤液,室温静置数分钟,以彻底晾干漂洗液.􀆰􀆰􀆰将吸附柱转移到一个新的RNaseFree离心管中,加入LLRNaseFreeddHO,静置min.􀆰􀆰􀆰r/min离心min,收集含RNA的滤液.获得的RNA溶液保存于或者直接用于RTPCR.􀆰􀆰RTPCR扩增􀆰􀆰􀆰一步法RTPCR.取支􀆰mL的指形管,一

14、管加入DHAV上下游引物(DHAVF和DHAVR)各pmol,另一管加入DHAV上下游引物(DHAVF和DHAVR)各pmol.随后分别在两管中依次加入下列试剂,总体积为L:a)模板,提取样品的总RNAL;b)逆转录酶,L;c)mmol/LdNTPs,L;d)TaqDNA酶,L;e)RTPCR缓冲液,L;f)RNaseFreeddHO至L.􀆰􀆰􀆰于PCR仪中扩增:反转录min;预变性min;变性s,退火s,延伸s,共进行个循环;再延伸min.同时,设立DHAV和DHAV阳性以及阴性对照.􀆰􀆰⣺

15、08;反应结束后电泳检测.􀆰􀆰PCR产物的电泳检测反应结束后,取LLPCR产物于􀆰􀆰的琼脂糖凝胶中电泳,同时以bpDNALadder为参照.电泳条件为V恒压、电泳min.电泳结束后,将凝胶于紫外灯下观察.􀆰􀆰结果判定􀆰􀆰􀆰DHAV阳性对照在bp处有一条特异的DNA条带,或者DHAV阳性对照在bp处有一条特异性条带,阴性对照没有目的带,判定试验成立.􀆰􀆰􀆰待检样品在bp位置有DNA带

16、,判定为DHAV阳性,否则为阴性.􀆰􀆰􀆰待检样品在bp位置处有条带,判定为DHAV阳性,否则为阴性.􀆰􀆰􀆰如同一待检样品均可扩增出bp和bp的条带,阴性无条带,则判定为DHAV和DHAV混合感染.RTqPCR检测􀆰仪器􀆰􀆰冷冻离心机.􀆰􀆰恒温水浴箱.􀆰􀆰荧光定量PCR仪.􀆰耗材􀆰􀆰RNaseFree离心管.&#

17、1049008;􀆰􀆰mL的指形管.NY/T􀆰􀆰􀆰mL的指形管.􀆰试剂􀆰􀆰DHAV上下游引物或DHAV上下游引物.􀆰􀆰RNA抽提试剂盒.􀆰􀆰逆转录酶.􀆰􀆰dNTPs.􀆰􀆰TaqDNA酶.􀆰􀆰RNA酶抑制剂.􀆰􀆰PBS溶液,按照附录A中A

18、049008;的规定配制.􀆰􀆰氯仿.􀆰􀆰的乙醇.􀆰􀆰RNaseFreeddHO.􀆰􀆰SYBRGreenMasterMix.􀆰􀆰阳性核酸对照.􀆰􀆰阴性核酸对照.􀆰DHAV检测􀆰􀆰引物qDHAVF:TGGTCGAGTCCCATACACTATAA;qDHAVR:GCCACACTTTCCACTGCCCCTA;扩增长度bp.CqDHAVF

19、:TGGTCGAGTCCCATACACTATAA;qDHAVR:TCGGCACAGGATCCAATAATC;扩增长度bp.􀆰􀆰病料处理W以无菌术式收集病鸭的肝脏,或胚胎的肝脏、尿囊液.肝脏样品在组织研磨器中研磨成乳糜状,加PBS制成(/V)悬浮液.肝脏悬浮液或尿囊液经r/min离心min,取上清液备用.􀆰􀆰病毒核酸的抽提􀆰􀆰􀆰用RNA抽提试剂盒提取病毒的RNA.取L尿囊液或肝组织研磨上清液于一新的RNaseFree离心管中,加入L裂解液,剧烈振荡,室温下静置min.&#

20、1049008;􀆰􀆰随后加L氯仿,剧烈振荡s,室温下放置min.􀆰􀆰􀆰r/min离心min,取上清液,加入等体积的乙醇,混匀.将溶液转移到吸附柱中.􀆰􀆰􀆰r/min离心s,弃掉滤液(溶液较多的情况下,可多次进行).向吸附柱中加入L去蛋白溶液,r/min离心s,弃掉滤液.􀆰􀆰􀆰向吸附柱中加入L漂洗液,静置min,r/min离心s,弃掉滤液(重复次).􀆰􀆰Й

21、008;r/min离心min,弃掉滤液,室温静置数分钟,以彻底晾干漂洗液.􀆰􀆰􀆰将吸附柱转移到一个新的RNaseFree离心管中,加入LLRNaseFreeddHO,静置min.􀆰􀆰􀆰r/min,离心min,收集含RNA的滤液.获得的RNA溶液保存于或者直接用于qPCR.􀆰􀆰RTqPCR扩增􀆰􀆰􀆰取支􀆰mL的指形管,分别加入RNAL和qDHAV、qDHAV下游引物(mmol/NY/

22、TL)各L,混匀,先置加热min,再冰浴min.􀆰􀆰􀆰在上述混合液加入下列试剂,总体积为L:/a)dNTPMix(mmolL),L;ib)MMLVRTReactonBufer,L;c)MMLV反转录酶,􀆰L;d)RNase抑制剂,􀆰L;e)RNaseFreeddHO,L,混匀./q􀆰􀆰􀆰置反应h,在条件下灭活min,获得DHAV和DHAV的cDNA.􀆰􀆰􀆰取支􀆰mL的指形管,其中一

23、管加入DHAVcDNAL,qDHAV上下游引物各L(molL);另一管加入DHAVcDNAL,DHAV上下游引物各L(molL);再于每支指形管中加入SYBRGreenMasterMix预混液L和ddHOL,混匀.􀆰􀆰􀆰在荧光定量PCR仪中运行扩增:在预变性min;以变性s,退火s;运行个循环.􀆰􀆰􀆰溶解曲线程序为:s,s;以􀆰/s的速度,从升至,在维持s.􀆰􀆰结果判定􀆰􀆰􀆰阴性对

24、照无Ct值,无扩增曲线(见附录E中的E􀆰);阳性对照Ct值,扩增曲线拐点清楚,指数期明显(见E􀆰);溶解曲线呈单一峰(见E􀆰),判定试验成立.􀆰􀆰􀆰待检样品无Ct值,无扩增曲线,判定为DHAV或DHAV阴性.􀆰􀆰􀆰待检样品以qDHAVF:TGGTCGAGTCCCATACACTATAA;qDHAVR:GCCACACTTTCCACTGCCCCTA为引物,样品Ct值,有特定的扩增曲线,判定为DHAV阳性.􀆰𙧄

25、8;􀆰待检样品以qDHAVF:TGGTCGAGTCCCATACACTATAA;qDHAVR:CTCGGCACAGGATCCAATAATC为引物,样品Ct值,有特定的扩增曲线,判定为DHAV阳性.􀆰􀆰􀆰Ct值的样品需复检,重复后若无Ct值,判定为阴性;否则,判定为阳性.DHAV微量中和试验􀆰固定血清检测病毒􀆰􀆰病毒及血清􀆰􀆰􀆰待检DHAV病毒.􀆰􀆰􀆰DHAV阳性血清

26、.􀆰􀆰􀆰DHAV阴性血清.􀆰􀆰􀆰鸡血清.􀆰􀆰耗材孔细胞培养板.􀆰􀆰胚胎和细胞􀆰􀆰􀆰日龄或日龄DHAV抗体阴性鸭胚.􀆰􀆰􀆰DEL,按照附录B的规定制备.􀆰􀆰􀆰DEF,按照附录C的规定制备.􀆰􀆰􀆰DEEC,按

27、照附录D的规定制备.􀆰􀆰试剂􀆰􀆰􀆰DMEM培养基.􀆰􀆰􀆰营养液,按照附录A中A􀆰的规定配制.NY/T􀆰􀆰􀆰维持液,按照附录A中A􀆰的规定配制.􀆰􀆰病毒中和试验􀆰􀆰􀆰用DMEM培养基将待检病毒样品作倍比稀释,然后分别与等体积的阳性血清、阴性血清混合,作用min.𙧄

28、8;􀆰􀆰将病毒血清混合液转入已长成单层并已弃去营养液的DEL或DEF或DEEC孔板中,每孔L.加入含鸡血清的维持液,每孔L,每个稀释度重复孔.最后一列孔作为空白对照.􀆰􀆰􀆰将细胞板置于CO的细胞培养箱内继续培养dd,观察CPE.CPE特征为细胞变圆并坏死.按ReedMuench法计算病毒的TCID.􀆰􀆰结果判定􀆰􀆰􀆰空白对照孔未出现CPE,判定试验成立.􀆰􀆰􀆰阳性

29、血清试验组的TCID阴性血清试验组的TCID倍时,判定待检样品为DHAV阳性.􀆰固定病毒检测血清􀆰􀆰病毒及血清􀆰􀆰􀆰DHAV.􀆰􀆰􀆰DHAV阳性血清.􀆰􀆰􀆰DHAV阴性血清.􀆰􀆰􀆰待检血清.􀆰􀆰􀆰鸡血清.􀆰􀆰胚胎和细胞􀆰&

30、#1049008;􀆰日龄或日龄DHAV抗体阴性鸭胚.􀆰􀆰􀆰DEL,按照附录B的规定制备.􀆰􀆰􀆰DEF,按照附录C的规定制备.􀆰􀆰􀆰DEEC,按照附录D的规定制备.􀆰􀆰耗材孔细胞培养板.􀆰􀆰试剂􀆰􀆰􀆰DMEM培养基.􀆰􀆰􀆰营养液,按照附录A中

31、A􀆰的规定配制.􀆰􀆰􀆰维持液,按照附录A中A􀆰的规定配制.􀆰􀆰病毒TCID的滴定􀆰􀆰􀆰用DMEM培养基将DHAV病毒作倍比稀释,取适宜稀释度病毒液接种于已弃去培养液并长满DEL或DEF或DEEC细胞的孔板中,每孔L,每个稀释度重复孔.最后一列的孔作为空白对照.􀆰􀆰􀆰将细胞板置于作用h,然后加入含鸡血清的细胞维持液,每孔L.将细胞板置于CO培养箱内继续培养dd,按R

32、eedMuench法计算病毒的TCID.􀆰􀆰血清中和试验􀆰􀆰􀆰将待测血清样品置于水浴锅内灭活min,然后用DMEM培养基将其作倍系列稀释.􀆰􀆰􀆰将系列稀释的血清样品、DHAV阳性血清、阴性血清分别与等体积TCIDDHAV病毒混合,作用min.􀆰􀆰􀆰将病毒与血清的混合液转入到已长成单层并已弃去营养液的DEL或DEF或DEEC孔板中,每孔L,同时加入含鸡血清的维持液,每孔L.每个稀释度的血清样品重复孔,

33、阳性、阴NY/T性和空白对照各设置孔.􀆰􀆰􀆰将细胞板置于CO的细胞培养箱内继续培养d,观察CPE.􀆰􀆰结果判定􀆰􀆰􀆰阳性和空白对照孔未出现CPE,而阴性对照孔出现CPE,判定试验成立.􀆰􀆰􀆰血清的中和效价为完全抑制细胞发生病变的最高血清稀释度.抗体中和效价的血清判定为DHAV中和抗体阳性.􀆰􀆰􀆰抗体中和效价的血清判定为DHAV中和抗体阴性.胚胎中

34、和试验检测DHAV或DHAV中和抗体􀆰仪器设备􀆰􀆰冷冻台式离心机.􀆰􀆰恒温培养箱.􀆰􀆰mL注射器及针头.􀆰病毒及血清􀆰􀆰DHAV.􀆰􀆰DHAV.􀆰􀆰DHAV阳性血清.􀆰􀆰DHAV阴性血清.􀆰􀆰DHAV阳性血清.􀆰􀆰DHAV阴性血清.

35、49008;􀆰待检血清.􀆰胚胎􀆰􀆰日龄日龄SPF鸡胚.􀆰􀆰日龄日龄DHAV或DHAV抗体阴性鸭胚.􀆰试剂􀆰􀆰PBS溶液,按照附录A中A􀆰的规定配制.􀆰􀆰青霉素.􀆰􀆰链霉素.􀆰中和试验􀆰􀆰以pH􀆰􀆰的PBS溶液将青霉素和链霉素分别稀释至IU/mL和g/mL.&

36、#1049008;􀆰将DHAV或DHAV病毒液按的体积比与青霉素和链霉素混合,备用.􀆰􀆰将DHAV与等体积的待检血清、DHAV阳性血清、DHAV阴性血清混合,置于温箱中作用min.􀆰􀆰或将DHAV与等体积的待检血清、DHAV阳性血清、DHAV阴性血清混合,置于温箱中作用min.􀆰􀆰以每枚胚􀆰mL病毒血清混合液经尿囊腔接种日龄日龄SPF鸡胚或日龄日龄的非免疫鸭胚,每个样品接种枚枚胚.于恒温培养箱中孵育.􀆰􀆰弃去接种后h

37、内死亡的胚胎.h后每间隔h观察胚胎的死亡情况,收集hh死亡的胚胎,放入冰箱中静置hh,待胚胎血管收缩,进行剖检.􀆰结果判定􀆰􀆰阳性血清对照组的胚胎未发生死亡,胚体无病变;而阴性血清对照组胚胎发生死亡,胚胎发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢部水肿.胚肝呈黄红色、肿胀并可能有坏死灶,判定试验成立.NY/T􀆰􀆰在DHAV与待检血清混合的试验组中,如未发生胚胎死亡,胚体无病变,判定为待检测血清DHAV抗体阳性.􀆰􀆰在DHAV与待检血清混合的试验组中,如胚胎发生死亡,胚胎发育迟滞

38、、全身皮下出血、腹部和后肢部水肿,胚肝呈黄红色、肿胀并可能有坏死灶,判定为待检测血清DHAV抗体阴性.􀆰􀆰在DHAV与待检血清混合的试验组中,如未发生胚胎死亡,胚体无病变,判定为待检测血清DHAV抗体阳性.􀆰􀆰在DHAV与待检血清混合的试验组中,如胚胎发生死亡,胚胎发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢部水肿,胚肝呈黄红色、肿胀并可能有坏死灶,判定为待检测血清DHAV抗体阴性.综合判定􀆰凡具有􀆰临床症状和􀆰病理变化,并且RTPCR后约bp处有一条特异的DNA条带,判定为鸭甲

39、型病毒性肝炎型.q􀆰凡具有􀆰临床症状和􀆰病理变化,微量中和试验病毒阳性,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.􀆰凡具有􀆰临床症状、􀆰病理变化,待检样品以qDHAVF:TGGTCGAGTCCCATACACTATAA,DHAVR:GCCACACTTTCCACTGCCCCTA为引物,样品Ct值,有特定的扩增曲线,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.􀆰凡具有􀆰临床症状、􀆰病理变化,并且RTPCR后bp处有一条特异的DNA条带,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.Cq

40、49008;凡具有􀆰的临床症状、􀆰病理变化,待检样品以qDHAVF:TGGTCGAGTCCCATACACTATAA,DHAVR:TCGGCACAGGATCCAATAATC为引物,样品Ct值,有特定的扩增曲线,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.􀆰凡满足􀆰􀆰􀆰或􀆰􀆰的条件,判定为DHAV中和抗体阳性.􀆰凡满足􀆰􀆰􀆰或􀆰􀆰的条件,判定为DHAV中和抗体阴性.&

41、#1049008;凡满足􀆰􀆰的条件,判定为DHAV中和抗体阳性.􀆰凡满足􀆰􀆰的条件,判定为DHAV中和抗体阴性.NY/T附录A(规范性)试剂配制方法A􀆰PBS缓冲液配制pH􀆰PBS缓冲液所需试剂如下:a)􀆰g的氯化钾;b)􀆰g的氯化钠;c)􀆰g的磷酸二氢钾;d)􀆰g的十二水合磷酸氢二钠.以上试剂均为分析纯,溶解于适量双蒸水中,调pH至􀆰􀆰,用双蒸水定容至mL,保存

42、.A􀆰营养液在mL的DMEM培养基中加入mL胎牛血清,再加青霉素至终浓度IU/mL.以NaHCO调pH至􀆰􀆰.A􀆰维持液在mL的DMEM培养基中加入mL胎牛血清,再加青霉素至终浓度IU/mL.以NaHCO调pH至􀆰􀆰.NY/T附录B(规范性)(鸭胚肝细胞DEL)的制备B􀆰将日龄的鸭胚放入超净台内,气室朝上,先用碘酊消毒气室部位,后用酒精棉脱碘;敲开气室部的蛋壳,撕开蛋壳膜、尿囊膜及羊膜,用镊子轻轻取出鸭胚,放入无菌的平皿中.取出肝脏,弃胆囊,用PBS缓冲液清洗次.B&#

43、1049008;将肝脏转移到无菌的小烧杯中,剪碎;然后,用PBS缓冲液清洗次.向肝脏碎片中加入􀆰胰酶(胰酶的量为组织块的倍倍),然后置于水浴中minmin.B􀆰弃掉胰酶,用DMEM清洗次,再用mLDMEM吹散组织块;然后,用层无菌纱布或细胞筛过滤.B􀆰过滤后的细胞悬液r/min离心min,弃掉上清液.加少量DMEM培养液,轻轻吹散底部的细胞沉淀.B􀆰用计数板进行细胞计数,计数后的细胞按个/mL用DMEM培养液进行稀释.转入细胞瓶或细胞培养板中,放入􀆰CO培养箱中进行培养.NY/T附录C(规范性)(鸭胚成纤

44、维细胞DEF)的制备C􀆰将日龄的鸭胚放入超净台内,气室朝上,先用碘酊消毒气室部位,后用酒精棉脱碘;敲开气室部的蛋壳,撕开蛋壳膜、尿囊膜及羊膜,用镊子轻轻取出鸭胚,放入无菌的平皿中.剪除头、四肢、内脏,用PBS缓冲液清洗次.C􀆰将胚的胴体转移到无菌的小烧杯中,剪碎,然后用PBS缓冲液清洗次.向胴体碎片中加入􀆰胰酶(胰酶的量为组织块的倍倍),然后置于水浴中minmin.C􀆰弃掉胰酶,用DMEM清洗次,再用mLDMEM吹散组织块;然后,用层无菌纱布或细胞筛过滤.C􀆰过滤后的细胞悬液r/min离心min,弃掉上清

45、液.加少量DMEM培养液,轻轻吹散底部的细胞沉淀.C􀆰用计数板进行细胞计数,计数后的细胞按个/mL用DMEM培养液进行稀释.转入细胞瓶或细胞培养板中,放入􀆰CO培养箱中进行培养.NY/T附录D(规范性)(鸭胚上皮细胞系DEEC)的制备DD􀆰将长满DEEC的细胞培养瓶中的培养液弃去,加入无菌的PBS缓冲液轻摇s,弃去上清液.􀆰加入mL在预热的EDTA胰酶,温和地摇动细胞瓶min,使EDTA胰酶均匀分布在整个细胞薄层,然后用移液管吸去EDTA胰酶.DD􀆰重新加入mLEDTA胰酶使其分布在整个细胞薄层,于孵育细

46、胞直至细胞从培养瓶表面分离(minmin),必要时摇动或吹打使细胞充分分离,然后加入mL胎牛血清灭活残余的胰酶.􀆰加入mL配置好的含有L谷氨酰胺和胎牛血清的DDMEM培养液,轻轻用移液管吹散细胞团.D,􀆰每个T培养瓶中加入mL个/mL细胞悬液,于CO培养箱里培养细胞dd即可生长单层细胞.D􀆰细胞冻存步骤:常规方法冻存,按配冻存液,即份甘油、份血清和份培养基.NY/T附录E(资料性)荧光定量PCR曲线图E􀆰荧光定量PCR阴性扩增曲线见图E􀆰.E图􀆰荧光定量PCR阴性扩增曲线图E􀆰荧光定量PCR阳性扩增曲线见图E􀆰.E图􀆰荧光定量PCR阳性扩增曲线图E􀆰荧光定量PCR溶解曲线见图E􀆰.NY/TE图􀆰荧光定量PCR溶解曲线图