【高中生物】基因工程的基本操作程序第1课时课 2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、第三章第三章 基因工程基因工程第第2 2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序抗虫棉的培育过程抗虫棉的培育过程基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定操作操作程序程序0101040403030202目的基因的目的基因的筛选与获取筛选与获取01目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取目的基因目的基因（1 1）概念）概念用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主主要指的是编码蛋白质的基因要指的是编码蛋白质的基因（2 2）常见类型）常见类型 与生物抗逆性

2、相关基因与生物抗逆性相关基因 优良品质相关基因优良品质相关基因 生产药物相关基因生产药物相关基因 毒物降解相关基因毒物降解相关基因 工业用酶相关基因工业用酶相关基因 如何筛选目的基因？如何筛选目的基因？目的基因的筛选目的基因的筛选（1 1）方法）方法从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选（2 2）实例）实例用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史用于防治棉花虫害已有多年历史掌握了掌握了Bt基因的序列信息基因的序列信息Bt基因基因是培育转基因抗虫是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因棉较为合适的目的基因B

3、t基因的表达产物基因的表达产物-Bt抗抗虫蛋白虫蛋白在起作用在起作用苏云金杆苏云金杆菌的杀虫菌的杀虫作用与作用与Bt基因有关基因有关目的基因的获取目的基因的获取（1 1）从从基因文库基因文库中获取中获取（2 2）通过）通过DNADNA合成仪合成仪直接合成直接合成（3 3）利用）利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因基因组文库部分基因文库（主要是cDNA文库）基因文库与载体连接与载体连接导入导入受体菌群受体菌群限制酶切割限制酶切割提取某生物提取某生物全部全部DNADNA许多许多DNADNA片段片段该生物基因组文库该生物基因组文库mRNA 逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶

4、H H单链单链DNADNADNADNA聚合酶聚合酶双链双链cDNAcDNA与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物该生物cDNAcDNA文库文库基因组文库中的基因含有基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子启动子、终止子、内含子cDNAcDNA文库中的基因文库中的基因不含不含以上结构以上结构人工合成目的基因人工合成目的基因（1 1）前提）前提（2 2）方法）方法基因比较小、核苷酸序列已知基因比较小、核苷酸序列已知通过通过DNADNA合成仪合成仪用化学方法直接合成目的基因用化学方法直接合成目的基因利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因（1 1）PCRPCR的概念的

5、概念PCRPCR是一项根据是一项根据DNADNA半保留复制半保留复制的原理，通过在的原理，通过在体外体外提供提供参与参与DNADNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术序列进行大量复制的技术全称：全称：原理：原理：操作环境：操作环境：目的：目的：优点：优点：聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNADNA半保留复制半保留复制体外（体外（PCRPCR扩增仪扩增仪/PCR/PCR仪）仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因可以在短时间内大量扩增目的基因DNADNA在体内的

6、半保留复制在体内的半保留复制 条件：条件：模板模板 、原料、能量、酶、原料、能量、酶 模板：模板：DNADNA的两条链（母链）的两条链（母链）原料：四种游离的脱氧核苷酸原料：四种游离的脱氧核苷酸 能量：一般由能量：一般由ATPATP水解供能水解供能 酶：解旋酶、酶：解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶 特点：半保留复制、边解旋边复制特点：半保留复制、边解旋边复制（2 2）PCRPCR的前提的前提 一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列（3 3）PCRPCR的原料的原料 模板模板DNA DNADNA DNA引物引物 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚

7、合酶 缓冲液缓冲液（4 4）PCRPCR的特点的特点 以指数方式扩增以指数方式扩增引物设计原则：引物设计原则：1 1、长度适当（、长度适当（20-30bp20-30bp）2 2、引物内部不发生碱基互补配对、引物内部不发生碱基互补配对 3 3、引物之间不发生碱基互补配对、引物之间不发生碱基互补配对（5 5）PCRPCR反应的过程反应的过程DNA解链为单链引物结合到互补DNA链Taq酶从引物起始进行子链的合成扩增次数扩增次数第第1 1次次第第2 2次次第第3 3次次第第4 4次次第第n n次次DNADNA总数总数2 21 12 22 22 23 32 24 42 2n n长长-中链中链DNADNA

8、中中-短链短链DNADNA短短-短短DNADNA含引物含引物A(A(或或B)B)的的DNADNA共消耗的共消耗的引物数量引物数量2 22 22 22 22 20 02 24 46 62n-22n-20 00 02 28 82 2n n-2n-2n1 13 37 715152 2n n-1-12 26 6141430302 2n+1 n+1-2-2（5 5）对）对PCRPCR产物进行鉴定产物进行鉴定琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DNADNA分子具有可解离的基团，在一定的分子具有可解离的基团，在一定的pHpH下，这些基团可下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子以带上正电荷或

9、负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳比较项目比较项目PCRPCR细胞核内细胞核内DNADNA复制复制场所场所细胞外细胞外(主要在主要在PCRPCR扩增仪内扩增仪内)主要在细胞核内主要在细胞核内方式方式半保留全连续局部区域复制半保留全连续局部区域复制半保留半不连续全链复制半保留半不连续全链复制起始位点起始位点引物引物33端端复制起始位点复制起始位点酶酶仅一种仅一种DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等聚合酶等反应条件反应条件温度变幅大温度变幅大 温和温和解

10、旋解旋DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶解旋解旋酶解旋引物引物DNADNA片段，保留在复制的子链中片段，保留在复制的子链中RNARNA片段，不保留在复制的子链中片段，不保留在复制的子链中产物产物扩增特定的扩增特定的DNADNA片段或基因片段或基因合成整个合成整个DNADNA分子分子循环次数循环次数PCRPCR一般要经历一般要经历3030次循环次循环与细胞分裂同步与细胞分裂同步联系联系模板模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板均需要脱氧核苷酸双链作为模板原料原料:均为四种脱氧核苷酸均为四种脱氧核苷酸（dATPdATP、dTTPdTTP、dGTPdGTP、dCTPdCTP）酶酶:均需均

11、需DNADNA聚合酶聚合酶引物引物:都需要引物，使都需要引物，使DNADNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成聚合酶从引物开始进行互补链的合成02基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因的结构基因的结构（1 1）原核生物基因）原核生物基因非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子编码区编码区终止子终止子非编码区位置：编码区非编码区位置：编码区上游上游与编码区与编码区下游下游非编码区功能：非编码区功能：不能编码不能编码蛋白质，蛋白质，调控调控遗传信息的表达遗传信息的表达启动子：启动子：RNARNA聚合酶结合位点，转录起始的信号聚合酶结合位点，转录起始的信号终止子：终止终止子：终止RNARNA的合

12、成的合成编码区：编码蛋白质的合成编码区：编码蛋白质的合成12345启动子启动子终止子终止子（2 2）真核生物基因）真核生物基因不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列 =内含子内含子 +非编码区序列非编码区序列编码序列编码序列 =外显子外显子前体前体mRNA mRNA、mRNAmRNA为什么不直接将目的基因导入受体细胞？为什么不直接将目的基因导入受体细胞？游离的游离的DNADNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解；就算可片段进入受体细胞，一般会直接被分解；就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNADNA片段也无法随着细片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细

13、胞不再含有目的基因胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因 将基因送入受体细胞中并能够复制将基因送入受体细胞中并能够复制 使目的基因在受体细胞内能够表达和发挥作用使目的基因在受体细胞内能够表达和发挥作用构建基因表达载体的构建基因表达载体的目的：目的：用于构建基因表达载体的质粒（人工改造）用于构建基因表达载体的质粒（人工改造）有时为了满足应用需要，有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑存在时，可以激活或抑制目的基因的表达制目的基因的表达基因表达载体的相关组件基因表达载体的相关组件 复制原点复制原点 启动子启动

14、子 终止子终止子 标记基因标记基因 目的基因目的基因基因表达载体基因表达载体载体载体控制特定性状或表达特定产物控制特定性状或表达特定产物功能：它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止目的基因启动子位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA（基因转录的开始）终止子位置：基因的下游标记基因：检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。(一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因)复制原点：DNA聚合酶结合位点，使目的基因复制和传递是一段有特殊序列结构的DNA片段是一段有特殊序列结构的DNA片段启动子启动子

15、、终止子和起始密码子、终止密码子的区别终止子和起始密码子、终止密码子的区别起始（终止）密码子起始（终止）密码子启动（终止）子启动（终止）子本质本质三个相邻碱基三个相邻碱基DNADNA片段片段位置位置位于位于RNARNA上上位于位于DNADNA上上作用作用启动（终止）翻译启动（终止）翻译启动（终止）转录启动（终止）转录基因表达载体构建的过程基因表达载体构建的过程载体载体目的基因目的基因自连自连片段间片段间的连接的连接目的基因自连目的基因自连质粒自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接质粒与质粒连接正向连接正向连接 反向连接反向连接1 1112 2221 12 222112 2111 122使用一种使用一种DNADNA限制酶进行切割，后续连接情况限制酶进行切割，后续连接情况单酶切缺点单酶切缺点 质粒重新环化质粒重新环化 目的基因自身环化目的基因自身环化 质粒与目的基因反向连接质粒与目的基因反向连接双酶切的优点双酶切的优点 防止质粒重新环化防止质粒重新环化 防止质粒与目的基因反向连接防止质粒与目的基因反向连接 防止目的基因自身环化防止目的基因自身环化PstPst 和和 EcoEcoRR课后作业：课后作业：1 1、记背相关知识点、记背相关知识点2 2、课时练大本、课时练大本3 3、课时练小本、课时练小本