分子生物学知识拓展 (9).pdf

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1、2021 年 8 月第 46 卷第 15 期Vol.46，No.15August，2021收稿日期2021-04-12 基金项目国家自然科学基金项目(81573725，81774034);安徽省高校自然科学研究项目(KJ2019A0476);安徽省高校优秀青年人才支持计划项目(gxyqZD2018054，gxyq2019030);安徽中医药大学重点学科建设项目(DC18100042);安徽中医药大学自然科学基金重点项目(2020zrzd02)通信作者*汪长中，教授，博士生导师，E-mail:ahwcz63 sinacom作者简介马克龙，副教授，研究方向为炎症性肠病的中医药治疗，E-mail:m

2、akelong210 126com基于高通量转录组测序研究三黄汤缓解白念珠菌定植下 DSS 诱导小鼠溃疡性结肠炎的作用机制 摘要 利用高通量转录组测序技术探讨三黄汤(Sanhuang Decoction，SHD)治疗白念珠菌(Candida albicans，Ca)定植小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)的作用机制。采用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)联合 Ca 灌胃方式构建 Ca 定植下 DSS 诱导的小鼠 UC 模型，并予以 SHD 灌肠治疗;观察小鼠一般状态、疾病活动指数(disease activity index，DAI)

3、、结肠长度和结肠黏膜损伤指数(colon mucosa damage index，CMDI)变化;HE 染色法进行组织病理学分析;平板培养法检测小鼠肠道 Ca载荷;ELISA 法检测小鼠血清抗酿酒酵母抗体(anti-saccharomces cerevisiae antibody，ASCA)和-1，3-葡聚糖的含量，以及血清和肠组织 TNF-、IL-1 和 IL-6 表达水平;高通量转录组测序技术分析对照组、模型组和三黄汤组的差异表达基因，并对差异表达基因进行 GO 和 KEGG pathway 富集分析;qRT-PCR 和 Western blot 检测差异基因显著富集的 NOD 样信号通路

4、相关基因 NL-RP3、ASC、caspase-1 和 IL-1 的表达水平。结果显示，SHD 灌肠治疗可改善 UC 小鼠的一般状态，降低 DAI 评分;SHD 能减少肠道 Ca 载荷，减轻肠道充血、糜烂和结肠缩短程度，并且降低血清-1，3-葡聚糖含量，下调血清和肠道组织 TNF-、IL-1 和IL-6 水平;SHD 组 vs 模型组有 383 个差异表达基因，显著富集于免疫系统过程、细菌防御反应和固有免疫反应等生物学过程，KEGG pathway 分析提示差异基因显著富集于 NOD 样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和视黄醇代谢等信号通路;SHD 下调 UC 小鼠结肠组织 NLR

5、P3、caspase-1 和 IL-1 的 mRNA 和蛋白表达水平。以上结果表明，SHD 可缓解 Ca 定植的小鼠 UC，其作用机制可能与其对 NOD 样受体信号通路调控有关。关键词 三黄汤;溃疡性结肠炎;白念珠菌;转录组测序;NOD 样受体信号通路Mechanism of Sanhuang Decoction in alleviating dextran sulfate sodiuminduced ulcerative colitis in mice with Candida albicans colonization:based on high-throughput transcript

6、ome sequencingMA Ke-long1，2，3，4，HAN Zhi-jun1，SUN Juan1，2，4，TAN Xiao-fen1，WANG Tian-ming1，2，4，SHAO Jing1，2，4，YAN Gui-ming1，2，4，WANG Chang-zhong1，2，4*(1 College of Integrated Chinese and Western Medicine/College of Life Science，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230012，China;2 Institute of Int

7、egrated Chinese and Western Medicine，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei230012，China;3 Anhui Province Key Laboratory of Traditional Chinese Medicinal Decoction Pieces of New ManufacturingTechnology，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230012，China;4 Key Laboratory of XinAn Medicine，Ministr

8、yof Education，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei 230012，China)51932021 年 8 月第 46 卷第 15 期Vol.46，No.15August，2021 Abstract This study explored the mechanism of Sanhuang Decoction(SHD)in treating dextran sulfate sodium(DSS)-induced ul-cerative colitis(UC)in mice with Candida albicans(Ca)colonizati

9、on via high-throughput transcriptome sequencing Specifically，theanimal model was established by oral administration of 3.0%DSS for 7 days followed by intragastrical administration of Ca suspensionat 1.0 108cells for 4 days and then the mice were treated with SHD enema for 7 days Afterwards，the gener

10、al signs were observedand the disease activity index(DAI)was recorded every day After mice were sacrificed，colon length and colon mucosa damage index(CMDI)were determined and the histomorphology was observed with the HE staining method The fungal loads of feces were detectedwith the plate method Ant

11、i-saccharomyces cerevisiae antibody(ASCA)and-1，3-glucan in serum，and TNF-，IL-1，and IL-6 inserum and colon were detected by ELISA High-throughput RNA sequencing method was adopted to identify transcriptome of colon tis-sues from the control，model and SHD(15.0 g kg1)groups Differentially expressed gen

12、es(DEGs)among groups were screened andthe GO and KEGG pathway enrichment analysis of the DEGs was performed The expression levels of NLRP3，ASC，caspase-1，andIL-1 genes related to the NOD-like receptor signaling pathway which involved 9 DEGs，were examined by qRT-PCR and Western blotThe results demonst

13、rated that SHD improved the general signs，decreased DAI and Ca loads of feaces，alleviated colon edema，erosion，and shortening，and lowered the content of-1，3-glucan in serum and TNF-，IL-1，and IL-6 in serum and colon tissues of miceTranscriptome sequencing revealed 383 DEGs between SHD and model groups

14、，which were mainly involved in the biological processesof immune system，response to bacterium，and innate immune response They were mainly enriched in the NOD-like signaling pathway，cytokine-cytokine interaction pathway，and retinol metabolism pathway Moreover，SHD down-regulated the mRNA and protein l

15、evels ofNLRP3，caspase-1，and IL-1 In a word，SHD ameliorates DSS-induced UC in mice colonized with Ca，which probably relates to itsregulation of NOD-like receptor signaling pathway Key wordsSanhuang Decoction;ulcerative colitis;Candida albicans;transcriptome sequencing;NOD-like receptor signalingpathw

16、ayDOI:10.19540/jcnkicjcmm20210521.701溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种主要累及结肠和直肠黏膜的慢性非特异性肠道炎症疾病，临床主要表现为反复发作的腹痛、腹泻和黏液脓血便1。UC 易复发，迁延难愈，预后较差，严重影响着患者的生活质量。近年来，UC 的发病率在东亚国家和地区呈快速上升的趋势，成为严重威胁我国人民健康的主要疾病2。UC 的病因复杂，与遗传、环境、免疫调节和肠道微生态等因素均有关。真菌作为肠道菌群一部分，在维持肠道菌群稳态和免疫调节中扮演重要的角色3。UC 患者肠黏膜损伤，加之患者免疫力低，真菌(如白念珠菌)过度增殖，其

17、抗原和代谢产物可激活免疫细胞释放细胞因子引发免疫应答和炎症反应，或干扰肠道菌群的组成和比例，导致肠道微生态失衡恶化，加重 UC 患者病情3-4。有报道指出，白念珠菌过度定植可加重实验性小鼠 UC 的炎症反应，抗真菌治疗可明显缓解 UC5-6。当前，用于 UC的治疗药物包括 5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫调节剂和生物制剂等，尽管上述药物对 UC 的临床缓解和促进黏膜愈合有一定程度的作用，但由于存在毒副作用和不良反应，这些药物仍不能满足 UC治疗要求7。中医学认为肠道湿热蕴结，气血凝滞，壅而生脓，腑气逆乱是 UC 发病的重要原因，湿热邪气和湿热的病原体在 UC 发病中占主要地位8。三黄汤由大黄、

18、黄芩、黄连组成，三者为金匮要略 泻心汤之主药，有泻火解毒，燥湿清热之功9-10。研究表明，三黄汤灌肠能明显缩小溃疡面积，抑制炎症因子释放，缓解 UC 病情9-12。课题组既往研究发现大黄、黄芩、黄连的提取物或单体药物对白念珠菌 Candi-da albicans(Ca)具有良好的抑制作用13-15。然而，三黄汤灌肠是否对白念珠菌定植的 UC 具有治疗作用，目前尚不清楚。转录组学是从整体水平上研究某一时间和空间特定细胞中全部基因转录本的种类、数量和结构，以及转录调控规律的学科，它为研究疾病不同发病阶段的分子机制和调控网络提供全新的手段，已成为医药学研究的热点16-18。本研究以白念珠菌定植的 U

19、C 小鼠为模型，通过灌肠给药的方式进行三黄汤干预治疗，分析三黄汤对 Ca 定植小鼠 UC 的治疗作用，并通过转录组测序探索其作用的分子机制，为三黄汤用于 UC 的治疗提供理论和实验依据。1材料SPF 级健康昆明小鼠，78 周龄，体质量 20256193马克龙等:基于高通量转录组测序研究三黄汤缓解白念珠菌定植下 DSS 诱导小鼠溃疡性结肠炎的作用机制g，购自安徽医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK(皖)2017-0001。白念珠菌 SC5314 标准株由海军军医大学姜远英教授惠赠。大黄、黄连和黄芩购自安徽中医药大学第一附属医院中药房;葡聚糖硫酸钠(S0948)购自美国 MPBiomedic

20、als 公司;柳氮磺胺吡啶(R023247)购自上海易恩化学技术有限公司;分析对照品黄芩苷(B20570)、巴马汀(B21433)、小檗碱(B21379)、大黄酸(B21181)和大黄素(B20240)购自上海源叶生物科技有限公司;ELISA 试剂盒 TNF-(ml002095)、IL-1(ml063132)和 IL-6(ml002283)购自上海酶联生物科技有限公司;抗酿酒酵母抗体(ASCA)(CK-E22252)购自福建睿信生物科技有限公司;-1，3-葡聚糖(F30161-B)购自上海科兴生物技术有限公司;定量 PCR 检测试剂盒(QPK-201)购自 Toyobo 公司;NLRP3(AF

21、7438)、IL-1(AF5103)和-actin(AF7018)抗体购自 Affinity 公司;caspase-1(sc-56036)抗体购自 Santa Cruz 生物技术公司;羊抗兔IgG/HRP 二抗(E-AB-1003)购自 Elabscience 公司。1290-6460 型超高液相色谱-串联质谱仪(美国Agilent);Dura 12 超纯水制造系统(美国 TheLab);DYY-6C 型电泳仪(北京六一生物科技有限公司);YD315 切片机(益迪医疗设备有限公司);TS-12A 生物组织自动脱水机和 BM-1X 组织包埋机(宏业医用仪器有限公司);5417 R 离心机(德国

22、Eppendorf);BX51 倒置光学显微镜(日本 Olympus);K3 型酶标仪(美国 ThermoFisher);ABI7500 荧光定量 PCR 仪(美国 Applied Biosystems);Biospectrum510 型凝胶成像系统(美国 UVP)。2方法2.1三黄汤灌肠液的制备称取黄芩 10 g、黄连10 g，加 10 倍量蒸馏水浸泡 30 min，加热煮沸 10min 后，转小火煮 40 min 后加大黄 10 g，继续煎煮10 min。过滤后，剩余药渣再加 8 倍量蒸馏水，煎煮方法同第 1 次，合并 2 次过滤液后进行浓缩，制备成1.25 g mL1的三黄汤水煎液，4

23、保存备用。2.2三黄汤主要成分检测根据三黄汤主要组成药物的指标成分，应用液相色谱-串联质谱法(LC-MS)检测三黄汤中黄芩、黄连和大黄的主要成分黄芩苷、巴马汀、小檗碱、大黄酸和大黄素的含量19。检测条件:Agilent C18色谱柱(2.1 mm100 mm，1.8m)，柱温 40，流速 0.3 mL min1，进样量 5 L。待测样品用甲醇稀释后上机检测。LC-MS 图谱(图1)以峰面积积分值为纵坐标，对照品质量浓度(ngmL1)为横坐标绘制标准曲线，回归方程:黄芩苷Y=150.95X 367.37，R2=0.999 0;小 檗 碱 Y=1 634.5X4 436.9，R2=0.999 1;

24、巴马汀 Y=5 027.9X21 413.9，R2=0.999 3;大黄素 Y=135.954X+92.729 4，R2=0.999 3;大 黄 酸 Y=1 763.7 X+18 698.5，R2=0.998 7。A对照品;B样品;C质谱。图 1三黄汤主要成分 LC-MS 图谱Fig1LC-MS profiles of main ingredients in Sanhuang Decoc-tion2.3白念珠菌悬液的配制用接种环轻轻挑取沙氏板白念珠菌，将其接种于装有液态沙氏培养基的500 mL 锥形瓶中，37 恒温培养箱中培养 12 h，离心、收集后将菌液浓度调整至 1.0109个/mL备用。

25、2.4动物分组与药物干预所有实验小鼠均在标71932021 年 8 月第 46 卷第 15 期Vol.46，No.15August，2021准环境条件(1825，60%70%湿度，12 h 光照和黑暗周期)下饲养，自由获取食物和无菌水。小鼠适应性饲养 1 周后，用 3.0%葡聚糖硫酸钠(dex-tran sulfate sodium，DSS)溶液自由饮用联合 Ca 灌胃的方法构建 Ca 定植的小鼠 UC 模型20。小鼠自由饮用 3.0%DSS 溶液，连续 7 d，然后每只小鼠每天给予100 L 含1.0108个白念珠菌 PBS 悬液灌胃，连续 4 d。对照组给予饮用水和 PBS 灌胃对照处理。

26、模型建成后，小鼠分为 5 组:模型组、三黄汤低剂量组、三黄汤中剂量组、三黄汤高剂量组和柳氮磺胺吡啶(SASP)组，每组 10 只。三黄汤(SHD)组和SASP 组于实验的第 12 天开始分别给予三黄汤(3.75、7.50、15.0 g kg1)和 SASP(0.72 gkg1)灌肠治疗，连续7 d。灌肠给药前药物预热至 37，采用灌肠器由肛门插入约 4 cm，然后注入灌肠液 0.2mL，留置 20 s 后拔出灌肠器，将小鼠倒置 1 min21。对照组和模型组给予生理盐水对照处理。2.5一般体征观察和疾病活动指数(disease activi-ty index，DAI)评分每日观察小鼠的精神、活

27、动、饮食、毛发光泽和肛门等一般情况，记录小鼠的体质量和大便性状，进行大便隐血检测。综合小鼠体质量、大便性状和便血情况，按照既往研究方法对小鼠DAI 进行评分20。2.6结肠病理形态学观察及结肠黏膜损伤指数(colon mucosa damage index，CMDI)评分小鼠麻醉，摘眼球取血，离心获取血清。麻醉后采用颈椎脱臼人道处死小鼠，取小鼠结肠，测量长度后剪开结肠，观察结肠水肿、糜烂和溃疡等损伤情况，并按照既往研究方法对结肠黏膜损伤指数进行评分20。一部分结肠迅速置于液氮中进行转录组测序，一部分结肠多聚甲醛固定，石蜡包埋后进行 HE 染色，显微镜下观察结肠病理学变化。剩余结肠组织80 冰箱

28、保存，用于后续实验。2.7肠道白念珠菌载荷评估白念珠菌灌胃后每天收集小鼠的粪便，干燥、称重后重悬于预冷 PBS，将重悬液涂布于含科玛嘉的固体培养基上，37 恒温培养 48 h，对平板上白念珠菌微菌落的数量进行计数，以每毫克样品的集落形成单位(CFUmg1)表示。2.8血清 ASCA 和-1，3-葡聚糖的含量测定取各组小鼠的血清，根据试剂盒检测方法测定各组小鼠血清中的 ASCA 和-1，3-葡聚糖的含量。2.9ELISA 检测血清和组织中 TNF-、IL-1、IL-6的含量取各组小鼠的血清，按照 ELISA 试剂盒说明书检测 TNF-、IL-1、IL-6 的含量。取小鼠结肠组织，称重后制备匀浆液

29、，离心收集上清液，用ELISA 法检测上述细胞因子含量。2.10转录组测序与数据分析从对照组、模型组和三黄汤高剂量组中，每组随机取 3 只小鼠的结肠组织，采用 TRIzol 裂解液提取结肠组织总 RNA。用带有 Oligo(dT)的磁珠富集有 polyA 尾的 mRNA，加入打断试剂，高温条件下使其片断化，逆转录合成cDNA。然后纯化回收、黏性末端修复、PCR 扩增构建文库，质检合格后于 DNBSEQ 平台测序。文库构建和测序均由华大基因(深圳，中国)完成。测序所得的原始读段(raw reads)经质控后，使用 SOAPnuke软件过滤去掉低质量的序列后得到高质量的洁净读段(clean rea

30、ds)。使用 Bowtie2 将 clean reads 比对到参考基因组序列(GCF_000 001 635.26_GRCm38p6)，使用 RSEM 计算各个样品的基因表达水平，并用 DEseq2 方法进行差异基因分析22-23，根据差异基因检测结果，对候选基因进行 GO 和 KEGG Path-way 富集分析。2.11实时定量 PCR 检测按照 RNA 抽提试剂盒抽提结肠组织总 RNA，紫外法对 RNA 进行定量(A260/A2801.8)。用 PrimeScriptTMRT 反应体系逆转录成 cDNA，Primer Premier 5.0 软件设计候选基因 PCR 引物(表 1)。m

31、RNA 定量检测用 SYBRGreen Real-time PCR Master Mix 试剂盒，以 GAP-DH 为内参基因，用 2Ct方法计算 mRNA 相对表达量。表 1定量 PCR 引物Table 1Primers for qRT-PCR基因序列(5-3)产物长度/bpNLRP3F:CATGGCTGTGTGGATCTTTGR:CAGCAAACCCATCCACTCTT151ASCF:TGGAGTCGTATGGCTTGGAGR:GCTGGTCCACAAAGTGTCCT165caspase-1F:ACAAGGCACGGGACCTATGR:TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG237IL-

32、1F:GAAATGCCACCTTTTGACAGTGR:TGGATGCTCTCATCAGGACAG116GAPDHF:AGGTCGGTGTGAACGGATTTGR:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA1238193马克龙等:基于高通量转录组测序研究三黄汤缓解白念珠菌定植下 DSS 诱导小鼠溃疡性结肠炎的作用机制2.12Western blot采用组织蛋白提取试剂盒提取蛋白样品。BCA 法定量后，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭后 PBST 漂洗，加 NLRP3(1 500)、caspase-1(11 000)、IL-1(11 000)和-actin(15 000)抗体，4 孵育过

33、夜。后加 1 1 000 稀释后的 HRP 标记的二抗室温孵育 2 h，PBST 漂洗后ECL 化学发光液显色，凝胶成像系统成像并进行灰度值分析。2.13统计学分析实验数据用 SPSS 23.0 软件进行统计学分析，连续性变量用 珋xs 表示。组间比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析和 LSD 检验(方差不齐时用 Dunnetts T3 检验)。P0.05 为差异有统计学意义。3结果3.1三黄汤主要成分含量LC-MS 检测三黄汤中黄芩主要成分黄芩苷，黄连主要成分小檗碱和巴马汀，大黄成分大黄素和大黄酸的含量。结果显示三黄汤灌肠液中含黄芩苷 3.731 gmL1，小檗碱0.653

34、gmL1，巴马汀 0.262 gmL1，大黄素0.027 g mL1，大黄酸 0.011 g mL1。3.2三黄汤对白念珠菌定植 UC 小鼠一般状况和DAI 的影响对照组小鼠的饮食正常，反应灵敏，活动度好，毛发整齐有光泽，无腹泻和血便，大便隐血实验阴性。模型组小鼠精神萎靡，毛发干枯，体质量减轻，伴有腹泻和血便，DAI 高于对照组(P0.01)。SHD 灌肠后，小鼠腹泻和便血的症状减轻;治疗的第 5 天(实验第 16 天)，SHD 高剂量组小鼠的 DAI评分与同时间点的模型组相比有差异(P0.05);治疗的第 7 天(实验第 18 天)，SHD 中剂量组的 DAI评分也低于同时间点的模型组(P0

35、.05)(表 2)。表 2三黄汤对 Ca 定植的 UC 小鼠 DAI 的影响(珋xs，n=10)Table 2Effect of Sanhuang Decoction on DAI of UC mice with Ca colonization(珋xs，n=10)组别剂量/g kg1DAI 评分第 12 天第 14 天第 16 天第 18 天对照0000模型3.200.792)3.400.692)3.600.522)3.500.712)三黄汤3.753.300.823.100.993.200.793.100.747.502.900.742.600.842.400.972.200.923)15.

36、03.400.702.801.232.300.953)2.200.783)SASP0.7203.100.742.701.062.200.923)2.100.993)注:与对照组比较1)P0.05，2)P0.01;与模型组比较3)P0.05，4)P0.01(表 37，图 6、7 同)。3.3三黄汤对白念珠菌定植 UC 小鼠结肠长度、结肠黏膜损伤和组织病理学影响与对照组相比，模型组小鼠的结肠明显缩短(P0.05)，而 SHD 高剂量组和 SASP 组的结肠长度大于模型组(P0.05)，SHD 中、高剂量组与 SASP 组小鼠的结肠长度无明显差异。模型组小鼠的结肠黏膜充血水肿，基底部有炎症细胞浸润，

37、杯状细胞减少，伴有黏膜糜烂，隐窝结构改变，CMDI 评分升高，与对照组有差异(P0.05);SHD 高剂量组炎性细胞浸润减少，隐窝扭曲有明显改善，CMDI 评分降低，与模型组相比有差异(P0.05)(表 3，图 2)。3.4三黄汤对白念珠菌定植 UC 小鼠肠道白念珠菌载荷的影响Ca 灌胃后，每天收集小鼠粪便，直至三黄汤治疗结束。用平板培养法计数各组小鼠粪便中的白念珠菌数。Ca 在小鼠肠道自然定植的量表 3三黄汤对 Ca 定植的 UC 小鼠结肠长度和 CMDI 的影响(珋xs，n=10)Table 3Effect of Sanhuang Decoction on colon length and

38、 CM-DI of UC mice with Ca colonization(珋xs，n=10)组别剂量/g kg1结肠长度/cmCMDI对照8.590.520.200.42模型7.200.831)3.000.821)三黄汤3.757.550.532.800.797.507.570.762.400.8415.07.830.833)2.300.673)SASP0.7207.820.533)2.200.793)很少，模型组的 CFU 明显高于对照组(P0.01)。在治疗的第 2 天(实验第 13 天)，三黄汤高剂量组的白念珠菌的 CFU 低于模组(P0.05)(表 4)。91932021 年 8

39、月第 46 卷第 15 期Vol.46，No.15August，2021A对照组;B模型组;C三黄汤低剂量组;D三黄汤中剂量组;E三黄汤高剂量组;FSASP 组。图 2三黄汤对 Ca 定植的 UC 小鼠结肠组织形态学的影响(HE 染色，200)Fig2Effect of Sanhuang Decoction on the histomorphology ofUC mice with Ca colonization(HE staining，200)3.5三黄汤对白念珠菌定植 UC 小鼠血清-1，3-葡聚糖和 ASCA 含量的影响模型组小鼠血清中的-1，3-葡聚糖含量明显高于对照组(P0.01)，

40、三黄汤治疗后，-1，3-葡聚糖含量降低，三黄汤中、高剂量组与模型组相比有明显差异(P0.05)(表 5)。与对照组相比，模型组小鼠血清中 ASCA 含量升高(P0.05)(表 5)。3.6三黄汤对白念珠菌定植 UC 小鼠 TNF-、IL-1和 IL-6 表达水平的影响与对照组相比，模型组血清和结肠组织的 TNF-、IL-1 和 IL-6 的水平明显升高(P0.01)。与模型组相比，SHD 中、高剂量组血清 TNF-，高剂量组血清 IL-1 和 IL-6 显著降低(P0.05 或 P0.01)(表 6);与模型组相比，SHD表 4三黄汤对 UC 小鼠肠道白念珠菌载荷的影响(珋xs，n=10)Ta

41、ble 4Effect of Sanhuang Decoction on the colonic Candida albicans loads in UC mice(珋xs，n=10)组别剂量/g kg1lg CFU mg1第 11 天第 13 天第 15 天第 17 天对照0000模型5.141.212)4.080.732)2.430.652)1.990.432)三黄汤3.755.081.013.770.602.780.472.070.367.504.771.383.480.922.480.481.920.3115.04.881.023.360.703)2.650.401.860.19SAS

42、P0.7205.021.093.680.562.520.672.100.42表 5三黄汤对 Ca 定植 UC 小鼠血清 ASCA 和-1，3-葡聚糖含量的影响(珋xs，n=10)Table 5Effect of Sanhuang Decoction on the content of ASCAand-1，3-glucan in serum of UC mice with Ca colonization(珋xs，n=10)组别剂量/g kg1ASCA/ng mL1-1，3-葡聚糖/pg mL1对照4.681.7613.904.12模型10.862.841)50.107.902)三黄汤3.7511

43、.784.1046.810.077.509.242.6241.708.143)15.010.132.4542.208.503)SASP0.7209.572.8445.4010.28中、高剂量组结肠组织的 TNF-和 IL-1，以及高剂量组结肠组织的 IL-6 明显降低(P 0.05 或 P 0.01)(表 7)。3.7测序数据质量评估与比对分析使用 DNB-SEQ 平台完成对照组、模型组和三黄汤组(高剂量组)各 3 个随机结肠组织样品的转录组测序，平均表 6三黄汤对 Ca 定植的 UC 小鼠血清中 TNF-、IL-1 和IL-6 含量的影响(珋xs，n=10)Table 6Effect of

44、Sanhuang Decoction on the content of TNF-，IL-1，and IL-6 in serum of UC mice with Ca colonization(珋xs，n=10)pg mL1组别剂量/g kg1TNF-IL-1IL-6对照36.106.1727.308.8329.806.63模型213.6031.702)116.1018.102)74.3010.762)三黄汤3.75194.6032.16111.5014.6872.208.777.50166.6020.393)105.8013.1770.7011.9815.0159.8021.184)101.

45、8010.103)65.307.073)SASP0.720 149.9019.274)96.1010.444)63.707.203)获得的原始读段(raw reads)49.43106条，过滤后得到的平均洁净读段(clean reads)为 44.26106条，clean reads 的平均 Q20 在 97.30%以上，cleanreads 比率超过 88.80%，平均总比对率超过 92.07%，共 18 240 个基因(表 8)。转录组测序质量较高，可进行后续信息分析。0293马克龙等:基于高通量转录组测序研究三黄汤缓解白念珠菌定植下 DSS 诱导小鼠溃疡性结肠炎的作用机制表 7三黄汤对

46、Ca 定植的 UC 小鼠结肠组织中 TNF-、IL-1和 IL-6 含量的影响(珋xs，n=10)Table 7Effect of Sanhuang Decoction on the content of TNF-，IL-1，and IL-6 in colon tissues of UC mice with Ca coloni-zation(珋xs，n=10)pg mg1组别剂量/g kg1TNF-IL-1IL-6对照41.109.2131.205.6729.307.32模型298.6032.092)110.309.042)190.1117.992)三黄汤3.75275.8033.03102.

47、5010.06167.9013.447.50267.3026.603)100.28.553)162.8018.3815.0253.7036.874)99.5012.823)161.9011.483)SASP0.720 174.609.114)74.809.894)116.6014.164)3.8差异表达基因分析基于负二项分布原理的DEseq2 方法进行差异表达基因(differentially ex-pressed genes，DEGs)分析。差异表达基因的筛选标准为 FDR(false discovery rate)0.05 且 log2(foldchange)2。结果显示，模型组与对照组比

48、较，差异表达的基因有 332 个(上调 286 个，下调 46 个);SHD 组与模型组比较，差异表达的基因有 383 个(上调 47 个，下调 336 个)(图 3A)。与对照组相表 8转录组测序数据统计Table 8Statistics of transcriptome sequencing data样品rawreads/106cleanreads/106cleanbases/GbcleanreadsQ20cleanreadsratio/%totalmapping/%对照50.8345.156.7797.6488.8391.7949.0844.276.6497.3590.2091.9450

49、.8144.756.7397.4789.8691.34模型49.0843.976.6097.4889.5991.9850.8345.186.7897.4588.8792.1849.0844.926.7497.4491.5393.51三黄汤49.0844.136.6297.3989.9292.3947.0542.026.3097.7589.3091.7549.0843.936.5997.5689.5191.77比，在模型组下调，SHD 处理后上调的有 13 个基因，表达水平逆转显著的基因有 Ifi44 l、Apoa2、Rna-set2b、St8sia5 和 Trim12a 等。在模型组上调，SH

50、D处理后明显下调的有 219 个基因，逆转明显的基因有 Defa2、Gm7849、Slc5a12、Gm14851 和 Apoc3 等(图 3B)。由此可见，在 DSS 诱导的白念珠菌定植UC 小鼠的结肠组织内，众多基因表达发生了改变，而 SHD 可影响这些基因的表达水平。A 基因表达火山图;B 基因表达热图。图 3差异基因表达特征Fig3Expression of differentially expressed genes3.9差异表达基因的 GO 富集分析为了研究三黄汤干预对 Ca 定植的 UC 小鼠的分子机制，作者对差异表达基因进行 GO 功能富集分析。模型组与对照组的差异表达基因富集于