(138)--过氧化氢汽体对细菌芽孢与细菌繁殖体杀灭效果的比较.pdf

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1、【论 著】过氧化氢汽体对细菌芽孢与细菌繁殖体杀灭效果的比较摘要目的比较细菌芽孢与细菌繁殖体对过氧化氢汽体(VPHP)的抗力，为选择 VPHP 生物指示剂提供参考。方法采用载体定量杀菌实验方法，比较某过氧化氢汽体发生器发生的 VPHP 对两组常用消毒试验指标菌芽孢与金黄色葡萄球菌杀灭效果，以评价此两种细菌芽孢作为 VPHP 生物指示剂的可能性。结果该 VPHP 发生器在20 m3空间内运行 0.5 1.0 h，室内中心点过氧化氢浓度均值为 1 972 2 615 mg/m3;运行 1.5 2.5 h，室内中心点过氧化氢浓度均值为 2 474 1 070 mg/m3。启动该 VPHP 发生器运行2

2、.5 h(一周期)，对不锈钢载体上的金黄色葡萄球菌、枯草杆菌黑色变种芽孢、嗜热脂肪杆菌芽孢杀灭对数值分别为 2.32、4.18、5.00。结论该 VPHP 发生器在其设定的运行周期内，对金黄色葡萄球菌的杀灭效果明显低于两种细菌芽孢，提示仅以此两种细菌芽孢作为VPHP 生物指示剂存在局限性。关键词过氧化氢汽体;细菌芽孢;细菌繁殖体;生物指示剂中图分类号:187.2文献标识码:A文章编号:1001 7658(2014)08 0795 03COMPAISON OF KILLING EFFECT OF VAPO PHASE HYDOGEN PEOXIDE ONSPOES AND VEGETATIVE

3、BACTEIAWEI Lan fen，PAN Xie shang，ZHANG Lei，ZHAN Li，XU Ji，ZHU Yi fan(Zhejiang Provincial Center for Disease Prevention and Control，Hangzhou 310009，China)AbstractObjectiveTo compare the resistance of spores and vegetative bacteria against vapor phase hydrogen peroxide(VPHP)for the selection of its bio

4、logical indicator MethodsThe carrier quantitative germicidal test was applied forcomparison of killing effect of VPHP generated by a VPHP generator on two kinds of spores commonly used as test indica-tors and Staphylococcus aureus for exploration on the possibility of the two spores as biological in

5、dicators esultsThe av-erage concentration of VPHP was 1 972 2 615 mg/m3at the center of a 20 m3room after the generators running for 0 5 1 0 h，and 2474 1070 mg/m3after running for 1 5 2 5 h The killing logarithm values of S aureus，spores of Bacillussubtilis var niger and spores of Bacillus stearothe

6、rmophilus contaminated on stainless steel carriers were 2 32，4 18 and5 00 after its running for 2 5 h(one running cycle)ConclusionDuring the preset running cycle of the VPHP genera-tor，its killing effect on S aureus is considerably lower than those on the two spores，which suggests the limitation of

7、thetwo spores as VPHP biological indicatorsKey wordsVPHP;spores of bacteria;vegetative bacteria;biological indicator基金 项 目浙 江 省 医 药 卫 生 骨 干 人 才 类 科 研 基 金(2011CB014)。作者简介 魏兰芬(1967 )，女，浙江绍兴人，大学本科，从事消毒产品鉴定及消毒研究工作。过氧化氢汽体(Vapor Phase Hydrogen Peroxide，VPHP)因其杀菌效果好，无有毒有害残余物质残留等优点，在环境消毒中的应用日渐广泛1，2。目前，评价 VP

8、HP 的消毒效果均以嗜热脂肪杆菌芽孢或枯草杆菌黑色变种芽孢作为生物指示剂3 5，我国药典自 2005 年开始，亦将嗜热脂肪杆菌芽孢作为VPHP 灭菌效果评价的生物指示剂。鉴于大部分微生物携带有过氧化氢分解酶(触酶)，该酶的含量高低或表达能力强弱可能会影响过氧化氢汽体对其杀灭效果，部分细菌对其抵抗力有可能会比细菌芽孢强。为此，笔者以国内生产的某品牌过氧化氢汽体发生器(VPHP 发生器)作为模型，比较了两种生物指示剂芽孢与携带过氧化氢分解酶表达较为强烈的金黄色葡萄球菌对 VPHP 抗力。1材料与方法1.1试验材料597中国消毒学杂志 2014 年第 31 卷第 8 期过氧化氢汽体发生器与配套的过氧

9、化氢消毒液(含量为 450 g/L)，为国内某企业生产。该发生器主要用于空气和物体表面的消毒，也用于药用隔离器、冻干机等的灭菌处理。工作流程包含了除湿、流量调节、消毒、除残、排气等步骤。试验菌株有金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)，中国微生物菌种保藏管理委员会提供冻干管;嗜热脂肪杆菌(ATCC 7953)和(ATCC 12980)两株芽孢，分别用 a 和 b 代表;枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢为本实验室保存。1.2试验方法1.2.1染菌载体制备枯草杆菌黑色变种芽孢和嗜热脂肪杆菌芽孢 a，均按规范的细菌芽孢培养制备方法制备成符合要求的细菌芽孢悬液，用胰蛋白营养肉汤(TSB)稀释后

10、滴染于直径12 mm 的不锈钢圆片上，涂开后在室温下吹干待用。嗜热脂肪杆菌芽孢 b 为由灭菌器生产企业提供的直径 8 mm 不锈钢染菌片，纸质包装，由美国 Mesalabs 公司提供，标示 D 值为“0.9minutes in 2 mg/L gaseous H2O2”。金黄色葡萄球菌经常规培养制备成试验菌悬，以胰蛋白营养肉汤(TSB)洗脱后，滴染于直径 12 mm 的不锈钢片上，涂开后在室温下吹干待用。1.2.2杀菌效果测试实验在 20 m3的密闭实验室内进行。将不同菌种的染菌载体放于无菌玻璃平皿中，置于 VPHP 发生器的面板上(高度约 1 m)，启动发生器运行一周期(流量调节 60 min

11、、消毒60 min、除残 30 min)。将染菌载体直接(或除去纸包装后)置入含 5 ml D/E 中和肉汤(经中和剂筛选试验鉴定合格)的试管内，经充分洗脱后，以倾注法对残留菌进行回收计数。同时以室温下放置相同时间的染菌载体作为阳性对照活菌计数，以实验同批次的培养基、稀释液、中和剂等分设阴性对照。试验重复 3 次。1.2.3使用环境中过氧化氢含量测试VPHP 发生器安装在 20 m3的密闭实验室内，启动发生器运行不同时间，以 Portasens 型气体分析仪于 1 m 高处测试工作不同时间中心点空气中过氧化氢汽体浓度(整个工作期间辅以风扇运行以使气体分散均匀，下同)。试验重复三次。2结果2.1

12、杀菌试验结果经 3 次载体定量杀菌试验表明，该发生器在设定的程序下(调节流量:2.5 g/min 60 min;消毒:2.0 g/min 60 min;除残:30 min，合计 2.5 h)作用1 周期，对置于 20 m3密闭空间中的不锈钢载体上的枯草杆菌黑色变种芽孢、嗜热脂肪杆菌芽孢、金黄色葡萄球菌的杀灭对数值分别为 4.18、5.00、2.32(表 1)。表 1VPHP 对不同细菌杀灭效果比较试验菌种阳性对照组平均菌数对数值及范围残留菌数均值及范围(cfu/片)作用一周期平均杀灭对数值及其范围枯草杆菌黑色变种芽孢6.52(6.48 6.54)217(192 258)4.18(4.12 4.

13、23)嗜热脂肪杆菌芽孢 a5.85(5.83 5.87)5(5)5.00(5.00)嗜热脂肪杆菌芽孢 b5.78(5.76 5.80)5(5)5.00(5.00)金黄色葡萄球菌6.68(6.65 6.70)22 900(18 000 27 800)2.32(2.24 2.39)注:各阴性对照均无菌生长。2.2使用环境中过氧化氢浓度测试结果三次测试结果显示，该发生器启动运行 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，在 20 m3空间中心点过氧化氢均值依次分别为 1 972、2 615、2 474、2 247、1 070mg/m3。结果提示，该发生器所产生的过氧化氢浓度于启动 1 h 达到高峰

14、值，然后处于下降趋势，详见曲线图 1。3讨论因过氧化氢汽体杀菌效果良好、分解产物无毒无害等特点，近年来，该类气体发生器在空气、物体表面的消毒中得到了应用，美国疾控中心的医疗机构消毒灭菌指南(2008 版)已建议在诊疗环境中采图 1某汽化过氧化氢发生器工作浓度曲线用过氧化氢汽体消毒处理，认为该类产品对根除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MSA)是一个非常有效的方法6。另有研究报道7，过氧化氢汽体(HPV)697Chinese Journal of Disinfection2014;31(8)对诊疗环境中多重耐药菌(MDOs)也具有良好的去除效果。目前，判定过氧化氢汽体的消毒效果，在实验室中以嗜热脂肪杆

15、菌芽孢为生物指示剂居多，也有分别以嗜热脂肪杆菌芽孢与枯草杆菌黑色变种芽孢作为生物指示剂作效果评判。现场使用则以自然菌或目标致病菌作研究对象，但因大多数医疗机构、医药行业对诊疗、生产环境的清洁工作较为重视，导致微生物本底污染量相对较低，使得现场消毒效果的判定存在着一定的偏离性。本研究结果显示，以某过氧化氢汽体发生器作用一周期，过氧化氢浓度为1 070 2 615 mg/m3范围，维持作用 130 min 的条件下，对金黄色葡萄球菌的杀灭对数值仅为 2.32，未达“低水平消毒”要求，而对枯草杆菌黑色变种芽孢及嗜热脂肪杆菌芽孢的杀灭对数值均 4.00，达到了“高水平消毒”标准，尤其是嗜热脂肪杆菌芽孢

16、，每片载体上的残留均数5 cfu。由此可见，金黄色葡萄球菌对过氧化氢汽体的抵抗力明显高于上述两种生物指示剂芽孢。分析其原因可能与金黄色葡萄球菌所携带的过氧化氢分解酶的活性或表达能力较强有关;而嗜热脂肪杆菌芽孢的抵抗力较弱，可能与该芽孢的产率较低，不易获得较高浓度的菌悬液有一定的关系。而市售的部分生物指示剂，随着存放时间的延长，其活菌数很容易低于通用标准下限值(500 000 cfu/件)，用其作生物指示剂时，会影响指示效果的准确性。本研究中的嗜热脂肪杆菌芽孢回收菌数低于枯草杆菌黑色变种芽孢，但是三种细菌芽孢回收菌数差值均在10 倍以内。据 Spicher8认为，染菌量增加 10 倍以上，D 值

17、才可有较明显的升高，因而枯草杆菌黑色变种芽孢抵抗力强于嗜热脂肪杆菌芽孢，也可能与两类芽孢携带过氧化氢分解酶的活性或表达能力不同有关，具体原因有待于从分子生物学、细菌生理学等方面作进一步研究。目前，对用于压力蒸汽灭菌指示用的嗜热脂肪杆菌芽孢的抗力有明确的要求，即抗力符合国际标准和国家标准的规定:即在 121饱和蒸汽作用下，存活时间3.9 min，杀灭时间19 min，D10值为1.31.9 min，每件指示剂的回收菌数为 105 106cfu，或 5 1055 106cfu，而对于过氧化氢汽体的杀菌效果的生物指示剂仅给出了菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢的要求，对于 D 值等参数未作出明确要求，因而给判定

18、生物指示剂的抗力强弱带来了一定的难度，应引起各有关部门的高度重视。微生物对外界因子的抵抗力，从高到低的排序一般为:细菌芽孢、分枝杆菌、非脂性和小病毒、真菌、细菌繁殖体、亲脂性和中等大小病毒。如某微生物携带有特殊的基因或酶类，有可能对某项理化因子的抵抗力出现异常，如洋葱假单胞菌等假单胞菌极易携带耐消毒剂基因，对季铵盐的抗力明显高于枯草杆菌黑色变种芽孢9。本研究结果显示，金黄色葡萄球菌对过氧化氢汽体的抗力明显高于枯草杆菌黑色变种芽孢及嗜热脂肪杆菌芽孢，而金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的致病菌，部分金黄色葡萄球菌可产生青酶素酶，水解-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。自甲氧西林应用于临床后曾有效

19、地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染，可随后很快发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M-SA)，MSA 从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内 感 染 的 重 要 病 原 菌 之 一。根 据 文 献 的 报道7，8，过氧化氢汽体用于诊疗环境的消毒处理，可降低病人感染 MSA 的风险。如该类金黄色葡萄球菌携带的过氧化氢分解酶的活性较强，则可能出现常用剂量(杀灭嗜热脂肪杆菌芽孢达到高水平消毒)无法将其有效杀灭的现象，有必要以金黄色葡萄球菌或其他过氧化氢分解酶活力更强的微生物作为生物指示剂对其使用剂量的效果另行评价。参 考 文 献1 张遐耘，祝文卿 过氧化氢气体对净化空间内细菌杀灭效果的观察J 中国消毒学

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