(128)--细菌转座子Tn5转座机理的研究进展.pdf

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1、文章编号:10083464(2003)04031606细菌转座子 Tn5转座机理的研究进展摘要:细菌转座子 Tn5属于 IS4家族,两端具有两段倒置的 IS50序列。右末端(IS50R)编码转座酶(Tnp)和一个阻遏转座蛋白(Inh);左末端(IS50L)存在一个赭石突变,不能编码有功能的转座酶。Tn5属于非复制型转座子,被广泛应用于发现新基因、分析基因功能和构建突变体库。但是在相当长的一个时期里,人们对其转座机理、转座热点等问题并不完全清楚。随着在体外具有活性的转座酶 Tnp EK/LP(同时含有E54K和 L372P两个突变点)的成功构建,以及对 Tnp催化中心三维结构的深入研究,近几年对

2、 Tn5的转座机理才有了深刻了解。本文综述了Tn5的转座机制、Tnp结构、DDE模体和转座频率调控等研究的最新进展。关键词:转座子;机理;模体中图分类号:Q754 文献标识码:AResearch development of Tn5 transposition mechanismT ANG Jiangtao,HE Yongqiang,TANG Jiliang(Insititute of Molecular Genetics,Guangxi Univ.,Nanning 530005,China)Abstract:The bacterial transposon Tn5,belonging to

3、IS4 family,has two inverted repeats ofIS50 at each end.The right end(IS50R)encodes two proteins(Tnp and Inh),and the ocher mutationin the left end renders inactive by prematurely terminating the tansposase.With the feature of non-replicative function,Tn5 has been widely used in discovering new genes

4、,analyzing the functions ofgenes and constructing mutant pools,but in a considerably long period,People didnt have enoughknowledge about its transposition mechanism,the hotspot of Tn5 insertion and other concerned is-sues.With successfully constructing a hyperactive transposase in vitro which contai

5、ns the point muta-tions E54K and L372P,and furthering the research on the three-dimensional structures of thecatalytic core domains of Tnp,the breakthrough progress in Tn5s research has been achieved in re-cent years.This paper reviews the latest achievements in the research of Tn5 transposition mec

6、ha-nism,the structure of Tnp,DDE motif and the control of transposition frequency.Key words:transposon;mechanism;motif转座子又称为转座因子或称作跳跃因子,它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分,从而引起遗传变异。20世纪 50年代初期,美国遗传育种学家 McClintock通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研究而发现转座现象。首先发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分(controlling elements),随后在果蝇中发现了可转移的遗传成分。但是直到 1967年,在大肠杆菌

7、的半乳糖操纵子的研究中发现了某些突变体是染色体上插入了一段序列所致,才开始对转座子进行大量的遗传学研究。在 1989年 MO-BILE DNA 出版之后,对转座子的研究更是取得了长足的进步。第 22卷第 4期Vol.22,No.4广西农业生物科学Journal of Guangxi Agric.and Biol.Science2003年 12月Dec.,2003 收稿日期:20020805作者简介:唐江涛(1971),男,湖南江华人,广西大学助理工程师,硕士。细 菌转 座子可分成以下几 类:插入 序列(Insertion sequences)、复合转座 子(Compositetransposo

8、ns)、TnA转座子家族(TnA family)和可转移噬菌体(Mu phage)。Tn5属于复合转座子。Tn5最早是在 Escherichia coli 中被发现的,序列全长 5 818 bp,由编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)的核心序列和两条倒置的 IS50序列组成(IS50属于 IS4家族)。IS50R和 IS50L高度同源,只是 IS50L的第 1 442碱基处存在一个赭石突变(图 1)。IS50具有 19 bp的倒置末端(外末端OE和内末端 IE),两倒置末端有 7个碱基不相同。此倒置末端是转座酶(Tnp)的作用位点。IS50R编码 53-Kda的 Tnp,还编码一个 48

9、-Kda的转座阻遏蛋白(Inh)。Inh和 Tnp使用同一阅读框,但启动子不同。Inh比 Tnp少了 N端的 55个氨基酸。由于 IS50L上的赭石突变,翻译提前终止,不能产生有活性的 Inh和 Tnp。图 1 Tn5的结构Fig.1 Structure of Tn51 Tn5的转座机理转座分为复制型转座(replication transposition)和非复制型转座(nonreplication transposition)。Tn5的转座是非复制型、多步骤的复杂过程。首先在有 Mg2+存在的条件下,两个 Tnp分子的 N末端和活性中心的几个氨基酸残基分别结合到 Tn5的 OE末端,形成两

10、个 Tnp-OE的复合体,随后两个复合体联会,Tnp的 C末端相互作用而二聚体化,形成一个联会复合体。只有形成该联会复合体,Tnp才具有切割 DNA的活性1。最近通过生物化学手段证实,联会复合体由一个二聚体蛋白质和两分子DNA组成2,3。形成这种结构有利于协同 Tn5 DNA链的切割和转移,有利于防止 Tnp只对转座子DNA链的一端进行切割。结合在左末端的 Tnp负责催化右末端的磷酸二酯键水解,而结合在右末端的Tnp负责催化左末端的磷酸二酯键水解4 6。Tnp活化水分子,此活化的水分子水解 DAN链,在 Tn5的两末端分别形成两个 3-OH亲核基团。3-OH进而攻击互补链形成发夹结构7。随后另

11、一活化的水分子水解该发夹结构,形成平末端的 Tn5。整个联会复合体离开供体链,并结合到靶 DNA上。Tn5的3-OH亲核攻击靶序列,在转座子插入位点之间形成 9 bp的粘性末端,转座子的 3-OH同靶 DNA的 5-P之间形成共价键,转座子就插入到靶序列之中。在 DNA聚合酶的作用下补平缺口,转座子的两端形成 9 bp的正向重复序列8(图 2)。为了修复因 Tn5的插入而损伤的靶 DNA链,曾同 DNA牢固结合的 Tnp必须从联会复合体上移走9。体外实验发现联会复合体的 Tnp可被苯酚-氯仿抽提10。在体内,Tnp是如何从联会复合体上分离仍然不清楚,可能还需要别的蛋白质因子11。目前只有 IS

12、903和噬菌体 Mu的转座酶的该步反应研究得比较清楚,在两个转座系统中都有一个伴侣蛋白(chaperone protein)介导的过程 12。Tn5的体外转座过程,从 Tnp结合到 Tn5的末端开始,到整个转座过程的完成,需要的全部同转座相关的因子:转座子的末端序列、靶 DNA、Tnp和 Mg2+。在别的转座子转座过程中还需要一些转座子或宿主编码的蛋白质因子才能完成转座。例如在噬菌体 Mu的转座过程中需要活化蛋白 MuB,而在 Tn10和 Tn7的转座过程中则分别需要 DNA整合宿主因子(DNA integration host factor)和TnsC13。317第 4期唐江涛等:细菌转座子

13、Tn5转座机理的研究进展图 2 Tn5转座过程Fig.1 Diagram of Tn5transposition2 转座酶的结构由 IS50R编码的 Tn5 转座酶(Tnp)由 477个氨基酸组成,可以分成三个大的折叠区:由 70 个氨基酸残基组成的 N末端折叠区、由约 300个残基组成的具有催化活性的中部折叠区和 C 末端折叠区。N末端折叠区的二级结构全部由 -螺旋(-helices)和转角(turns)组成,这个区域的主要功能是同转座子末端 DNA结合。以下两个实验证据证明了这一点:同 OE结合的 Tnp N末端的前 113个氨基酸残基不被蛋白酶水解14;如果缺失 N末端的一小段残基,Tn

14、p就不能同 OE结合15。N末端氨基酸残基 35 54组成了一个能同 DNA结合的模体。利用蛋白质结构分类数据库(structural classifica-tion of protein database)对中部折叠区进行分析,发现其含有一个“核酸酶类 H模体”(ribonuclease H-like motif)。这一模体由两个超二级结构/折叠和一混合折叠片(两条链同余下的四条反向平行)组成。Tnp所有的活性位点的氨基酸残基都包括在该区域内。Tn5 Tnp、Mu Tnp和逆转录病毒整合酶等的“核酸酶类 H模体”结构几乎一样,只是组成 Tn5的“核酸酶类 H模体”的残基比组成逆转录病毒整合酶

15、的该模体的残基多 90个,体积也大两倍。Tn5 Tnp在这个区域也形成了能够同 DNA结合的模体。C末端全部由 螺旋和转角组成。该区域能同另一分子的 Tnp或 Inh的 C末端结合形成二聚体。C末端的 -螺旋的一部分(残基 458 468)是 Tn5转座形成联会复合体结构所必需的。体外实验证实:如果从 C末端缺失 8个或更多氨基酸残基会降低联会复合体的形成,或许根本不能形成复合体。Tn5 Tnp的三个区域具有一些相同的功能,都参与同 DNA的结合,都对形成联会复合体结构具有重要的作用6,16。3 DDE模体(DDE motif)近来研究发现许多磷酸转移酶(phosphorytransferas

16、se),包括 RNase H、Ruvc Holliday拆分酶 和许多 Tnp、逆转录病毒整合酶的活性中心都存在三个保守酸性氨基酸残基(两个天冬氨酸和一个谷氨酸,即 DDE模体)对酶的活性起关键作用17,18。这三个氨基酸形成了金属离子(Mg2+、Mn2+)的结合位点,Mg2+在转座过程中协同亲核基团作用,是完成转座必不可少的因子之一。许多 IS家族(IS3、IS6等)和逆转录病毒整合酶等的 DDE模体是高度保守的,还发现逆转录病毒的 DDE模体在转座过程中同末端序列相互作用,使末端序列正确定位于酶的活性部位。研究发现 Tn7、Tn10和 Tc1等的 DDE模体三个氨基酸残基在一级结构上并不保

17、守,但是实验证明三个酸性氨基酸残基对于酶的活性来说是318广西农业生物科学第 22卷必不可少的。RNase H、Ruv L、和 Mu Tnp的 DDE模体在三维空间结构上的排列非常相似。19转座子 Tn5的 Asp97、Asp188、Glu327组成 DDE模体。如果将 Tn5 DDE模体的任何一个氨基酸突变成丙氨酸,都将使 Tnp的催化活性完全丧失。在对 Tn5转座酶的空间结构研究发现在 Asp97和 Asp188之间及 Asp97和 Glu327之间分别存在一个碳酸根离子,这是阳离子的结合位点 20。在 Tn5转座酶和DNA形成的复合结构中发现了一个 Mn2+。该 Mn2+被 Asp97、

18、Glu327和转移链的 3-OH所定位。但是电子密度图并没有显示在 Asp97和 Asp188之间存在另一个金属离子。除 DDE模体外,还在一些转座子的 Tnp和逆转录病毒整合酶中发现在 DDE模体的谷氨酸之后有一对保守的赖氨酸残基(E K K)。经过对 HIV整合酶的研究表明这两个赖氨酸残基对酶的催化活性是极为关键的,它们能同 DNA末端序列十字交联(cross linked)在一起21,22。在整个 IS4家族中(包括 Tn5)有一个在一级序列上保守的 YREK模体。DDE模体中的谷氨酸残基和第二个赖氨酸构成了 YREK模体的后半部分。对 Tn1023和 Tn90324转座酶的 YREK模

19、体进行了大量的突变实验,但是仍然不清楚 YREK模体在催化反应中的作用。4 转座频率调控转座频率对细胞来说十分重要,过高的转座频率会损伤宿主细胞。为了自身的生存,转座子必须保持低的转座频率。Tn5转座频率调控依赖一套复杂的调节机制,如 Tnp的反式抑制自身的活性、Inh的抑制作用、甲基化等。Tn5在体内的转座频率保持在一个较低的范围之内,即使是 Tn5插入到高表达的基因中,通读(read through)Tn5的转座酶基因,所产生的 mRNA也会形成二级结构,封锁 SD序列和起始密码子,不能起始 Tnp的翻译。4.1 Tnp对转座活性的调节转座子 Tn5的转座酶有两种相反的活性,它能够以顺式作

20、用催化转座,同时也能通过反式作用抑制自身的活性。Tnp倾向于催化在 Tnp合成位点附近的 OE-OE或 OE-IE序列的转座,Tnp表现出很强的顺式作用。其反式互补作用极弱。造成这种现象的可能原因是:Tnp在化学性质上的不稳定或是因为 Tnp在合成后不久活性就被抑制。然而研究证明 Tn5 Tnp在体内化学性质是稳定的。Tnp在合成后不久活性就被抑制才是 Tnp表现出强烈的顺式作用的真正原因。Tnp在体内存在两种构型:低丰度的活性构形和高丰度的非活性构型,无活性构型的 Tnp之间可以形成寡聚体。Tnp可能在尚未完全合成就结合到 Tn5末端催化转座。实验证明缺少 100个 C末端氨基酸残基的 Tn

21、p对 OE的亲合性比全长的 Tnp高 10倍25。4.2 Inh对转座活性的调节Inh是转座作用的抑制因子,它是一个反式作用因子。Tnp和 Inh的相对丰度在一定程度上决定了转座的频率。Tnp和 Inh具有相同的 C末端。Tnp的 C末端是形成转座联会复合体时两分子 Tnp相互作用二聚体化的区域。Inh也能结合到 Tnp的 C末端,形成复合体,使得结合在 Tn5末端的两个 Tnp之间不能相互作用产生转座所必需的联会复合体,阻止 Tn5的转座。Tnp和 Inh的启动子部分重叠在一起(图 3),彼此之间存在一定的竞争性。T2转录只能翻译出Inh,而 T1的转录产物能翻译出两种蛋白质(Tnp和 In

22、h),但是翻译出 Inh的效率是很低的 26。Tnp启动子的-10区有两个甲基化作用位点序列 GATC。DNA的甲基化阻止 RNA聚合酶对 Tnp启动子的识别,间接地增强了 Inh的转录,从而降低 Tn5的转座频率。新复制的 DNA是半甲基化的 DNA(hemimethylated DNA),易发生 Tn5的转座27。319第 4期唐江涛等:细菌转座子Tn5转座机理的研究进展图 3 IS50R结构Fig.3 Structurp of IS50RT1:转座酶基因(Tnp gene);T2:转座抑制蛋白基(Inh gene)5 结束语转座子 Tn5长期以来被广泛应用于发现新基因、分析基因功能和构建

23、突变体库。但是,直到近年,通过对转座酶的结构、DDE模体等的研究,Tn5转座机理、转座频率调控等才得到了较深刻的认识。因为野生型 Tnp在体外无转座酶活性,对于 Tn5的转座机理、转座热点等问题仍需进一步研究。参考文献:1 KALE S B,LANDREE M A,RO TH D B.Conditional RAG-1mutants block the hairpin formation step ofV(D)J recombinationJ.Mol Cell Biol,2001,21:459 466.2 BHASIN A,GORYSHIN I Y,REZN IKOFF W S.Charact

24、erization of a Tn5 pre-cleavage synaptic complexJ.Mol Biol,2000,302(1):49 63.3 ALLINGHAM J S,WARDLE S J,HANIFO RD D B.Determinants for hairpin formation in Tn10 transpositionJ.EMBO J,2001,20:2 931 2 942.4BHASIN A,GORYSHIN I Y,REZNIKO FF W S,et al.Hairpin formation in Tn5transpositionJ.J Biol Chem,19

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26、sional structure of the Tn5 synaptic complextransposition intermediate J.Science,2000,289(5476):77 85.8 CRELLIN P,CHALM ERS R.Protein-DN A contacts and conformational changes in the Tn10 transpososomeduring assembly and activation for cleavageJ.EM BO J,2001,20:3 882 3 891.9STEINIGER-W HITE M,REZN IK

27、OFF W S.The C-terminalHelix of Tn5transposase is required for synapticcomplex formation J.J Biol Chem,2000,275(30):23 127 23 133.10 TW IN IN G S S,GORYSHIN I Y,BHASIN A,et al.Functional characterization of arginine 30,lysine 40,andarginine 62 in Tn5 transposase J.J Biol Chem,2001,276(25):23 135 23 1

28、43.11 GORYSHIN I Y,REZNIKOFF W S.Tn5in vitro TranspositionJ.JBiol Chem,1998,273(13):7 367 7 374.12 REZNIKO FF W S,BHASIN A,DAVIES D R,et al.Tn5:A molecular window on transposition J.BiochemBiophys Res Commun,1999,266(3):729 734.13 DERBYSHIRE K M,KRAM ER M,GRINDLEY N D F.Role of instability in the ci

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32、6:23 213 23 216.19N AUM ANN T A,REZN IKOFF W S.Tn5transposase active site mutantsJ.J Biol Chem,2002,277(20):17 623 17 629.20 BU JACZ G,ALEX ANDRATOS J,WLODAW ER A.Binding of different divalent cations to the active site of aviansarcoma virus integrase and their effects on enzymatic activityJ.J Biol

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34、gle active site that catalyzes the nickingand transesterification steps of V(D)Jrecombination J.M ol Cell Biol,2001,21:449 458.23HANIFO RD D B,CHELOUCHE A R,KLECKN ER N.A specific class of IS10trans posase mutants are blockedfor target site interactions and promote formation of an excised transposon

35、 fragment J.Cell,1989,59(2):385 394.24TAV AKOLI N P,DEV OST J,DERBYSHIRE K M.Defining functional regions of the IS903transposaseJ.J Mol Biol,1997,274(4):491 504.25M AHILLON J,CHANDLER M.Insertion sequences microbiol J.Mol Biol Rev,1998,62(3:)725 774.(责任编辑梁健)广西大学科技园开工奠基仪式隆重举行2003年 10月 7日上午,广西第一个大学科技园

36、 广西大学科技园在南宁高新区科技工业园举行隆重的开工奠基仪式。全国政协副主席李兆焯,陆兵、李纪恒等自治区党政军领导和南宁市领导,我校党委书记余瑾,校长唐纪良等校领导,以及中央电视台等 16家新闻单位的记者出席了开工奠基仪式。李兆焯为科技园题词:积聚高新技术,振兴广西经济。广西大学科技园是以我校为依托,利用广西大学等高校的人才、技术、信息、实验设备、文化氛围等综合资源优势,通过包括风险投资在内的多元化投资渠道,在政府政策引导和支持下建立的从事技术创新和企业孵化活动的高科技园。园区位于南宁市北快速环道北侧南宁高新技术产业开发区科技工业园内,距我校仅 2 km。首期建设用地 11.1 hm2(166

37、亩),总建筑面积 80 000 m2,其孵化面积 18 000 m2,投资总额 2.2亿元,重点建设和发展生物技术、信息技术、精细轻化工、新材料、光机电一体化、现代医药技术等 6个孵化平台和产业化基地。广西大学科技园实行“一校一园”的建设和发展模式,是南宁高新区内的“园中园”,享受高新区的各项优惠政策。对直接进入广西大学科技园产业化的项目(企业),视同孵化器毕业企业,享受相应的优惠政策。科技园按企业化运作,以企业为主体,以产权为纽带,以市场为导向,以效益为中心,以科技成果转化为重点的运行模式,建立“产权明晰、权责明确、政企分开、管理科学”的现代企业运行机制。我校是广西唯一进入“211 工程”建设的大学,科研机构完善,科技资源丰富,科研成果累累。自1999年以来共承担科研项目 1 074项,科研经费 15 924万元,其中国家级项目 86项,省部级项目 249项,厅局级项目 380项,国际合作项目 21项,获国家发明专利 16项,省部级以上奖励 128项。目前已有-乙酰乳酸脱羧酶、蔗果低聚糖等 30余项科研成果进入南宁高新区孵化及产业化,总注册资本4000余万元。我校雄厚的科技实力,丰富的校友资源及发展壮大的校办产业为大学科技园的建设提供强大的技术支撑、充裕的人才资源和坚实的物质基础。(科技园办公室李能)321第 4期唐江涛等:细菌转座子Tn5转座机理的研究进展