纸色谱法实验报告.pdf

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1、纸色谱法实验报告纸色谱法实验报告实验六 纸层析法观察转氨基作用【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用室温：28（一）实验目的：1、学习氨基酸纸层析的基本原理。2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的-酮酸与-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的氨基转移到另一酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸本实验以丙氨酸和-酮戊二酸为底物，加肝匀浆

2、保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值 Rf 表示：ALT物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用 Rf 值来

3、鉴定被分离的物质。（三）实验材料与仪器：试剂：1、0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液。2、0.2mol/L Na2HPO4 溶液 81ml 与 0.2mol/L NaH2PO4溶液 19ml 混匀,用蒸馏水稀释 20 倍。3、0.1mol/L 丙氨酸溶液称取丙氨酸 0.891 克,先溶于少量 0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液中,以 1.0 N NaOH 仔细调至 pH7.4 后,加磷酸盐缓冲液至 100ml。4、0.1mol/L酮戊二酸称取酮戊二酸 1.461 克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至 pH 7.4

4、后，加磷酸盐缓冲液至 100ml。5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸 0.735 克,先溶于少量 0.01mol/LpH 7.4 磷酸盐缓冲液中，以 1.0 N NaOH 仔细调至 pH 7.4 后,加磷酸盐缓冲液至 50 ml。6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮 0.5 克于 100 ml 丙酮中溶解。7、层析溶剂：将重蒸过的酚 2 份和水 1 份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置 24 小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。仪器：玻璃匀浆器、10ml 试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37恒温水浴箱、9cm 圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。（四）实验步骤:1、肝匀浆制备：取新鲜

5、动物肝 0.5 克,剪碎后放入匀浆器,加入冷 0.01mol/LpH 7.4 磷酸盐缓冲液 1.0 ml,迅速研成匀浆，用上述缓冲液 4.5ml 混匀备用。2、酶促反应过程（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆 0.5ml。把对照管放沸水浴中加热 10 分钟，取出冷却。（2）各加 0.1mol/L 丙氨酸 0.5 ml,0.1mol/L-酮戊二酸 0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液1.5 ml,摇匀。（3）37保温，30 分钟后取出，保温完毕。（4）把测定管放沸水浴中煮 10 分钟，取出后冷却，过滤。3、层析（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）

6、放洁白纸上，以圆点为中心，约 1 cm 为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点 2、4 处。把测定液、对照液分别点在原点 1、3 处。注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。在第一次点样点干后，再在原处同样点第 2 次。（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约 1cm 时，

7、约 25分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。（5）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算 Rf 值，分析是否发生了转氨基反应。（五）实验结果记录：图（1）（六）实验讨论：1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据 Rf 值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质 b 为谷氨酸，则未知溶质 a 为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染

8、。3、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。4、点样点不宜过大，直径小于 0.5cm.XX 年 9 月 19 日篇二：实验六 氨基酸的纸层析法氨基酸的纸层析法一目的了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。二、原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相

9、同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf 值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转 90 度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。三、实验仪器1、新华滤纸2、层析缸3、细线4、点样管5、橡皮筋6、电

10、吹风7、喷雾器四、实验试剂1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮无水丙酮溶液：0.5g 茚三酮溶于 100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中五、实验步骤1、取滤纸剪成 2010 厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端 23cm 处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过 5mm,每点一次用吹风机吹干，点23 次为佳。3、点样(原文来自：小 草 范 文 网:纸色谱法实验报告)后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液

11、面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端 12cm 处时，停止展层（大约 23 小时）。4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱 60）烘干。5、均匀喷上茚三酮无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。7、量取数值，计算各自的Rf 值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看）六实验结果H1=1.0cmH2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735Rf4=0.08461据此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯

12、丙氨酸（Phy）组成。七实验分析实验中出现了拖尾的现象。拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。图象的出现，是在实验中对影响 Rf 值的主要因素要求，掌握不够所致。诸如，物质结构与极性对 Rf 值的影响，层析溶剂对 Rf 值的影响，PH 对 Rf 值的影响(溶剂、滤纸和样品的 PH 值)，温度对 Rf 值的影响，滤纸的质地是否均匀，薄厚是否适当，纤维的松紧度是否适中等对 Rf 值的影响，展层的方式(上行、下行)对 Rf 值

13、的影响。然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响 Rf 值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响 Rf值的主要因素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液，和为了对

14、照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将 5 一 j5 微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。点样后要自然风干，或冷风吹干。最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品破坏，更会使佯品点干的太燥。正是由于这样，样品点太干燥，使其样品物文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。所以在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中到达一个位置。致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。纸上分配层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。样品点不要吹的太干燥，否则，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。影响 Rf 值的主要因素