紫外分光光度法测定核酸的含量.pdf

《紫外分光光度法测定核酸的含量.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《紫外分光光度法测定核酸的含量.pdf（25页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、实验一实验一紫外分光光度法测定核酸的含量紫外分光光度法测定核酸的含量一、实验目的一、实验目的了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法学习使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法二、实验原理二、实验原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA 和 DNA 的紫外吸收高峰在 260 nm 波长处。遵照有色溶液对光吸收的物理定律即Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。一般在 260 nm 波长下，每毫升含 1gDNA溶液的光吸收值为 0.020，每毫升含 1g RNA 溶液的光吸收值为 0.022。故测定未知溶液在260 nm 的光吸

2、收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。蛋白质和核苷酸等也有紫外吸收。通常蛋白质的吸收高峰在280 nm 波长处，在 260 nm处吸收值仅为核酸的 1/10 或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA 的 260 nm 与 280 nm 吸收比值在 2.0 以上；DNA 的 260 nm 和 280 nm 吸收比值在 1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品中混有大量的蛋白质和核苷酸等紫外吸收物质时，应设法除去。三、实验器材三、实验器材S54 紫外分光光度计操作指南：插上电源插头，打开仪器左侧面下方的电源开关，本仪器具备计算机自检与波长及 100线

3、自正功能，开机后显示窗两侧8 灯全亮，指示灯进入自检与自校状态，约需 10 多分钟。当 TRANS 灯亮即说明自校结束进入待机状态，可随时应用。设定波长（本实验波长为 260 nm 和 280 nm），按 Para 键到 Now 灯亮，按或至要求波长，再按 Para确认，显示窗改变波长至设定值。推开比色室的盖子。将空白和样品溶液分别仔细倒入特殊的石英比色皿中（倒入之前先用少量溶液润洗比色皿一次），用擦镜纸擦去比色皿表面的余液，然后将比色皿插入比色室里的卡座中，拉动卡座拉杆，将空白液的比色皿置于光路中。按 MODE 键，使TRANS.透射比键灯亮，在比色室盖子关闭的状态下按一下0T 键，使显示窗

4、中的数字为 0.000。关闭比色室的盖子，按一下 100ABS，使显示窗中的数字为100.0。这样仪器就调整好了。再按MODE 键，使ABS 灯亮，拉动卡座拉杆，使样品液的比色皿置于光路中，此时，显示窗中的数字即为样品的吸光度。将结果记录下来。将比色皿中的溶液倒入废缸中，用洗液洗净比色皿。注意：不测定时，请将比色室的盖子打开。测定时必须保持比色室干燥干净，严禁将溶液洒落比色室。且手只能接触比色皿的毛面。其它器材：移液管、洗耳球、试管、试管架、烧杯、擦镜纸等。四、实验试剂四、实验试剂标准 RNA 溶液：100g/ml待测的 RNA 溶液五、操作方法五、操作方法1 1、标准曲线的制作：标准曲线的制

5、作：取 7 只试管、2 只移液管（分别为 1ml 和 5ml）按照下表加样。试管标准 RNA 溶液（ml）1020.130.240.450.660.8711蒸馏水（ml）54.94.84.64.44.24.0混匀后以 1 号管为空白，在 260 nm 处测定光吸收值 A，以溶液的浓度为横坐标、A 值为纵坐标，在坐标纸上绘制出标准曲线，理论上它应该是一条直线。2 2、样品的测定样品的测定用试管取 6 ml 左右待测的 RNA 溶液，仍以1 号试管为空白，分别在260 nm 和 280 nm处测定光吸收值 A，用 A260在标准曲线上查出待测的RNA 溶液的浓度。并计算A260/A280，此值大于

6、 2.0，表示待测的 RNA 样品很纯。六、思考题六、思考题1.在绘制标准曲线中，如何保证曲线的精度及准确度？如果待测样品的RNA 浓度超过了标准曲线的范围，应该如何处理？2.绘制出的标准曲线图为何种曲线？它说明什么问题？3.若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？（提示：钼酸铵-过氯酸沉淀剂可以沉淀除去大分子核酸）2实验二实验二-淀粉酶的提取及其聚丙烯酰胺凝胶电泳淀粉酶的提取及其聚丙烯酰胺凝胶电泳一、实验目的一、实验目的学习-淀粉酶的发酵生产-淀粉酶的粗提及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术二、实验原理二、实验原理本实验从发酵液中粗提-淀粉酶使用有机溶剂沉淀法。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，

7、溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如 20时水的介电常数为 80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24 和 21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀，但操作需在低温下进行。在检测粗提液中的-淀粉酶时，我们使用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为 PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨

8、率。三、主要仪器设备三、主要仪器设备摇床、超净工作台、冰箱、电泳仪、垂直平板电泳槽、离心机四、菌种四、菌种枯草芽孢杆菌 10035五、实验试剂五、实验试剂1丙烯酰胺（Acr）21琼脂3N，N，N，N四甲基乙二胺（TEMED）4N，N亚甲基双丙烯酰胺（交联剂，简称Bis）5过硫酸铵（聚合用催化剂）6试剂 A（pH 8.9）：36.6g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）和 48ml 1mol/L HCl 混合加水至100ml7试剂 B（pH 6.7）：5.98g Tris和 48ml 1mol/L HCl混合加水至 100ml8电极缓冲液：6.0g Tris和 28.8g 甘氨酸混合加水至 1000m

9、l，用时稀释 10 倍。9指示剂：0.05%溴酚蓝101 mol/L HCl11培养基（1）细菌培养基（100 ml）牛肉膏 0.5%、蛋白胨 1、NaCl 0.5%、pH 7.07.2、琼脂 1.5%（2）-淀粉酶发酵培养基（1L）KH2PO41.7 g(NH4)2SO42.6 gK2HPO45.7 g可溶性淀粉10 gpH 7.0 7.212考马斯亮兰快速染色法（1）染色液：考马斯亮兰 G250 10 mg，加 95乙醇 5 ml 溶解，加 85H3PO4 10 ml，加水至 100 ml，过滤，配好的溶液颜色为棕红色，若为兰色应继续加入 H3PO4至溶液变为棕红色为止；（2）固定液：甲醇

10、:水:冰醋酸=4.5:4.5:1；3（3）脱色液：7冰醋酸溶液。六、实验操作六、实验操作1 1、-淀粉酶的发酵及淀粉酶的发酵及 -淀粉酶提取淀粉酶提取将枯草杆菌 10035 接入细菌培养基斜面，30下培养 24 h（活化），然后以两接种环的量接入 50 ml/250 ml-淀粉酶发酵培养基，在30、100110 rpm摇床培养 48 小时，取出，3000 rpm 离心 10 min，弃沉淀，上清液加入 2 倍体积的冷乙醇，混均，放入冰箱冷冻室静置 1 小时。然后，离心（3000 rpm）10 min，弃上清液，加入1 ml（Tris10 mmol/L，pH 8.0）缓冲液溶解蛋白质。然后以每4

11、0l 为一个样品。40l 样品加入 10l 溴酚兰指示剂。即可点样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。2 2、电泳、电泳（1）安装电泳槽（参见图3-1）先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。通过硅胶带将两块玻璃板紧贴于电泳槽（玻璃板之间留有空隙），两边用夹子夹住。将 1的琼脂糖融化，冷至 50左右，用吸管吸取热的 1琼脂沿电泳槽的两边条内侧，加入电泳槽的底槽中，封住缝隙，冷后琼脂凝固，待用。（2）凝胶的制备分离胶的制备分离胶的制备称取 Acr 3.2g，Bis 16mg，过硫酸铵 16mg 一起置于灯泡瓶中，然后加入试剂A 2ml，水 14ml（本实验所用的分离胶浓度为20），摇匀，使其溶解，然后用水

12、泵或泵抽气10 分钟，随后再加入 TEMED2 滴（滴管内径小于 2mm），混匀。用吸管吸取分离胶，沿壁加入垂直平板电泳槽中，直至胶液的高度达电泳槽高度的2/3 左右，上面再覆盖一层水，在室温下静置 3060 分钟即可凝聚，凝聚后，用小滤纸条吸去表面的水份。浓缩胶的制备浓缩胶的制备称取 Acr 0.12g，Bis 6mg，过硫酸铵 16mg，试剂 B 0.4ml，水 2.8ml（本实验所用的浓缩胶浓度为 34），摇匀，抽气，随后再加入TEMED1 滴，混匀。用吸管吸取浓缩胶加到分离胶的上面，直至浓缩胶的高度为1.5cm，这时将梳板插入，注意梳齿的边缘不能带入气泡，在室温下静置 3060 分钟，

13、观察梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时，浓缩胶即凝聚完成。凝聚后，将梳板拔去，立即用电极缓冲液冲洗孔格（此步骤很重要！因为取出梳板后，梳板上面吸附的和胶顶部少量未聚合完的丙烯酰胺会流入孔格内，再慢慢聚合，使孔底不平，将影响电泳条带的形状不整齐）。（3）加样及点样将带有溴酚兰指示剂的样品（50 l）用加样器向加样孔中加入30 40 l，再用滴管小心加入少量电极缓冲液，使充满梳孔。然后通电，开始电泳（注意电极，上槽为负、下槽为4正）。电压为 60 V 到终点。溴酚兰指示剂泳动至离凝胶前沿1 cm 处时，关掉电源，取出凝胶，准备染色。（4）染色先将凝胶板放入固定液中过夜，然后取出放入考马斯亮兰染液中

14、，染色50 分钟，显带后取出，放入脱色液中脱色至背景无色，条带清晰为止。（5）活性染色将凝胶板取出放入 1淀粉水溶液中浸 3 h，然后放入恒温箱保温（30）2 h，取出，用约 0.3%的 I2液显带后，与考马斯亮兰相比较，确定-淀粉酶带。七、思考题七、思考题提取-淀粉酶时为什么要用冷乙醇？5实验三实验三钼酸铵比色法测定果糖含量钼酸铵比色法测定果糖含量一、实验目的一、实验目的学习钼酸铵比色法测定果糖含量的基本原理及操作方法。二、实验原理二、实验原理酸性条件下钼酸铵与果糖能生成蓝色复合物，可在650 nm 波长下比色测定。在一定糖浓度范围内，所形成的蓝色深浅与含糖量成正比，糖浓度的适用范围为101

15、00 g/ml。本法对果糖测定较灵敏、快速。但对蔗糖也有显色反应，在相同浓度范围内也成直线关系，但呈色较果糖浅，光密度值也较果糖低。对葡萄糖在相同浓度范围内几乎没有显色反应，所以不能用于葡萄糖的测定。三、实验试剂和仪器三、实验试剂和仪器1试剂（1）果糖标准溶液(0.1 mg/m1)：取真空干燥（55）24 小时的果糖 0.100 g，溶于 100 m1水，即为 1 mg/m1 的果糖溶液。再稀释 10 倍即为 0.1 mg/m1 的果糖标准溶液。（2）显色剂I 液：取 140 m1 浓硫酸加入到 860 m1 蒸馏水中。液(16钼酸铵)：取 80 g 钼酸铵溶于水中，定容到500 m1。使用前

16、，I 液和液等量相混即成显色剂。（3）待测样品：浓度在2040 g/ml2仪器S54 紫外分光光度计四、操作方法四、操作方法1.1.制作标准曲线制作标准曲线取 0.1 mg/m1 果搪标准溶液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 和 1.0 ml 于各试管中，用蒸馏水补足到 2 m1，然后加人 4 ml 显色剂，摇匀后放入 80水浴中保温 30 分钟，冷却后于 650nm 处测定其 OD 值。以果糖量为横坐标，相应的光密度值为纵坐标绘制标准曲线。2.2.样品的测定样品的测定取 2 m1 待测样品，加入4 m1 显色剂，其余同前述操作过程，最后测其OD650，并通过标准曲线查出样品中果糖

17、的含量。五、思考题五、思考题在绘制标准曲线中，如何保证曲线的精度及准确度？6实验四实验四脂肪的定量测定脂肪的定量测定索氏（索氏（SoxhletSoxhlet）提取法）提取法一、实验目的一、实验目的学习和掌握脂肪提取的原理和测定方法熟悉和掌握重量分析的基本操作二、实验原理二、实验原理索氏抽提法分为油重法和残余法。本实验使用的为其中的残余法。即用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）借助于索氏提取器回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。用本法提取的脂溶性物质为脂肪类物质的混合物，其中含有脂肪、游离脂肪酸、磷酯、糖酯、固醇、芳香油、某些色素及有机酸等，称为粗脂肪。用该法测定样品

18、含油量时，通常采用沸点低于 50的有机溶剂作为脂肪溶剂。此时，样品中结合状态的脂类（主要是脂蛋白）有能直接提取出来。所以该法又称为游离脂类定量测定的方法。索氏脂肪抽提器为一套回流装置（如图5-1 所示），由小烧瓶、浸提管及冷凝管三者连接而成。浸提管两侧分别有虹吸管及通气管，盛有样品的滤纸斗（包）放在浸提管内，溶剂（乙醚或石油醚）盛于小烧瓶中，加热后，溶剂蒸汽经通气管至冷凝管，冷凝的溶剂再滴入浸提管，浸提样品。浸提管内溶剂越积越多，当液面达到一定高度，溶剂及溶于溶剂中的粗脂肪经虹吸管流入小烧瓶中。流入烧瓶的溶剂由于受热而气化，气体至冷凝管再次冷凝而滴入浸提管内，如此反复提取回流，将样品中的粗脂肪

19、提尽并带到小烧瓶中。最后，将小烧瓶中的溶剂蒸去，烘干，其增加的重量即为样品中粗脂肪的含量。三、实验试剂三、实验试剂1.样品的准备称取样品的重量根据材料中脂肪的含量而定（参考表一）。通常脂肪含量在 10%以下的，称取样品 10 20 克。脂肪含量为 50 60%的，则称取样品 2 4 克。表一 几种干的植物种子和种仁中油脂的百分含量样品向日葵种籽向日葵种仁蓖麻种籽蓖麻种仁芝麻种籽油菜种籽含油量23.5 45.040.0 67.845.1 58.550.7 72.046.2 61.041.1 42.9样品大豆种籽油桐种仁玉米谷粒小麦谷粒稻子谷粒豌豆种籽含油量10.0 25.047.8 68.93.

20、0 9.01.6 2.61.3 2.40.7 1.97花生种仁40.0 60.7将样品在 80100烘箱内烘去水分，一般烘 4 小时，烘干时要避免过热。样品颗粒不宜太大，一般要在研钵中研碎样品。样品若是液体，应将一公平体积的样品滴在滤纸上，在 6080烘箱内烘干后，再装入索氏脂肪抽提器中提取。本实验使用花生种仁：4g/组。2.石油醚：CP，沸程 6090，50 ml/组。四、实验仪器四、实验仪器1电子天平操作指南：插上电源，启动“ON/OFF”开关，将称量纸放于称量盘上，按一下回零档“TARE”，使屏幕上显示 0.0000，推开玻璃门，轻轻将样品置于称量盘上，关上玻璃门，待屏幕上显示的数字稳定

21、后记录下来，即为样品的重量（g）。注意每次称量前都必须按一下回零档“TARE”，使屏幕上的显示 0.0000；称量室内尤其称量盘上必须保持清洁、干燥，若有药品撒落，立即用软毛刷清理干净。2数显恒温水浴锅操作指南：向水浴锅中注蒸馏水，盖好盖子，插上电源。先将“设定/测温”选择开关置于“设定”档，调节“温度设定”旋钮使屏幕上的温度显示为所需要的温度（本实验为88），此时红灯亮，表示仪器正在加热。然后将“设定/测温”选择开关置于“测温”档，此时屏幕上的温度显示为实际水温，当实际水温太到设定的温度时，仪器会自动恒温，此时绿灯亮。在整个实验之前应该将恒温水浴锅的水温调节好。3索氏提取仪（50 ml）由冷

22、凝管、抽提管和平底烧瓶三个部件组成，通过标准磨口相对接。搭建装置：用铁架台、2 只十字夹、2 只龙爪、2 根乳胶管和 1 套索氏提取仪来搭建装置，固定点分别是平底烧瓶的颈部和提取管的颈部，索氏提取仪的高度以平底烧瓶的瓶颈略高于恒温水浴锅的液面为宜。注意：用龙爪夹玻璃仪器时，要先用手找好感觉，不能太紧（那样会夹破）也不能太松（那样会打滑，致使索氏提取仪的标准磨口接口漏气）。4其他器材烘箱、中速滤纸、不锈钢镊子、药勺、铁架台、十字夹、龙爪、手套、乳胶管五、实验步骤五、实验步骤准备工作：准备工作：将恒温水浴锅的水温事先加热好。1 1折滤纸斗折滤纸斗戴上手套，取一张滤纸（11cm），两次对折后卷成筒状

23、，再将其一端折起来封死，便做成了滤纸斗。2 2称样称样先将滤纸斗在电子天平上称重（记作a），取出滤纸斗，用药勺取大约4g 样品装入滤纸斗中，然后把开口处折起来封死。调整滤纸斗的高度，使其放在抽提管中时略低于虹吸管的上弯头处。将装好样品的滤纸斗放在电子天平上称重（记作b）。3 3提取提取按照老师的示范操作，将索氏提取仪安装好（注意高度），用镊子把装有样品的滤纸斗放入提取管内，从上端冷凝管向平底烧瓶中注入约50 ml 的石油醚，检查一下，确保所有接口均对接完好（不漏气，不打滑），打开自来水（冷凝用），将索氏提取仪放入恒温水浴锅中加热。提取时间大约2 个小时，记录提取的频率（虹吸一次的时间，以1 小

24、时虹吸 3-5 次为宜）和总提取时间，计算提取的次数。（附：一般样品的提取时间应该为1224 小时，由于8实验时间限制，我们的提取率只能达到80左右。）4 4回收石油醚回收石油醚提取 2 小时后，当石油醚在提取管中的液面即将达到虹吸管的上弯头处时，从水浴锅中取出索氏提取仪，室温冷却510 min 后，用长镊子取出滤纸斗，在通风处使乙醚挥发。然后取下平底烧瓶，将提取管的下端口插入回收瓶中，倾斜装置，提取管中的石油醚会流入回收瓶中，达到回收的目的。再装上平底烧瓶，继续放入恒温水浴锅中加热直至冷凝管下端无石油醚滴下，表明平底烧瓶中的石油醚已经蒸干。取下平底烧瓶，回收提取管中的石油醚。5 5称重称重待

25、石油醚挥发之后，将滤纸斗置于1052的烘箱中干燥 2h，然后称重（记作 c）。实验结束后，将平底烧瓶、提取管用洗涤剂反复清洗3 次，并彻底清洗所使用过的所有玻璃仪器，放在桌面上，请老师验收。六、计算六、计算样品粗脂的含量=（粗脂的重量/样品的重量）100式中：粗脂的重量=b-c样品的重量=b-a a：滤纸斗的重量（g）b：滤纸斗和干样的重量（g）c：滤纸斗和抽提后烘干残渣的重量（g）七、思考题七、思考题1.如何利用残余法测定花生种仁中的粗脂肪含量？2.测定过程中为什么需要保证样品、抽提器及抽提用有机溶剂无水？3.测定样品粒子粗细有什么要求？9实验五实验五蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定微量微量

26、 K K 氏（氏（KjeldahlKjeldahl）定氮法）定氮法一、实验目的一、实验目的学会用 K 氏定氮法测定蛋白质的含量的基本原理和方法学会使用 K 氏定氮仪二、实验原理二、实验原理凯氏定氮也被称为克氏定氮。样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。然后经强碱碱化使得硫酸铵分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液中被中和的程度，即可算出样品的含氮量，若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH+H2SO4NH22NH3+H2SO4(NH4)2SO4+2NaOH2CO2+3SO2+4H2O+NH3(NH4)2SO42H2O+Na2SO4+2NH3(1

27、)(2)(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入 CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸（加混合指示剂）溶液，氨与溶液中的氢离子结合成铵离子，使溶液中氢离子的浓度降低，指示剂颜色发生变化，然后用强酸滴定。三、实验器材三、实验器材1 卵清蛋白和其它含蛋白质样品2 K 氏定氮仪3 电炉4 锥形瓶 100 ml（3）5 量筒 100 ml（1）6 表面皿 5 cm（3）7 酸式滴定管 25 ml（1）（侧管为 2 ml，可读至 0.02 ml）8 K 氏烧瓶 50 ml（3）9.小漏斗 4 cm（3）10玻璃珠四、实验试剂

28、四、实验试剂卵清蛋白溶液：2 g 卵清蛋白溶于 0.9%NaCl 溶液并稀释至 100 ml。如有不溶物，离心上清液备用。1 浓硫酸（A.R.）2 硫酸钾硫酸铜混合物：硫酸钾3 份与硫酸铜 1 份（质量比）混合研磨成粉末。3 50%氢氧化钠溶液：50 g 氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100 ml。4 2%硼酸溶液：2 g 硼酸溶于蒸馏水，稀释至100 ml。5 混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液和 0.1%甲烯蓝乙醇溶液按体积比4:1 混合。6 0.01 mol/L 标准盐酸溶液五、操作方法五、操作方法101 1 消化消化将两个 50 ml 克氏烧瓶编号，一只烧瓶内加1.0 ml 蒸馏水，为空白

29、实验；另一烧瓶内加入 1.0 ml 样品液（卵清蛋白液）。然后各加硫酸钾硫酸铜混合物约 20 mg 及浓硫酸 2 ml。烧瓶口插一小漏斗（作冷凝用），将烧瓶置于通风橱内的电炉上加热消化。开始应控制火力，勿使瓶内液体冲至瓶颈，待瓶内水气蒸完，硫酸开始分解释放出 SO2白烟后，适当加强火力，直至消化液透明，并呈淡绿色为止。（约 23 小时）冷却，准备蒸馏。2 2 定氮仪的洗涤定氮仪的洗涤如图 2-1 所示，打开夹子 7，使冷凝水流入蒸汽发生器内球体2/3量后关闭夹子7。将煤气灯放到蒸汽发生器2 下面加热，此时夹子 3 和 8 处于关闭状态。蒸汽通过反应室1 到冷凝器 4 外腔，凝成水滴洒落于盛混合

30、液的锥形瓶中。如此用蒸汽洗涤反应室约10分钟后，一曲锥形瓶，放上另一个盛硼酸 指示剂混合液的锥形瓶，将瓶倾斜，以保证冷凝管末端连接的小玻璃管完全浸于液体内。继续蒸馏 1-2 分钟。观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色，则表明反应室内部已经干净。移动三角瓶使混合液离开管口约1cm，继续通气 1 分钟，最后用水冲洗管外口，移开煤气灯，准备下一步把消化液加入反应室内。3 3 蒸馏蒸馏开启夹子 8，放掉蒸汽发生器中的热水，然后关闭夹子 8，开启夹子 7，使冷水流入蒸汽发生器内球体 2/3 量后关闭夹子 7。这一步操作对加样时避免样品经出样口10 抽出反应室是很关键的。开启夹子 3，将消化好的样品液自加样

31、漏斗口 3 加入反应室 1，关闭夹子 3。另取一只锥形瓶，加 20 ml 硼酸溶液和 2 滴混合指示剂，将锥形瓶斜接于冷凝管下端。取50氢氧化钠溶液 10 ml 放入小漏斗中，微开夹子3，使氢氧化钠溶液慢慢流入反应室，当未完全流尽时，关闭夹子3，向小漏斗加入约3 ml 蒸馏水，再微开夹子3，使氢氧化钠溶液完全流入反应室，关闭夹子3。剩余的蒸馏水留在小漏斗中作水封。将煤气灯移到蒸汽发生器下面加热，锥形瓶中溶液由葡萄紫色变成鲜绿色，自变色起开始计时，蒸馏 5 分钟，然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约 1 cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外周，继续蒸馏 1分钟。移去锥形瓶，用表面皿覆盖，准备滴定。4

32、 4 滴定滴定用 0.01 mol/L HCl溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至成淡葡萄紫色，记录所耗HCl 溶液量。计算公式如下：m c(A B)14.008100V式中：m：样品中含氮的质量，即100 ml 样品中的含氮量（mg）A：滴定样品消耗的 HCl 溶液体积（ml）11B：滴定空白消耗的 HCl 溶液体积（ml）V：相当于未稀释样品的体积（ml）c：HCl 的浓度（mol/L）14.008：氮的原子量100：100 ml 样品计算结果为样品总量，欲求得样品中蛋白氮含量，应将总氮量减去非蛋白氮即可。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品蛋白氮乘以6.25 即得。六、思考题六、思考题在本实

33、验中，定氮仪的洗涤这一步起什么作用？缺少了它行不行？为什么？12实验六实验六氨基酸的硅胶氨基酸的硅胶 G G 薄层层析薄层层析一、实验目的一、实验目的了解硅胶 G 薄板的制作方法掌握硅胶 G 薄板层析的原理和技术二、实验原理二、实验原理薄板层析是一种微量而快速的层析方法。该方法是把吸附剂或支持剂（例如硅胶或硅藻土）涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品在各个成分分离，最后进行定性鉴定和定量测定。因为层析是在吸附剂的薄层上进行的，所以称为薄层层析。它是利用吸附剂在各种溶剂中对不同化合物吸附能力的强弱不同而进行分离。三、器材与试剂三、器材与试剂1 1

34、 器材器材（1）烧杯 50 ml（1）（2）玻璃板 15 cm7 cm（1）（3）层析缸 20 cm20 cm（1）（4）研钵（1）（5）微量注射器 10 l（1）（6）吸管 2.0 ml（1）、5.0 ml（1）（7）量筒 100 ml（1）（8）电子天平（9）电吹风（10）烘箱2 2试剂试剂（1）混合氨基酸溶液（蛋白质水解液，经活性炭脱色、浓缩、干燥等处理后的氨基酸干粉或由配制而成的混合氨基酸溶解于10%异丙醇中。用稀氨水调至 pH7.0 左右）（610mg/ml）。冰箱保存备用。（2）层析溶剂系统：V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:5。充分混匀后，静置，除去下层的水，留下的上

35、层液即为所需层析溶剂。（3）显色剂：0.5%茚三酮-正丁醇溶液（4）0.3%聚乙烯醇溶液：称3 g 聚乙烯醇，溶解在1000 ml 重蒸馏水中，可加热助溶。（5）各种氨基酸标准溶液（1 mg/ml）四、实验操作四、实验操作1 1 薄板的制备薄板的制备取 15 cm7 cm 的玻璃板一块，洗净，烘干，平放于水平台上。取4 g 硅胶 G，放在13小研钵中，加入 15 ml 0.3%聚乙烯醇溶液（亦可用 15 ml 蒸馏水加 3 ml 丙酮溶液）搅成匀浆，倒在玻璃板上，前后倾斜玻璃板，使之均匀铺于玻璃板上，平方晾干（亦可放在 40烘箱烘干），待水分蒸发后，置于105烘箱中，活化 30 分钟。薄层厚度

36、约为 0.25 mm，备用。2 2 点样点样在距离薄层板一端约 1 cm 处用铅笔轻轻划一道直线，作为层析的起始点。用微量注射器吸取 510l 样液和标准液，分别滴加于这条直线上，边点边用电吹风吹干。3 3 展层展层将点好样的薄层板置于层析缸中，使下端浸在展开剂中0.30.5 cm（注意：展开剂不能超过点样起始点）。展开剂借助毛细管作用，由下而上扩展。当展开剂距离薄层板顶端大约 2 cm 时，取出薄层板。放置通风处自然干燥，或用吹风机吹干。4 4 显色显色在溶剂挥发后，在薄钣上均匀喷上显色剂，再次放置通风处，等完全干燥后，便呈现出蓝紫色斑点。对照标准样的位置，便可知道混合氨基酸溶液中所含的氨基

37、酸种类。五、思考题五、思考题本实验中，哪些因素会影响结果的准确性？请分别作出说明。14实验七实验七-淀粉酶活力的测定淀粉酶活力的测定一、实验目的一、实验目的掌握测定酶活力的实验原理、实验方法以及其计算二、实验原理二、实验原理-淀粉酶是工业上使用最广泛的酶制剂之一。-淀粉酶能将淀粉分子链中的-1,4-葡萄糖苷键切断，使淀粉分子成为长短不一的短链糊精以及少量麦芽糖和葡萄糖，因此酶反应过程中淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，以颜色消失的速度计算酶活力。三、器材与试剂三、器材与试剂1 1 器材器材（1）容量瓶（2）恒温水浴锅（3）比色皿（4）分光光度计2 2 试剂试剂（1）原碘液：称取碘（I2）1

38、1g，碘化钾（KI）22g，先用少量蒸馏水完全溶解，然后定容至 500ml，贮存于棕色瓶中。（2）稀碘液：吸取原碘液 1ml，加 10g KI，用蒸馏水溶解并定容至 250ml，贮存于棕色瓶中。（3）2%可溶性淀粉：称取 2g 可溶性淀粉，与少量冷蒸馏水混合成薄浆状，然后加入沸蒸馏水，边加边搅，最后定容至100ml，此溶液当天配当天使用。（4）pH 6.0 磷酸氢二钠柠檬酸溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）11.3075g，柠檬酸（C6H8O7H2O）2.0175g，用 240ml 蒸馏水溶解，调 pH 至 6.0，然后定容至 250ml。四、实验操作四、实验操作1 1待测酶液的

39、配制待测酶液的配制准确称取干酶粉 5mg，用 pH 6.0 的磷酸缓冲液溶解成 1mg/ml 酶液。用时稀释 20 倍，则每毫升酶液量为 50g。2 2酶活力的测定酶活力的测定取 2%可溶性淀粉 2.0 mL，加入磷酸盐缓冲液(pH6.0)1 mL，40预热 5 min，加入适度稀释的酶液 1 mL，40反应 30 min，加入 0.5M 的乙酸溶液 10 mL 终止反应。吸取反应液 1mL 加入 10 mL 工作碘液显色，在 660 nm 处测定光密度，以 1 mL 水代替 1 mL 酶液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。五、计算五、计算本实验的酶活力单位定义为：在40条件下，30

40、 min 内水解 1 mg 淀粉（2%）所需15的酶量为一个酶活单位（U）。酶活力(U/mL)R0 R50 DR0式中 R0、R 分别表示对照和反应液的光密度，D 为酶的稀释倍数，调整D 使（R0-R）/R0在 0.2-0.7 之间。六、思考题六、思考题本实验采用分光光度法测取酶的活力。它的原理是什么？16实验八实验八SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量一、实验目的一、实验目的了解 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理，并学会这种方法测定蛋白质的相对分子量二、实验原理二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这

41、些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。SDS 是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白的相对分子质量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以用圆盘电泳，也可用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点

42、一致，便于比较。三、实验器材三、实验器材1.直流稳压电泳仪2.垂直平板电泳槽3.移液器（1.0ml、200l、20l）4.微量注射器（20l）5.烧杯、试管、滴管、直尺四、实验试剂四、实验试剂1.凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水至 100ml。外包锡纸，4冰箱保存，30 天以内使用。2.分离胶缓冲液（A 液）：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。18.15g Tris（三羟甲基氨基甲烷），加约 80ml 重蒸水，用 1mol/L HCl 调 pH 到 8.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，4冰箱保存。3.浓缩胶缓冲液（B

43、液）：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。6g Tris，加约 60ml 重蒸水，用 1mol/L HCl 调 pH 到 6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，4冰箱保存。4.10SDS，室温保存。5.两类样品缓冲液：（1）2 倍还原缓冲液（2reducing buffer）0.5mol/L Tris-HCl，pH 6.82.5ml甘油2.0ml质量浓度 10 SDS4.0ml质量浓度 0.1溴酚蓝0.5ml-巯基乙醇1.0ml总体积10ml（2）2 倍非还原缓冲液（2non-reducing buffer）重蒸水1.0ml0.5mol/L Tris-HCl，pH 6.82.

44、5ml甘油2.0ml质量浓度 10 SDS4.0ml17质量浓度 0.1溴酚蓝0.5ml总体积10ml6.电极缓冲液，pH 8.3Tris 3g，甘氨酸 14.4g，SDS 1.0g，加重蒸水至 1000ml，4冰箱保存。7.低相对分子质量标准蛋白，开封后溶于200l 重蒸水，加200l 2 倍样品缓冲液（非还原缓冲液），分装20 小管，-20保存。临用前沸水浴35 分钟。其相对分子质量（Mr）如下：标准蛋白质兔磷酸化酶 B牛血清白蛋白兔肌动蛋白牛碳酸酐酶胰蛋白酶抑制剂鸡蛋清溶菌酶Mr97,40066,20043,00031,00020,10014,4008.质量浓度为 10过硫酸铵：此溶液需

45、临用前配制9.1.5琼脂：1.5g 琼脂粉加 100ml 重蒸水，加热至沸腾，未凝固前使用10.染色液：0.25g 考马斯亮蓝 R250，加入 91ml 50甲醇，9ml 冰醋酸11.脱色液：50ml 甲醇，75ml 冰醋酸与 875ml 重蒸水混合。12.待测蛋白质：木瓜蛋白酶五、操作步骤五、操作步骤1.将垂直电泳槽装好，用 1.5琼脂趁热灌注于电泳槽平板玻璃的底部，以防漏。（具体操作可参考实验三实验三）2.分离胶的选择和配制方法（1）按照蛋白质不同的相对分子质量选用不同浓度的分离胶。蛋白质相对分子质量的范围5105（2）不同分离胶的配制方法分离胶的浓度重蒸水/ml1.5mol/L Tris

46、-HCl（pH8.8）/ml质量浓度为 10SDS/ml凝胶储备液（Acr/Bis）/ml质量浓度为 10过硫酸铵/lTEMED/l总体积/ml200.752.50.16.650510152.352.50.15.050510123.352.50.14.050510104.052.50.13.3505107.54.852.50.12.550510分离胶的浓度20301520101551025183.分离胶的灌制根据待测蛋白质样品的相对分子量选择合适的分离胶浓度，本实验选用木瓜蛋白酶为待测相对分子质量的样品，用15的分离胶。在 15ml 试管中依次加入重蒸水 3.35ml、1.5mol/L Tri

47、s-HCl（pH8.8）缓冲液 2.5ml、10SDS 0.1ml、凝胶储备液 4.0ml、10过硫酸铵 50l 和 TEMED 5l，由于加入 TEMED 后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃板之间灌注，留出梳齿的齿高加 1cm 的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约3060 分钟，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。4.浓缩胶的配制和灌制一般采用 5的浓缩胶，配制方法：重蒸水2.92ml、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH6.8）1.25ml、10SDS 0.0

48、5ml、凝胶储备液0.8ml、10过硫酸铵 25l 和 TEMED 5l，在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插上梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约 30 分钟）。5.样品的制备（1）标准蛋白样品的制备取出一管预先分装好的 20l 低相对分子质量标准蛋白，放入沸水浴中加热35 分钟，取出冷至室温。（2）待测蛋白样品的制备a.10l 木瓜蛋白酶加入 10l 2 倍还原缓冲液b.10l 木瓜蛋白酶加入 10l 2 倍非还原缓冲液以上 a、b 两管均同标准蛋白样品一样，在沸水浴中加热35 分钟，取出冷至室温。6.电泳（1）待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤

49、加样孔数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液。（2）用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。（3）接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调节电流至 2030mA 并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。7.染色与脱色小心将胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。加入染色液染色 1 小时，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。8.相对分子质量的计算用直尺分别量出标准蛋白、待测蛋白区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率：相对迁移率(Mr)样品迁移距离(cm)染料迁移距离(cm)

50、以标准蛋白质 MW 的对数对相对迁移率（Mr）作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品19的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。六、思考题1.在实验中，使用还原缓冲液和非还原缓冲液所得到的结果是否相同？为什么？2.本实验是如何对蛋白质分子量进行检测的？20实验九实验九 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 DNADNA 的提取的提取一一.实验目的实验目的通过对枯草芽孢杆菌DNA 的提取实验了解和掌握一般的DNA 分离纯化方法。二二.实验原理实验原理用十二烷基硫酸钠（SDS）破坏枯草芽孢杆菌细胞，得到高粘度的悬浮液，在高氯酸盐存在下，以氯仿-异戊醇脱蛋白，经离心分成三层。最上层为核酸液，用乙醇沉淀 D