总结以下SDS-PAGE电泳常见问题的分析.pdf

《总结以下SDS-PAGE电泳常见问题的分析.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《总结以下SDS-PAGE电泳常见问题的分析.pdf（3页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？在 SDSPAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 TrisHCL 缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 CL 离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电

2、场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2.样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。1）还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT（或 Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样 Buffer，离心，沸水煮 5min，再

3、离心加样。2）带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul 样品缓冲液中 10ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温 30min。3）非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1SDS 沸水中煮 3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3.SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择 p

4、H6.7，分离胶选择 pH8.9，选择 trisHCL 系统，TEMED 与 AP：AP 提供自由基，TEMED 是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4.提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三

5、种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。5.“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。6.“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7.为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。8.为什么带出现纹理现象？主

6、要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。9.什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA 来阻止还原剂的氧化。10.为

7、什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer；降低分离胶的浓度。11.为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确（6.7）；适当降低电压；12.为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上，可电流却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮

8、）。处理办法：电泳槽正确装配即可。13.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。14.凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在 30MIN-1H 内凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED，APS 剂量不够或者失效。APS 应该现配现用，TEMED 不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是 APS 和 TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15.电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 PH 选择错误，即缓冲

9、系统地 PH 和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。2.结果显示不清楚或没有显示出条带？3.我在跑电泳的过程中，上样 BUFFER 和样本不能压成一条细线，很粗，而且好像甘油和溴酚蓝分离，很难看。我用的浓缩胶是 4%的，分离胶是 15%的。有没有什么解决办法？换换上样缓冲液，你试一试我用的配方：0.5M Tris-Hcl.pH6.8 2ml 甘油 2ml 20%SDS 2ml 0.1%溴酚蓝 1.0ml 2-巰基乙醇 1.0ml 重蒸水 2.0ml 不知道你的电泳缓冲液是不是新的，SDS-PAGE 中的电极缓冲液对电泳效果有影响，如果你的胶浓度改成 4%或 5%以后仍出现你说的这种情况，可能需要更换电泳缓冲液，用新配的应该就不会有问题了。另外，溴酚蓝前面的黄色印迹是甘氨酸，不是甘油。甘油和溴酚蓝是不可能在电泳过程中分离的。我们实验室 3.9%的积层胶的配方:Acry:Bis(30:0.8)1.3ml 4*tris.cl/sds ph=6.8 2.5ml 水 6.1ml 10%过硫酸胺 0.05ml TEMED 0.01ml 4.我做的 SDS 电泳结果没有出来条带，很模糊，做了几次都是这样为什么？Marker 显示出来了，但是样品没有，是不是取样时没有取上清液，含有大分子颗粒，导致条带模糊。5.蛋白质电泳实验技术郭尧君 6.