大连理工大学-生化实验报告——模版(新)(共8页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上说明：下面黄色标注的为必须改的地方，其他地方自己酌情修改。2013年生物化学实验B实验报告姓 名： 学 号： 实验时间： 2013年10月20日 实验分组： 第七组 组内成员： （） （） （） 任课教师： 小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、SDS-PAGE电泳法测定蛋 摘要 本实验通过从小牛肠中提取小牛肠碱性磷酸酶，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，并测定酶的活性。最后通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量.关键词 小牛肠碱性磷酸酶提取 酶活测定 考马斯亮蓝法 SDS-PAGE电泳法本实验分为三部分。先通过对牛小肠内膜的刮取，离心，

2、沉淀析出等方法，提取牛小肠碱性磷酸酶；然后用考马斯亮蓝G-250与碱性磷酸酶结合，利用紫外分光光度计在一定波长下测定结合物的吸收波长，根据其吸光度与蛋白质结合物的含量成正比的关系测定蛋白质含量，进而测定出蛋白质的比活力；最后，通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，分析所获得的电泳结果来推算出被测蛋白质分子量的近似值。1 实验部分1.1 试剂与仪器 1.1.1小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定 1、 试剂（1）正丁醇、丙酮（置-20冰箱保存）（2）1mol/L醋酸（HAC）、1mol/LNaOH、硫酸铵（3） 平衡缓冲液：0.01mol/LTris-HCL,PH 8.0,(含1.010-

3、3mol/LMgCl2和1.010-5mol/LZnCl2)。（4） 底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液（PH9.8，含0.510-3mol/LMgCl2）。（5） 酶的底物溶液：用底物缓冲液配制1510-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。（已加入底物缓冲液中） 2、仪器匀浆机、冷冻离心机、恒温水浴、紫外可见分光光度计、离心管、剪刀、载玻片、不锈钢盘、搪瓷盘、滤布、漏斗、分液漏斗、量筒、烧杯、移液枪、比色皿1.1.2考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1、 试剂考马斯亮蓝、实验小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定所得酶液、生理盐水2、 仪器分光光度计、分析天平、玻璃比色杯、试管及试管架、移液枪1.

4、1.3 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量1、 试剂1）30%丙烯酰胺（acrylamide,Acr）置棕色瓶。2） 分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCL缓冲液，pH8.8，已加入10%SDS。3） 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HCL缓冲液，pH6.8，已加入10%SDS。4） 10%过硫酸铵（AP）（小离心管装，提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必须的自由基，须新鲜配置。）5） TEMED（四甲基乙二胺）（小离心管装T，通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）6） 上扬缓冲液（小离心管装S）：称100mgSDS、2mg溴酚蓝、2g甘油，加

5、0.1mL巯基乙醇、2mL-。-5mol/LpH8.0Tris-HCL,加超纯水定容至10mL。7） 染色液：配置含0.1%考马斯亮蓝R250,40%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的染色液500mL，过滤后备用。8） 脱色液：500mL10%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的脱色液1000mL。9） 电泳缓冲液（含0.1%SDS，0.05mol/LTris，0.384mol/L甘氨酸pH8.3）.2、仪器电泳仪、电泳槽、制胶板、摇床、移液枪1.2 实验过程1.2.1小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定1、 酶的分离提纯1）取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮去小肠内粘膜，

6、放到盘子一角。2）统一将小肠黏膜液集中倒入匀浆机中，加1.5倍体积冰冷蒸馏水，高速匀浆15s，重复20次。3）缓慢加入（总体积）1倍体积的冰冷正丁醇，高速匀浆15s，重复20次。 每组领取60mL的匀浆液，放入离心管中（离心管装液量不能超过70%），用另一离心管用水配平（切记离心前连同离心管盖子一起用天平配平），在4条件下，10000rpm，离心15min（离心管对称放置）。4） 用滤布过滤去除杂质（滤饼），倒入分液漏斗中，静止分层（勿摇），去下层水相，用1mol/LHAc调pH到4.9。4，10000rpm，离心10min。5） 得到上清26.5mL，放入离心管中，用1mol/LNaOH调p

7、H至6.5，称取质量为溶液体积5%的硫酸铵1.33g(5g硫酸铵/100mL溶液)，加到离心管中溶解；再加0.47倍体积（12.45mL）冰冷丙酮，混匀，4（冰箱中）静置30min以上。4，10000rpm，离心10min。6） 上清液36.5mL中加入1.07倍体积（39.06mL）冰冷丙酮，4静置30min以上。4，10000rpm，离心10min。7） 取沉淀溶于2mL平衡缓冲液至全部溶解。置冰箱保存待用。2、底物处理 底物（对硝基苯磷酸二钠已溶于平衡缓冲液中）37水浴5min（注意：根据分光光度计使用情况，要检测前加热）3、 酶活检测1）将酶稀释10倍（配制取10L，溶于90L平衡缓冲

8、液中得到）2）紫外分光光度计检测条件：405nm波长，测定时间60s，取值2s，记录范围0.0-1.5。3）取2个2mL比色皿（0.5cm光程），加入1.5mL上述（2）加热的底物缓冲液，校对归零。4）将稀释10倍的酶液10L加到其中1个比色皿中（仪器外侧），用手堵住皿口。快速上下倒2次，放回分光光度计中，测定没动力学曲线。1.2.2考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1、 玻璃试管中加入5mL考马斯亮蓝。2、 在1.5mL离心管中，取上一实验得到的酶液分别稀释50、100、200倍。3、 各取100L加入到5mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5min以上，另各取100L生理盐水分别加入到5mL考马斯亮蓝

9、试管中。（观察蓝色，以浅蓝色为好）4、 紫外分光光度计检测条件：595nm波长5、 取2个比色皿（1cm光程）加入考马斯亮蓝（比色皿的2/3），分光光度计中校对归零。6、 将样品放入外侧比色皿中，读吸光值（得到医治蛋白浓度标准曲线范围内的度数即可，0.1-0.5之间）。7、 根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度（乘以相应稀释倍数即得原始酶液蛋白浓度，注意单位）1.2.3 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量1、 装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条（棱朝上，平铺），用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子（注意下面2个夹子要水平，两侧夹子离梳子底部1-0.5cm，表明分离胶加的位置）

10、，垂直放置在水平台面上备用。分离胶制备（浓度10%，制备量10mL）试剂用量H2O4.1mL30%丙烯酰胺3.4mL1.5mol/LTris-HCL缓冲液pH8.82.4mL10%过硫酸铵100LTEMED10L 2、制备分离胶：在小烧杯中按下表配置所需浓度的分离胶。注意：最后加入TEMED，应快速摇匀分离胶，向玻璃板间隙，沿着长玻璃板的内侧缓慢注胶，然后再用移液枪慢慢移动注入乙醇200L，以防止氧气进入胶内。15min后，分离胶和乙醇之间出现分界线，表明分离胶凝固，倒出乙醇。 3、制备凝缩胶：在小烧杯中按下表配置所需浓度的浓缩胶。浓缩胶制备（浓度5%，制备量6mL）试剂用量H2O3.4mL3

11、0%丙烯酰胺1.0mL0.5mol/LTris-HCL缓冲液pH6.81.5mL10%过硫酸铵60LTEMED8L注意：一旦加入TEMED，应快速摇匀浓缩胶，在已凝固的分离胶层上加浓缩胶，立即将梳子插入胶液顶部，避免进入气泡，放置约20min，待浓缩胶凝固。4、蛋白质样品处理（小离心管装B）：在1.5mL离心管中按1:1体积比例，加样品和上样缓冲液（200L:200L）。100加热3min使蛋白变性。5、浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子（注意不要产生气魄，即电泳泳道），将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液（内、外槽，查漏），缓冲液高过玻璃板凹面。6、用移液枪依次在泳道加样

12、(5个20L，4个40L)。（本组将marker置于第六泳道）7、电泳：连接正、负极，打开电源（稳压130V或电流50-60mA），开始时，电流控制在40A，样品进入分离胶后，缓慢升高电压至140V或电流50-60mA保持电压或电流强度不变。带溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳，需1.5h左右。8、剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，用金属片从玻璃两侧轻轻撬开。使板内进入空气，同时用水冲洗，取出凝胶板，将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中。加染色液，至摇床染色15min。9、脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，30min换1次脱色液，脱色至背景清晰。10

13、、观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。11、拍照电泳结果，用于完成实验报告。2 结果与讨论2.1 小牛肠碱性磷酸酶的酶活测定 碱性磷酸酶酶活定义：在37条件下，以每分钟催化水解1mol底物的酶量为一个酶活力单位。碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠，使之水稀释放出对硝基苯酚，后者在405nm光波长下有最大吸收，通过测定吸光值的变化率，可测知酚的生成量，从而计算出酶的活性单位。酶活力的计算：比活力（U/mg）= 1、由实验小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定中实验步骤可知，反应液的体积 = 稀释倍数 = 405nm波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数 = 所加酶液体

14、积 = 比色皿光程 = 2、405nm波长下的吸光值的变化率通过分光光度计测量得到酶动力学曲线（图1）可以得到，A/min=0.6179(根据图片，自己估算斜率，注意单位。)/看后删除说明： 图片均要用自己的。半栏图片宽为8.15厘米，高为4.45.5厘米之间，对于特别大的图可加大宽度。通栏图片宽度为16.3厘米，高为4.45.5厘米之间，图说为字号为小5号黑体字。/表注用小5号字，表字用6号字。图1.酶动力学曲线3、 蛋白质原始浓度C可由实验考马斯亮蓝法测定蛋白质含量获得考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于燃料结合法的一种。在一定蛋白浓度范围内（0.01-1.0mg/mL）,蛋白质-色素结

15、合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测量。通过实验，利用紫外分光光堆积测定稀释50倍的酶液读得吸光值为0.1478A，利用考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线（图2）及其标准曲线拟合解析式y=0.697x-0.007得稀释后的标准蛋白浓度为0.2221mg/mL。故蛋白质原始浓度C=500.2221mg/mL=11.105mg/mL图2.考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线4. 利用公式，计算比酶活 比活力（U/mg）= = =综上，通过实验测定小牛肠碱性磷酸酶的比活力是9.122U/mg。2.2 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量 在SDS-PAGE电泳中

16、，加入一定量的SDS，形成蛋白质-SDS复合物，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率取决于蛋白质的分子量大小，而其他因素对对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 通过进行实验SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量，观察获得的电泳结果（图3），可以测定蛋白的迁移率及条带。图3.电泳结果对照标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线（图4）及各低分子量蛋白的组成（图5），分析知，mark中出现了五条蛋白质标记线，根据其间距及参考文献中给出的mark泳道各条蛋白质标记线间距，可判定由上

17、到下mark泳道中的五条蛋白质标记线分别是牛血清白蛋白，兔肌动蛋白，牛碳酸杆菌酶，胰蛋白酶抑制剂及鸡蛋清溶菌酶。其中样品蛋白质标记线与兔肌动蛋白（43,000g/mol）和牛碳酸杆菌酶（31,000g/mol）迁移率相近，所以样品的分子量与牛血清白蛋白和兔肌动蛋白分子量相近，即样品的分子量大致为39,000g/mol. （这里自己判断，每个人视力不一样。）图4.用低分子量标准蛋白质所做的标准曲线图5.低分子量标准蛋白组成参考文献(可以自己调下顺序)1 Laemmli,U,K,Nature,227,680(1970)2 张龙翔等，生化实验方法和技术，人民教育出版社，北京（1981）3 考马斯亮蓝

18、法快速测定乳品中蛋白质含量.山东科学J.2011.24(6) 4 修志龙等.生物化学M.化学工业出版社.2008.孙士青等.5 栾雨时, 包永明.生物工程实验技术手册M.化学工业出版社.20056 许文涛等.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究.食品科学J. 2004,Vol.25.No.增The calf intestinal alkaline phosphatase of extraction and determination of enzyme activity、The mavericks coomassie brilliant blue method determina

19、tion of protein content、SDS-PAGE electrophoresis method to measure the relative molecular mass of proteins姓名Chemical Technology 1102Abstract The extraction of calf intestinal alkaline phosphatase from calf intestine, protein content was determined by Coomassie brilliant blue method, and determination of enzyme activity. Finally by SDS- polyacrylamide gel electrophoresis determination of relative molecular weight protein.Keywords Calf intestinal alkaline phosphatase extraction The determination of enzyme activity Kaumas brilliant blue method SDS-PAGE electrophoresis专心-专注-专业