(1.7.3)--微生物的遗传多样性遗传学.pdf

《(1.7.3)--微生物的遗传多样性遗传学.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《(1.7.3)--微生物的遗传多样性遗传学.pdf（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 收稿日期:201208;修回日期:20121022 基金项目:国家自然科学基金项目(编号：31100894),云南省应用基础研究计划青年项目(2012FD006),中国烟草总公司资助项目(编号：110201002023)和中国烟草总公司云南省分公司科技计划合作专项(编号：2010YN17)资助 作者简介:李娟,助理研究员,博士,研究方向：微生物系统发育与进化。Tel:0871-5033805;E-mail:liuxulj_ 通讯作者:张克勤,教授,博士,研究方向：微生物分子生物学。Tel：0871-5034878;E-mail: 网络出版时间:2012-10-24 05:07:48 URL:

2、http:/ 微生物的遗传多样性 摘要:微生物是生物圈中不可或缺的重要组成部分,维系着自然界生态平衡。随着分子生物学技术的发展,微生物遗传多样性的研究从形态学水平、蛋白水平进入到了 DNA 水平。而高通量测序技术和宏基因组技术的发展,不仅为我们理解微生物的遗传多样性提供了更加丰富的信息和有力的证据,也对于合理利用生物资源、保护生态平衡等方面具有重要意义。文章就微生物遗传多样性研究的相关内容,如物种的分离鉴定、微生物群体遗传结构、物种形成以及系统发育和进化等方面的研究进展进行综述。关键词:遗传多样性;分子标记;群体遗传;物种形成;系统发育与进化 Genetic diversity of micr

3、oorganisms LI Juan,ZHANG Ke-Qin Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources,and Key Laboratory for Microbial Resources of the Ministry of Education,Yunnan University,Kunming 650091,China Abstract:Microorganisms are important components of the biosphere in maintaining the ecological

4、balance.With the development of molecular biology techniques,researches on the microbial genetic diversity have been developed from morphological and/or protein levels to molecular level.The development of high-throughout sequencing and metagenomics technology not only provide more abundant informat

5、ion and powerful evidence for understanding microbial diversities,but also have great significance for rational utilization and protection of biological resources.The advances in research on ge-netic diversity of microorganisms,such as separation and identification,population genetic structure,speci

6、ation,phylogeny,and evolution of microorganisms,were discussed in this paper.Keywords:Genetic diversity;Molecular marker;Population genetic structure;Speciation;Phylogeny and evolution 微生物包括细菌、真菌、放线菌、病毒等,是生物圈中不可或缺的重要组成部分,维系着自然界生态平衡。与高等动植物相比,微生物具有许多独特的多样性,包括分布的广泛性、生长繁殖速度的多样性、营养代谢类型的多样性以及生活方式的多样性等等。由于

7、微生物个体微小,不像动植物特别是珍稀动植物那样引人注目,加之人类对微生物多样性认识的不足,长久以来,微生物多样性的保护 1400 HEREDITAS(Beijing)2012 第 34 卷 问题一直未受到足够重视。然而,保护微生物多样性不仅能维系整个生物圈生态平衡,对我们全面认识生物界,揭示物种的起源与进化历史,贯彻人类可持续发展战略等诸多方面更是具有重要的理论和现实意义。而对于一些特殊环境中的微生物多样性的研究无疑将给人类带来巨大的效益,对解决现实社会中存在的诸多问题也具有重要意义。只有准确对微生物多样性进行评价,才能够更好地实现保护的目的。遗传多样性不仅作为评价生物资源多样性的重要依据,更

8、是物种多样性和生态系统多样性的基础。因此,对微生物遗传多样性的研究不仅有助于人们更清楚地认识现有微生物的资源状况,还能为合理保护和利用现有微生物资源提供理论指导。由于遗传信息储存在 DNA 序列中,故DNA 水平的遗传多样性长期以来一直受到关注。随着 DNA 分子标记技术的飞速发展以及生物基因组计划的开展,大大加快了微生物遗传多样性研究的步伐。1 微生物遗传多样性的研究方法及保护 1.1 微生物遗传多样性研究方法 遗传多样性的研究方法是随着生物学研究层次的不断提高和实验手段的不断改进而逐步发展起来的。较早时候,人们主要依赖形态学特征的认知,并通过大量个体杂交实验研究微生物的多样性。随后,同工酶

9、电泳分析技术的发展,让人们从蛋白质水平对物种遗传多样性进行探讨。但进行蛋白电泳分析对样品的要求较高,且分辨率具有一定的限度,无法检测编码蛋白基因的同义突变。因此,使用蛋白电泳技术对物种遗传多样性的研究越来越少。随着分子生物学技术日新月异的发展,DNA 水平的遗传多样性研究则越来越受到青睐,这使得微生物遗传多样性的研究技术从形态学水平、蛋白质水平深入到了 DNA 水平。目前,分子水平的遗传多样性研究方法经历了三代分子标记技术的发展,包括限制性片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)1,随机扩增多态性 DNA(Randomly

10、 ampli-fied polymorphic DNA,RAPD)2,扩增片段长度多态性 AFLP(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)3,4,变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)和温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)57,微卫星 DNA(Microsatellite DNA)8,单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)9等方法。这些方法都被广泛用于微生

11、物遗传多样性研究中,并取得了不少的成果。而且已有不少综述性论文对上述研究方法的原理及研究进展进行了详尽的介绍,为我们认识遗传多样性及其生物学意义提供有价值的信息1012。但是,任何一种检测遗传多样性的方法都存在各自的优点和局限,迄今为止还找不到一种可以完全取代其他方法的技术。随着高通量测序技术的发展,如 Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI 公司的 SOLID 技术,人们可以用更低的测序费用获得更多的序列信息。这使得微生物的研究逐步从单个或者多个基因的研究层面拓展到了“组学”层面。而随着研究微生物的重要价值和意义逐渐被人们所认识,国际上许多国家

12、纷纷制订微生物基因组研究计划,为人们探索微生物世界提供了前所未有的契机。其中最为受到关注的当属人体微生物组计划(Human microbiome project,HMP)13和地球微生物组计划(Earth microbiome project,EMP)14。由中国科学家发起的“万种微生物基因组计划”(http:/ 志 着 我国在微生物基因组研究领域中也占据了一定的国际地位,同时也为我国自主知识产权的微生物基因资源的开发和产业化奠定了基础。完整基因组数据的获得为我们理解和评价微生物的遗传多样性提供了丰富的信息和有力的证据。在组学层面研究微生物方法中,宏基因组技术(Metagenome)无疑是目前

13、发展最为迅速的一种方 法1517。该方法不依赖于人工培养的微生物基因组分析,而是通过从特定环境样本中直接分离微生物群体的总 DNA,然后将 DNA 酶切或者超声打断处理,获得大片段的 DNA,并与载体连接,克隆到宿主细胞中进行表达,接着根据研究目的,筛选相应克隆测序,并进行序列分析。该方法极大的拓展了我们对生命的了解,能最大限度地挖掘微生物资源,第11期 李娟等:微生物的遗传多样性 1401 目前已经成为国际上生命科学研究和开发的热点和前沿。截至目前为止,已有上百种来自不同环境,如,土壤、海洋、一些极端环境等的样品被宏基因组测序,为微生物多样性研究提供了强大的数据支持。我国科学家对于宏基因组学

14、的研究虽有所涉猎,但仍需要拓宽研究领域,发展相关研究策略和技术,开展广泛的国际合作,使我国在宏基因组学研究领域中有所作为。目前,宏基因组学技术中最大缺陷是文库的表达问题,由于目前普遍采用的宏基因组建库载体包括粘粒、质粒和细菌人工染色体等,这些载体要么插入片段小,无法完整克隆复杂的基因簇,要么由于拷贝少而无法将所有的宏基因组 DNA 表达出来,从而降低了筛选的效率,因此,目前常采用富集培养手段来提高筛选效率。而序列分析技术和生物信息学工具,如 MEGAN 等18的不断进步以及一系列数据库的建立,为宏基因组的数据分析提供便利。此外,长期以来人们无法对测得的宏基因组数据进行解析而区别开每种物种基因组

15、 DNA序列,而美国华盛顿大学 Virginia Armbrust 及其同事最近研发出了一种从宏基因组样本中将某单一基因组解析出来的方法,并通过该方法组装出一种古菌(Euryar-chaeota)物种的基因组序列,而这种微生物人们从未能够在实验室中培养19。这一技术为整个微生物群落如何工作打开了一扇窗户,对发现还未培养的微生物在环境中所扮演的不同作用有极大帮助。相信宏基因组学研究必然成为今后若干年自然科学研究的一个重要领域。1.2 评价和保护微生物多样性 对于微生物多样性的评价,包括对微生物的种类及丰富度进行评价,但最终仍是对其遗传多样性进行评价。因此,正确评价微生物多样性离不开对其遗传多样性

16、的认识,以上所介绍的研究方法正是认识其遗传多样性必不可少的手段。保护微生物多样性存在两个方向,一是保护微生物的生活环境;二是对纯培养的微生物菌种(株)进行保藏。保护微生物的生活环境无疑是可以长期保护其多样性的唯一可行的方法。目前,在所建立的动植物多样性保护区已经包括了微生物的生存环境,所以不必特别建立微生物保护区,但正是需要人们共同努力保护生态环境,才能使微生物的多样性得以存在。此外,人们还可以通过挑选微生物的 优良菌种,并创造一个适合其长期休眠的环境条件,如干燥、低温、避光、缺氧、缺少营养等环境对不同的微生物菌(毒)株进行保藏。目前常用的菌种保藏方法有冻干保存法、超低温冻存法、低温保存法、传

17、代培养保存法、砂土保存法等20,21。此外,对保藏菌种,如形态学特征、采集地、培养史等方面进行准确的档案记录也是不可缺少的环节20。正是由于微生物保存技术的发展,许多国家都为菌种保藏设有专门的机构,如美国的典型菌种保藏中心(ATCC),英国的国家典型菌种保藏所(NCTC)和中国的中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM),另外还有一些国际性的菌种保藏机构,如世界菌种保藏中心(WFCC)、亚洲微生物资源保藏和可持续利用联盟(ACM)等。保存微生物的目的,不仅是保护微生物多样性的重要手段,也可以使微生物菌株以活的生命状态保存下来,方便后人更好的研究和开发微生物,造福人类,具有重要现实意义。2 用于分子

18、标记的 DNA 序列 大多数的分子标记技术都是通过对特定类型或特定位置的 DNA 序列进行检测分析而了解其多样性特征的。在这些研究中,从浩如烟海的序列中选择合适的 DNA 片段作为研究目标是最基础、最关键的一步。微生物的基因组包括核基因组和线粒体基因组,在遗传多样性研究中,这两种基因组序列都已得到了运用。2.1 核基因序列标记 由于核基因组结构大而复杂,大部分核基因中又存在直系同源基因(Orthologous gene)和旁系同源基因(Paralogous gene),使得核基因的应用复杂化。在众多的核基因分子标记中,使用率极高的是核糖体 rRNA。2.1.1 核糖体 rRNA 核糖体是一个致

19、密的核糖核蛋白颗粒,广泛分布于现存的所有生物,执行着蛋白质合成的功能,它由几十种蛋白质和 rRNA 组成。在真核微生物中,1402 HEREDITAS(Beijing)2012 第 34 卷 核糖体转录区的重复单位包括 5S、5.8S、18S 和 28S rRNA。位于 18S 和 5.8S 之间的 ITS1 区和位于 5.8S和 28S 之间的 ITS2 区一起构成内转录间隔区ITS(Internal transcribed spacer)。18S、5.8S、28S rRNA 基因序列进化缓慢而相对保守,其中 18S 比 28S 基因更保守,常常作为种级以上阶元的良好标记;5.8S基因高度保

20、守,为真菌 rRNA PCR 扩增的通用引物的设计提供了极大的方便;ITS 序列受到的选择压力较小,进化速率较快,序列长度适中,含足够量的遗传信息,在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性,因此被广泛用于物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的微生物群间的系统发育关系分析。White 等22为真菌 rRNA 基因的 ITS 设计了 3 对特异引物,即 ITS1、ITS4 和ITS5,可用于大多数担子菌和子囊菌的 ITS 扩增。Gardes 等23则分别为真菌和担子菌设计了具有更高特异性的引物 ITS1-F 和 ITS4-B。在原核微生物中,核糖体转录区的重复单位包括 5S、16

21、S 和 23S 三种。其中 5S rRNA 信息量少,不适合分析;23S rRNA 分子大,但碱基突变速率要比16S rRNA快得多,对于较远的亲缘关系不适用;16S rRNA 大小在 1 500 bp 左右,具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称24。目前,16S rRNA 基因序列分析已广泛应用于微生物多样性的研究25,26。此外,利用 16S rRNA 基因序列分析发现了不少新的微生物物种,尤其是古细菌的发现,更是奠定了有关古细菌、真细菌和真核生物“三界”理论的基础27。在现实研究中,除了选择 16S rRNA 作分子标记进行比较外,还可利用 ITS、1

22、6S rRNA-23S rRNA 序列及某些发育较为古老而序列又较稳定的特异性酶的基因作序列分析进行遗传多样性分析2830。2.1.2 其他核基因标记 除了核糖体 rRNA 序列外,一些核基因序列,如-微管蛋白基因(-tubulin)、转录延长因子 (Elongation factor 1-,EF1)、RNA 聚合酶 II 大亚基(RNA polymerase II largest subunit,RPB1)、RNA 聚合酶 II 第二大亚基(RNA polymerase II second largest subunit,RPB2)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated p

23、rotein kinase,MAPK)等也常被用来进行物种遗传多样性分析。这些序列无一例外的都具有保守的序列结构,但又能在各级分类水平上将物种有效区分开来,反映出物种的系统进化关系。在众多序列中,-微管蛋白基因(-tubulin)使用频率较高。该基因序列具有高度保守的外显子,已经被广泛用于真菌各级分类水平上的系统发育研究和在分子生物学研究中被用作内参基因,并且发现其无论在低分类阶元的系统发育研究中还是复合种研究中,甚至对种内不同地域菌株间的亲缘关系均具有重要意义31。随着测序速度的加快和成本的降低,人们在进行遗传多样性分析时,有时并非基于一条序列进行分析,而是通过 PCR 扩增多个基因序列(通

24、常为持家基因),通过对序列进行遗传变异分析,从而了解物种的遗传特征,该方法也被称为多位点序列分型技术(Multilocus sequence typing,MLST)。目前,该方法已经广泛运用到各类微生物的遗传多样性研究中,极大的推动了人类对微生物遗传多样性的认识3236。此外,基于多个位点序列进行分析,还能对微生物的系统发育及演化提供更加充分的信息,帮助人们更加客观准确的认知微生物的进化历程。例如,James 等就利用 18S rRNA、28S rRNA、ITS、EF1、RPB1 和 RPB2 六条序列,对接近 200 个真菌物种进行系统发育构建,探讨真菌的演化历史,他们发现在真菌的演化过程

25、中发生了至少 4 次鞭毛的独立丢失事件。而游动孢子的消失与气生孢子的出现是同步的。另外,通过分析该作者还认为一直饱受争议的微孢子虫在真菌进化的早期起源于一种内寄生壶菌的祖先37。2.2 线粒体 DNA 序列 目前,以线粒体 DNA(mtDNA)序列作为分子标记进行微生物遗传多样性的研究大都集中在真菌领域。对真菌线粒体基因组的分子生物学研究结果显示,真菌线粒体 DNA分子进化的速度介于动物和植物之间,真菌线粒体 DNA 变异丰富,能为真菌的系统发育及系统演化的研究提供大量的信息38。对真菌线粒体 DNA 的多态性分析已被普遍用于真菌种群学及进化生物学的研究3941。例如,Foury 等42和 L

26、opez 等43就利用线粒体细胞色素氧化酶亚基 I 基因 COX1 的多态性作为酵母菌株遗传 第11期 李娟等:微生物的遗传多样性 1403 多样性分析的工具;Hamari 等44对曲霉属 Asper-gillus 的两个种 Aspergillus japonicus 和 Aspergillus aculeatus 的分子特征与表型特征之间的关系作了分析,他们通过对这两个种的菌株进行线粒体 DNA的 RFLP 分析,获得 7 个线粒体 DNA 酶切片段群;Oudemans 和 Coffey45对疫霉属 Phytophthora 真菌的 6 个种的线粒体 DNA 进行 RFLP 分析,发现线粒体

27、 DNA不仅可以对种进行有效划分,还可以用于区别种以下的分类单元亚群。但应注意到,线粒体DNA作为一种核外遗传物质,它所含的遗传信息量有限,若能将线粒体 DNA信息与基因组 DNA 结合分析,将对物种遗传多样性、分类以及系统进化研究提供更多的信息。3 微生物遗传多样性相关研究内容 3.1 物种分离鉴定与分类 对于微生物物种的分离鉴定是认识微生物多样性的主要内容之一。传统的分离鉴定方法是通过纯培养获得菌株后,依据其外表形态、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察的特性对其进行鉴定。对于某些能够纯培养的微生物,生长、生理生化特征会随着环境的变化而不稳定,个体多态性明显。因此,仅依赖表型的认知并不能完

28、全或真实反映微生物的种属特征,将两个相似种鉴定为同一物种(异种同名),或将形态学略有差异的同一物种鉴定为两个种(同种异名)的事件时有发生,例如,Hu 等46根据分生孢子特殊的形态结构而将一株捕食线虫真菌定义为新种,并命名为多次生节丛孢(Arthrobotrys multisecondarius),而 Li 等47根据 ITS 序列和-tubulin 基因序列同源性分析,发现多次生节丛孢与小舟单顶孢(Monacrosporium microscaphoides)具有极高的序列相似性(99%),从而认为多次生节丛孢是小舟单顶孢的自发突变种。所以,除了形态学及生理生化特征外,注意其遗传信息的多样性将

29、能更准确的对微生物物种进行分离鉴定。目前,rRNA 同源序列分析技术结合形态学特征已基本上取代了传统的分类研究,显示出其主导性的作用。3.2 未培养微生物 自 19 世纪科赫(Koch)创立微生物纯培养技术以来,已有数千种细菌、病毒和约 10 万种真菌在实验室中得到了纯培养。然而,越来越多的证据表明,由于受现有技术的限制,自然界中绝大部分的微生物是目前人们还无法纯培养的,甚至是还不曾认识的,这些还不能被纯培养的微生物就叫未培养的微生物(Uncultured microorganisms)48,49。未培养的微生物是一个巨大的微生物资源库,其中蕴藏着丰富的新基因。对其进行深入研究开拓了微生物学研

30、究的新领域,可充分认识微生物物种的多样性,了解生物进化及微生物系统发育学信息。人们可以通过分子生物学的手段绕过培养障碍对未培养的微生物进行研究,从而了解人类未知的微生物世界。核糖体 rRNA 基因序列分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、RFLP 分析技术等等都曾广泛应用于不可培养微生物多样性的研究5052。埃克斯特大学研究人员最近通过对环境样品DNA(SSU)检测和 DNA 荧光探针技术发现了从池塘水体样品中发现了一类特殊、古老的真菌类群,将其命名为 Cryptomycota(“隐秘菌物”)。这类真菌与现有的真菌类群有显著差异,遗传多样性也极为丰富,而且细胞壁缺少甲壳素(Chitin)成分,从

31、而将该类群建立一个新的真菌门(Phylum)53。而近年来发展的宏基因组技术在挖掘和利用未培养微生物资源,促使人类了解许多未培养微生物的基因组序列及其功能产物,筛选新颖生物活性物质方面更是具有广泛的应用54。3.3 微生物群体遗传结构 群体遗传结构是指遗传变异在物种或群体中的一种非随机分布,即遗传变异在群体内、群体间的分布样式以及在时间上的变化。群体遗传结构能反映遗传变异在群体内、群体间以及物种间的分布样式以及在时间上的变化,从而理解该物种或群体的进化史及演化潜能。研究发现,许多因素,诸如种群大小、变异、生殖方式、基因流和选择作用等均能影响微生物群体遗传结构的演化。因此,要阐明物种的遗传变异和

32、分化过程,必须首先探讨生物群体遗传变异的大小,遗传结构及其变化规律以及影响群体遗传结构的各种因素等。1404 HEREDITAS(Beijing)2012 第 34 卷 近些年,对于为微生物的群体遗传结构研究,科学家们也逐渐掌握了一些规律,如,就种群大小而言,一般认为气流传播的微生物比土传的微生物有效群体大,高基因流的比低基因流的的有效群体大55。通常情况下,病毒尤其是 RNA 病毒的突变率比真菌和细菌的高,核基因组的突变率比线粒体基因组突变率高56。就基因重组而言,几乎所有真菌都能通过有性生殖产生基因重组,而细菌则可通过转化、接合和转导产生重组。病毒则可通过重组和重排完成遗传交换57;通常情

33、况下,远距离扩散(如通过气流或昆虫作为载体)的微生物比短距离扩散(如通过雨水作为载体、土传、种传)的微生物发生基因交流的可能性高等等。但目前对于微生物群体遗传结构的大部分研究工作都局限在对群体的遗传多样性及地理分布进行简单分析,而很少探讨群体遗传结构的时空动态及其进化机制56,这将是今后群体遗传研究需要注重的。3.4 微生物的物种形成 理解微生物的物种形成过程对于认识物种的起源与进化,理解微生物遗传多样性具有重要的意义。微生物的物种形成与其生活方式和地理分布紧密相关。此外,生殖模式也是影响微生物物种形成的重要因素。真菌是研究真核生物的物种形成模式的良好材料。首先,许多真菌能在实验室条件下得到短

34、期培养,并且完成杂交。其次,真菌具有不同的生活史方式和地理分布。另外,在真菌中有许多已知的复合种,这些复合种内包含许多近期分化的姊妹种5860,这使得研究物种形成的早期过程中的遗传分化成为可能。近年来,报道的真菌物种形成模式主要有异地物种形成、同地物种形成、杂交物种形成等等。异地物种形成是指在不同的地方发现同一物种的不同隐存种。同地物种形成主要来自于病原真菌对不同寄主的选择性适应。如,小麦的病原真菌 Mycosph-aerella graminicola 是从野生草类的寄生物种中随着小麦在人工驯化过程的不断积累,通过同地物种分化形成的61。杂交物种形成则是由于许多真菌并不是完全的不育,从而给个

35、体间的杂交带来了机会。在草类的内寄生真菌属 Epichloe 中,通过杂交产生无性阶段的 Neotyphodium 属的真菌能寄生草类,而 Epichloe 属的真菌则不能62。此外,染色体重排在真菌的物种形成中也起重要作用,如在子囊菌 Sordaria macrospora 和担子菌 Coprinus cinereus中,种内的同宗配合使得物种体内含有不同的染色体组型,为后代自我繁殖提供了机会63。除了生殖隔离在物种形成中发挥重要作用外,也有学者认为生态因素可能在共同生存的生物体的物种形成过程中起重要作用。Rundle 和 Nosil64将生态学物种形成定义为,由生态的分化选择引起的种群间基

36、因流隔离的过程。在生态学物种形成过程中,群体间生殖隔离的进化是分化性选择和生物体对特定环境适应的结果64,65。但这种生态学物种形成的理论目前在真菌中还没有得到足够证据。3.5 微生物系统发育与进化 近年来,现代分子生物学技术,尤其是 rRNA基因同源性分析方法在微生物系统发育及进化研究中发挥了巨大的作用。在分子和基因水平上获得大量分类单元尤其是种的遗传信息后,来推断和重建微生物类群的演化历史和演化关系克服了传统的微生物分离培养方法的限制,极大地促进了人们对生物多样性乃至物种进化的理解。在遗传信息同源性分析基础上得出的微生物系统发育多样性不但可以作为微生物多样性评价的手段,而且为多样性的保护提

37、供依据。分析微生物系统发育路径,推测其演化历史,重建微生物类群的演化关系,成为认识微生物多样性必不可少的内容之一。对于微生物的系统发育与进化研究,对学术界冲击最大的当属“三界学说”理论的提出。1977 年,Woese 等27通过对 200 多种原核生物的 16S rRNA和真核生物的 18S rRNA 的多核苷酸序列进行分析,提出了生命体系的“三界学说”,即原核生物应分为两界：古细菌和真细菌,这两界彼此不同。古细菌、真细菌和真核生物三者之间不存在谁起源于谁的问题,而是相互平行的,三者都起源于共同的祖先,这一祖先称为原始细胞。而产甲烷球菌(Methanno-coccus jannaschii)的

38、全基因组序列测定更是为“三界学说”提供了可信的证据66。“三界学说”和生命之树的定量化为研究微生物生物多样性提供了一种全新 第11期 李娟等:微生物的遗传多样性 1405 的视点,并暗示大多数微生物都具有遗传多样性67。然而,随着更多微生物基因组数据的分析,许多学者对“三界学说”也提出了一些质疑。例如,他们认为并不是所有基因的进化都以相同的速度和方式进行,所以基于某一个基因分析得到的进化树与另一个基因得到进化树很可能不同。另外,即使系统发育树是正确的,当回溯到早期细胞进化时,也无法完美的解释为什么在真核生物的 34 个科中,只有 8 个科与古生菌表现出更大的相似性,而有 17 个科的蛋白质似乎

39、是来自细菌68,69。随着科学技术的发展以及更多微生物物种基因组测序的完成,使得微生物学家们能够从数据中挖掘含有更多与物种进化历史相关联的系统发育标记,结合对应分析方法的发展将克服传统分子系统发育研究中存在的诸多难题,使人们提高对微生物的遗传特征的理解,对微生物乃至生命的进化能有一个更系统、更准确的理解。4 结语与展望 以人类基因组计划为代表的生物体基因组研究成为整个生命科学研究的前沿,而微生物基因组研究又是其中的重要分支。从 1995 年国际上第一个细菌流感嗜血杆菌全基因组测定完成,数以千计的微生物的测序工作已经完成或正在进行,意味着微生物的研究已经全面进入基因组时代。海量的微生物基因组序列

40、信息不仅能使人们从更加广阔的空间和全新的视角对微生物的致病机制、重要代谢和调控机制进行研究,还能在此基础上发展一系列与我们的生活密切相关的基因工程产品,如疫苗、新药、诊断试剂和应用于工农业生产的各种特殊酶制剂等,全面促进微生物工业时代的来临。此外,高通量的DNA测序技术及相应计算机分析软件的开发将使得核苷酸多态性的检测研究应用于更加广泛的物种和更多的位点,为更加深入地研究微生物遗传多样性奠定良好的基础。而且通过分析和应用这些数据资源,会极大地促进功能基因组学及相关进化问题的研究。基因组时代的到来,将一个崭新的、全面的和内在的微生物世界展现在人们面前。相信越来越多的基因组信息的积累和分析,将为认

41、知微生物多样性提供更丰富的信息和更有力的证据,为保护生物多样性做出应有的贡献。参考文献(References):1 Osborn AM,Moore ERB,Timmis KN.An evaluation of terminal-restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)analysis for the study of microbial community structure and dynamics.Environ Microbiol,2000,2(1):3950.2 Welsh J,McClelland M.Fingerprintin

42、g genomes using PCR with arbitrary primers.Nucleic Acids Res,1990,18(24):72137218.3 Vos P,Hogers R,Bleeker M,Reijans M,van De Lee T,Hornes M,Friters A,Pot J,Paleman J,Kuiper M,Zabeau M.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res,1995,23(21):44074414.4 王世伟,齐小辉,刘军,马玉超,周东坡.AFLP 技术在微生物

43、分类鉴定,基因标定及遗传多样性方面的应用.生物技术,2003,13(5):4243.5 Muyzer G,De Waal EC,Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes encoding for 16S rRNA.Appl Environ Microbiol,1993,59(3):695700.6 Muyzer G,Brinkho

44、ff T,Nbel U,Santegoeds C,Schfer H,Wawer C.Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)in microbial ecology.In:Kowalchuk GA,de Bruijn FJ,Head IM,Akkermans ADL,van Elsas JD,eds.Molecular Microbial Ecology Manual.Dodrecht:Kluwer Academic Publishers,2004,12:743769.7 宫曼丽,任南琪,邢德峰.DGGE/TGGE 技术及其在微生物分子生态学中

45、的应用.微生物学报,2004,44(6):845848.8 Takezaki N,Nei M.Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite DNA.Genetics,1996,144(1):389399.9 Nikiforov T,Karn J,Goelet P.Ligase/polymerase-mediated genetic bit analysis of single nucleotide poly-morphisms and its use in genetic analy

46、sis.Google Patents,1999.10 Fisher MC,White TJ,Taylor JW.Primers for genotyping single nucleotide polymorphisms and microsatellites in the pathogenic fungus Coccidioides immitis.Mol Ecol,1999,8(6):10821084.11 Achtman M,Wagner M.Microbial diversity and the genetic nature of microbial species.Nat Rev M

47、icrobiol,2008,6(6):431440.12 胡婷婷,蒋承建,梁璇,隆文杰,武波.碱性土壤微生物基因的克隆和多样性分析.,2006,28(10):12871293.13 Turnbaugh PJ,Ley RE,Hamady M,Fraser-Liggett CM,Knight R,Gordon JI.The human microbiome project.1406 HEREDITAS(Beijing)2012 第 34 卷 Nature,2007,449(7164):804810.14 Gilbert JA,Meyer F,Jansson J,Gordon J,Pace N,Ti

48、edje J,Ley R,Fierer N,Field D,Kyrpides N,Glckner FO,Klenk HP,Wommack KE,Glass E,Docherty K,Gallery R,Stevens R,Knight R.The Earth Microbiome Project:Meeting report of the“1st EMP meeting on sample selec-tion and acquisition”at Argonne National Laboratory October 6th 2010.Stand Genomic Sci,2010,3(3):

49、249 253.15 Rondon MR,August PR,Bettermann AD,Brady SF,Grossman TH,Liles MR,Loiacono KA,Lynch BA,MacNeil IA,Minor C,Tiong CL,Gilman M,Osburne MS,Clardy J,Handelsman J,Goodman RM.Cloning the soil metagenome:a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms.Appl

50、 Environ Microbiol,2000,66(6):25412547.16 Handelsman J.Metagenomics:application of genomics to uncultured microorganisms.Microbiol Mol Biol Rev,2004,68(4):669685.17 Arjun JK,Harikrishnan K.Metagenomic analysis of bacterial diversity in the rice rhizosphere soil microbiome.Biotechnol Bioinf Bioeng,20