[精选]第五章氨基酸工艺学9386.pptx

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1、第五章第五章 氨基酸工艺学氨基酸工艺学1第一节第一节 概述概述 1.1氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。也就是说，氨基酸发酵的关键，取决于其控制机制是否能被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为的控制微生物的代谢。氨基酸发酵的成功，把代谢控制发酵技术引入微生物工业，使微生物工业能在DNA分子水平上改变、控制微生物的代谢，使有用产品大量生成、积累。21.1.1氨基酸生产的历史1820年水解蛋白质开始1850年在实验室合成了氨基酸1866年

2、（德）H.Ritthausen（立好生）博士利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材，称之为谷氨酸。1908年日本制造味之素。1909年用水解法生产谷氨酸。1936年（美）从甜菜废液（司蒂芬废液）中提谷氨酸。1954年多田、中山俩博士报告了直接发酵谷氨酸（L-GA）1957年发酵法生产味精商业性生产。3 从从20世纪初期，氨基酸实现工业化生产以来，世纪初期，氨基酸实现工业化生产以来，氨基酸生产大体有蛋内质水解法、化学合成法、氨基酸生产大体有蛋内质水解法、化学合成法、微生物发酵法和酶法四种生产方法。微生物发酵法和酶法四种生产方法。蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸；蛋白质水

3、解法：早期味精生产、复合氨基酸；化学合成法：化学合成法：DL-蛋氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、DL-丙氨丙氨酸；酸；酶法：酶法：L-丙氨酸、丙氨酸、L-色氨酸、色氨酸、L-丝氨酸；丝氨酸；微生物发酵法：生产微生物发酵法：生产60%以上的氨基酸，包括以上的氨基酸，包括直接发酵法和添加前体发酵法。直接发酵法和添加前体发酵法。前三种方法成本高，工艺复杂，难以达到工业前三种方法成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产目的。化生产目的。4发酵法生产谷氨酸是现代发酵工业的重大创举，也是氨基酸生产的重大革命，同时大大推动了其它氨基酸研究和生产的发展。逐步形成了用发酵法制造氨基酸的新型发酵工业部门。生产氨基酸的大

4、国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。5我国从1958年开始筛选谷氨酸生产菌，同时进行了大量的谷氨酸发酵的基础性研究，1964年分离选育出北京棒状杆菌As1.299和钝齿杆菌As1.542二株谷氨酸生产菌。后进行其它的基础性研究，陆续发表了赖、缬、亮、异亮、色、天冬的发酵研究报告，建立了自己的发酵工业。6国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。在80年代中后期,

5、我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。2000年,世界氨基酸产值达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。71.2氨基酸发酵生产发展的历史回顾所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为培养基中的主要原料培养微生物,积累特定的氨基酸。这些方法成立的一个重要原因是使用选育好的氨基酸生物合成高能力的菌株。8菌株的育种是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件.在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的

6、基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。91.2.1用野生株的方法这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。典型的例子就是谷氨酸发酵。改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵101.2.2用营养缺陷变异株的方法这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体

7、，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。11谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的合成是与分枝途径相联系的酸的合成是与分枝途径相联系的酸的合成是与分枝途径相联系的酸的合成是与分枝途径相联系的(图图图图4-8)4-8)4-8)4-8)，筛选高丝氨，筛选高丝氨，筛选高丝氨，筛选高丝氨酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由苏氨

8、酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由苏氨酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由苏氨酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，而获得赖氨酸的过量酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，而获得赖氨酸的过量酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，而获得赖氨酸的过量酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，而获得赖氨酸的过量生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时，天冬氨酸生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时，天冬氨酸生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时，天冬氨酸生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时，天冬氨酸激酶不被抑制，只有两者的协同效应才能造成抑制。在激酶不被抑制，只有两者的

9、协同效应才能造成抑制。在激酶不被抑制，只有两者的协同效应才能造成抑制。在激酶不被抑制，只有两者的协同效应才能造成抑制。在限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用也很难发生。也很难发生。也很难发生。也很难发生。121.2.3类似物抗性变异株的方法用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。利

10、用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。13高丝氨酸脱氢酶 例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成中（图中（图中（图中（图5-165-165-165-16所示），选育抗苏氨酸结构类似物所示），选育抗苏氨酸结构类似物所示），选育抗苏氨酸结构类似物所示），选育抗苏氨酸结构类似物2-2-2-2-氨基氨基氨基氨基-3-3-3-3-羟基羟基羟基羟基戊酸（戊酸（戊酸（戊酸（AHVAHVAHVAHVr r r r）突变株

11、，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱）突变株，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱）突变株，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱）突变株，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱氢酶活性提高氢酶活性提高氢酶活性提高氢酶活性提高1300130013001300倍，能积累倍，能积累倍，能积累倍，能积累14g/L14g/L14g/L14g/L苏氨酸的突变株。苏氨酸的突变株。苏氨酸的突变株。苏氨酸的突变株。141.2.4体内及体外基因重组的方法基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产

12、生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。15代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。其主要步骤为:鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶);取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等);将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物;使调节元件的作用及培育条件最优化。通过基因工程技术，构建理想的工程菌株

13、1.2.5基因工程菌161.2.5.1载体-受体系统及克隆表达的研究1.2.5.1.1受体的获得目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善，利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待解决的问题。171.2.5.1.2载体的构建有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得;载体所需的筛选标记及外源

14、基因插入的多克隆位点，可从常用的克隆载体中获得。181.2.5.1.3基因转移手段由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它不适用。通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化，接合转移。原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受到原生质体再生条件的局限，效率不高;电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它的转化效率可达到原生质体转化法的1001000倍。接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于稳定遗传。191.3氨基酸发酵的代谢控制是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之二是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之二菌种的代谢调控:控制发酵的条件控制细胞渗透性

15、控制旁路代谢降低反馈作用物的浓度消除终产物的反馈抑制与阻遏作用促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成201、控制发酵环境条件专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。212、控制细胞渗透性生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。细胞内生物素水平高，Glu不能通过细胞膜青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。表面活性剂增加细胞膜通透性氨基酸发酵必须考虑的重要因素22细胞透性的调节 细胞透性的调节，一般通过向培养基中添加化学成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性剂、青霉素等，达到抑制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常生理状态，

16、解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。生物素：影响磷脂的合成及细胞膜的完整性。油酸：直接影响磷脂的合成及细胞膜甘油：甘油缺陷型菌株丧失-磷酸甘油脱氢酶，不能合成-磷酸甘油和磷脂。限量供应，控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而积累。表面活性剂：对生物素有拮抗作用，拮抗不饱和脂肪酸的合成，导致磷脂合成不足，影响细胞膜的完整性，提供细胞膜对谷氨酸的渗透性。青霉素：抑制细菌细胞壁的后期合成，形成不完整的细胞壁，使细胞膜失去保护，使胞内外的渗透压差导致细胞膜的物理损伤，增大谷氨酸向胞外漏出的渗透性23生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影

17、响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成提高细胞膜的提高细胞膜的谷氨酸通透性谷氨酸通透性控制磷脂的合成控制磷脂的合成 使细胞膜受损（如表面活性剂）使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜控制磷脂含量控制磷脂含量通过油酸的合成通过油酸的合成 通过甘油合成通过甘油合成 直接控制磷脂合成直接控制磷脂合成243、控制旁路代谢254、降低反馈作用物的浓度利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。限制瓜氨酸的浓度可解除反馈抑制，

18、实现鸟氨酸的生物合成。265、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法或者通过选育营养缺陷型菌株。6、促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成ATP的积累可促进氨基酸的生物合成27迄今，日已有22种氨基酸可用发酵法生产。但生产上不一定非用生物合成。根据经济、资源的合理性，利用不同方法生产氨基酸。如蛋氨酸、鸟氨酸用化学合成法，胱氨酸可用提取法水解。但化学合成为D型，右旋。生物合成为L型，左旋。水解法污染厉害。因而总的来说，氨基酸生产要用生物合成。28今后的发展是育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种。提高产酸。采用过程控制，加强种子管理、连续化、自动化、稳产高

19、产、探索新工艺、新设备，以提高产率和收得率、研究微生物生理、生化、遗传变异和发酵机制等问题，以便能更好地控制氨基酸这样微生物中间代谢产物的发酵。29二、氨基酸的应用（一）医药因为蛋白质是由各种氨基酸构成的，所以各种氨基酸及其衍生物可治疗各种不同的疾病。如消化系统经手术后，或烧伤、创伤病例需大量补充蛋白质营养时，可注射各种氨基酸，配比接近鸡蛋的配比为佳。八种必须氨基酸（异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。30（二）食品1调味用的氨基酸味精（Glu-Na）其与肌苷酸钠或鸟苷酸钠同时使用，具协同作用，可提高鲜味。

20、天冬氨酸钠用量仅次于味精的调味品，具强烈鲜味。甘氨酸甜味为砂糖的0.8倍。在果汁中加0.02%0.4%的甘氨酸，可去除糖精的苦味。31DL-丙氨酸。甜味为砂糖的1.2倍。D-色氨酸。甜味为砂糖的35倍。用于牙膏、糖尿病人及肥胖病人。天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯。甜味为砂糖的150倍。但其水溶液不耐热，7080就分解，加热至100就失去甜味。2提高食品的营养价值。8种人体必须氨基酸，不能在体内合成，而各种食品又缺乏某一特定的必须氨基酸，添加之可提高蛋白质的利用率。如。鱼缺色氨酸。强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中)32（三）农业1增加饲料的营养率。如，谷类缺赖氨酸，豆类缺蛋氨酸。甲硫氨酸等必需氨

21、基酸可用于制造动物饲料。2氨基酸农药如，水稻孕穗期使用氨基酸脂肪酸农药N-月桂酰-L-异戊氨酸能防止稻瘟病，提高水稻蛋白质的含量，改进稻米的风味和品质。33（四）工业原料1人造革D-谷氨酸聚合生成聚合谷氨酸（PLG）2洗涤剂十二烷酰基谷氨酸（AGS）肥皂以及用月桂酰氨与D/L-GA制成的肥皂，其洗净力，起泡力，乳化力，分散力均好。3润肤剂（焦谷氨酸钠）脱一分子水形成NPCA-Na。保湿性比甘油好。34请写出从葡萄糖到谷氨酸的合成途径，并说明与合成效率有关的机制35第二节谷氨酸发酵机制一、工艺过程谷氨酸发酵工艺流程谷氨酸发酵工艺流程36等电点提取谷氨酸工艺流程等电点提取谷氨酸工艺流程37谷氨酸制

22、味精的工艺流程谷氨酸制味精的工艺流程 3839国内用糖蜜发酵，要加吐温（表面活性剂）国外用糖蜜发酵，日本加青霉素，法国不用青霉素、吐温、是由其菌特点所决定Glu生长水平好坏有关因素：菌种、工艺、设备条件协同配和正常条件下，菌体产生Glu在发酵液中为1mg/ml(1)谷氨酸代谢调节，细胞膜透性调节与环境条件协同配和。40第二节谷氨酸生物和成途径代谢控制发酵是用遗传学或其他生物化学的方法，人为地在分子水平上改变和控制微生物的代谢，打破微生物正常的代谢调节，使有用产物大量生成和积累。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，发酵技术的关键是打破微生物的正常代谢调节，人为控制微生物的代谢。葡萄糖经糖酵解葡萄糖经

23、糖酵解(EMP途径途径)和己糖磷酸支路和己糖磷酸支路(HMP途径途径)生成生成丙酮酸，再氧化成丙酮酸，再氧化成 乙酰乙酰CoA，然后进入三羧酸循环，再，然后进入三羧酸循环，再通过乙醛酸循环、通过乙醛酸循环、CO2固定作用，生成固定作用，生成-酮戊二酸，酮戊二酸，-酮酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，存在的条件下，生成谷氨酸。生成谷氨酸。41由葡萄糖生物合成谷氨酸由葡萄糖生物合成谷氨酸42二、氨的导入还原氨基化反应（GDH）转氨反应（AT）谷氨酸合成酶（GS）催化的反应431、谷氨酸生物合成中的几个途径（正常途径）（1）糖酵解途径（EMPEMP）

24、（2）磷酸已糖途径（HMP)HMP)（3）三羧酸循环(TCA环)（4）乙醛酸循环（DCA环）（5）二氧化碳固定反应PEP+CO2+GTP 草酰乙酸+GDP 丙酮酸+CO2+NADH 苹果酸+NAD 草酰乙酸 CO2 NAD+NADH+H+（6）-KGA的还原氨基化反应PEPPEP羧化酶羧化酶苹果酸酶苹果酸酶苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶C6H12O6+NH3+O2 C5H9O4N+CO2+3H2O在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：44苹果酸酶苹果酸酶丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶酸羧化酶CO2固定反应固定反应(丙酮酸羧化支路丙酮酸羧化支路)452、GA生物合

25、成的理想途径（1）GA产生菌必须具备以下条件（内在因素 ）-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺失TCA环阻断，-酮戊二酸积累琥珀酸辅酶A TCA环正常 GA产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失积累NADPH，抑制KGA的脱羧氧化46 GA产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA 发酵积累 菌体有强烈的L谷氨酸脱氢酶活性KGA+NH4+NADPH=GA+NADP提供NADPH,用于还原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联 473/2Glucose EMP 丙酮酸 +丙酮酸 +丙酮酸乙酰辅酶A

26、+乙酰辅酶A+乙酰辅酶A柠檬酸则有：3/2C6H12O6+NH4+=C5H9O4N+4CO2产率：147/（180*3/2）=54.4%CO2 谷氨酸 在前述GA 合成所必需的条件的基础上，体系不存在CO2固定反应，则有：体系存在CO2的固定反应结论通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%在谷氨酸发酵中，DCA环可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充 48.在前述GA 合成所必需的条件的基础上（封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：Glucose EMP 丙酮酸 +丙酮酸CO2则有：C6H12O6+NH4+=C5H9O4N+CO2（来自何方）产率：147/180=8

27、1.7%乙酰辅酶A +C4二羧酸 CO2 草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）苹果酸（苹果酸激酶）柠檬酸（DCA循环封闭）谷氨酸49四碳二羧酸的来源在生产菌中检出CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶 谷氨酸对糖的转化率达到81.7%C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2+3H2O需要Mn2+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn2+实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%81.7%。目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都

28、在50%以内：50 提高GA的潜力是很大的，具体表现在：（1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn2+，生物素，（2）控制溶氧浓度是非常重要的 低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化 高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能，51氨的导入还原氨基化反应为主导性反应由谷氨酸脱氢酶（GDH）所催化转氨酶（AT）催化的转氨反应利用已存在的其他氨基酸，经过转氨酶的作用，将其它氨基酸与生成L-谷氨酸谷氨酸合成酶（GS）催化的反应以-酮戊二酸为基质不能生成Glu，从此可看出H2来自52氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶AT谷氨酸-酮戊二酸+-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH

29、+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶GS-酮戊二酸NH4+NADPH谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脱氢酶GHD+53（2）影响谷氨酸合成的外在因素a、生物素对糖代谢的影响生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度(对TCA有促进作用）乳酸积累碳源利用率降低，发酵液的pH值下降。而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累A、生物素对GA发酵的影响主要影响糖降解速度，不影响EMP与HMP途径的比率。生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，引起乳酸的溢出。5455研究表明，异柠檬酸裂解酶活性为醋酸诱导受

30、琥珀酸的阻遏，抑制当VH缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。b、控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭56c、生物素对氮代谢的影响VH丰富时，出现“只长菌，不产酸只长菌，不产酸”的现象 GA发酵过程中，前期，菌体的增

31、殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。结论氨的导入时生物素缺乏，NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度高效合成谷氨酸生物素充足时，NH4+不影响糖代谢速度57关于氮代谢的调节：控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮

32、酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。58d、VH对菌体细胞膜通透性的影响通常谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度（干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成）干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成）来实现的来实现对菌体细胞膜通透性的调节。葡萄糖 丙酮酸+丙酮酸 乙酰辅酶A 乙酰辅酶 乙酰辅酶A羧化酶（辅酶是VH）CO2 丙二酰辅酶A 丙二酰辅酶A C4 C6 CO2 培养基中生物素限量时，胞内AA92%胞外培养基中生物素丰富时，胞内AA12%胞外 CO2

33、 59 Glu生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适 量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失 调使Glu得以积累。生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培 养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不 积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能发生特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的形态，使终产物不断排出细胞外，胞内谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，胞内谷氨酸源源不断被优先合成，分泌到发酵培养

34、基中积累。60B、供氧浓度 过量：NADPH的再氧化能力会加强，使-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。C、NH4+浓度（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：过低，不利于-KGA的还原氨基化；过高，产生谷氨酰胺。NH4+的供给方式：（1）液氨 （2）流加尿素61D、磷酸盐 过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之 间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等 （2）产生并积累Val，Glucose 丙酮酸 丙酮酸+活性乙醛-乙酰乳酸 Val

35、Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率（3）发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提出 62一.控制细胞膜透性的方法1.化学控制方法通过控制发酵培养基中的化学成分,达到控制磷脂,细胞膜的形成或阻碍细胞壁正常的生物合成,使谷氨酸生产菌处于异常的生理状态,以解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。64控制磷脂的合成,导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜(1)生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时,必须限制发酵培养基中生物素的浓度.a.作用机制:生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的

36、合成,进而影响磷脂的合成.当磷脂合成减少到正常量的1/2左右时,细胞变形、谷氨酸向膜外漏出,积累于发酵液中。65b.控制的关键为了形成有利于谷氨酸向外渗透的磷脂合成不足的细胞膜,必须亚适量控制生物素(5-10ug/l)发酵初期(0-8h)菌体正常生长,菌体形态为单个成对八字形棒形椭圆短杆形,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增期间,开始出现异常形态的细胞,菌体伸长,膨大乃至不规则形,边缘有折绉,稍模糊电镜观察似疱疹样，完成谷氨酸非积累型细胞向积累型细胞的转变,形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜.谷氨酸高产。若生物素过剩,就会只长菌不产酸或长菌好产酸低。66(2)添加表面活性剂(如吐温60)或是饱和脂肪

37、酸(C16-18)使用生物素过量的糖蜜原料发酵生产谷氨酸时通过添加表面活性剂(吐温60)或高级饱和脂肪酸(C16-18)及其亲水聚酸脂类,同样能清除渗透障碍物，积累谷氨酸a.作用机制表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用,并不在于它的表面效果,而是在不饱和脂肪酸的合成过程中,作为抗代谢物具有抑制作用,对生物素有拮抗作用,通过拮抗脂肪酸的生物合成导致磷脂合成不足,结果形成磷脂不足的细胞膜,提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性67b.影响产酸的关键,必须控制好添加表面活性剂.饱和脂肪酸的时间与浓度,必须在药剂添加后.在这些药剂存在下,再次进行细菌的分裂繁殖.形成处于异常生理状态的产酸型细胞,即完成谷氨酸非积累型

38、细胞向谷氨酸积累型细胞的转变.例如,以甜菜糖蜜为原料,采用高生物素高吐温工艺。一般于发酵对数生长期的早期(4-6h),添加0.2吐温60，之后OD值与菌体重约净种增一倍,剩余生长太多,意味着谷氨酸生产菌细胞不能完成有效的生理学变化，剩余生长不足,意味着谷氨酸生产菌没有机会完成这种转变.68(3)油酸缺陷使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时,必须限制发酵培养基中油酸的浓度，由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成,丧失了自身合成油酸的能力69(4)甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时,必须限制发酵培养基中甘油的浓度阻碍谷氨酸生产菌细胞壁的合成作用机制:添加青霉素是抑制谷氨酸生产菌细胞壁的后

39、期合成，进而导致形成不完全的细胞膜。影响产酸关键：702、物理控制方法：利用温度敏感突变株突变位置：发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为基因所指导译出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。影响产酸关键：控制温度转换的时间（30提高到40的时间），并要在温度转换之后进行适度的剩余生长。71第四节GA生产菌的特征育种及扩大培养一、谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质1.现有谷氨酸生产主要是四个属短杆菌科短杆菌属(Brevibacteriaceea)(Brevibacterium)1.棒状杆菌属(Corgnebacferi

40、um)棒杆菌科2.小杆菌属(Microbacterium)(Corgnebacteriaceae)3.节杆菌(Arthrobacter)722.现有谷氨酸生产菌的主要特征这些菌曾分属四个属,但它们在形态及生理方面仍有许多共同的特征（1）细胞形态为球形、棒形以至短杆形（2）G+无芽孢，无鞭毛,不能运动（3）都是需氧型微生物（4）都是生物素缺陷型（5）脲酶强阳性（6）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白及明胶等73（7）发酵中菌体发生明显的形态变化,同时发生细胞膜渗透性的变化（8）CO2固定酶系活力强（9）异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱,乙醛酸循环弱（10）氧化能力缺失或微弱（11）还原性辅酶进入呼吸链

41、能力弱（12）柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强（13）能利用醋酸,不能利用石蜡（14）具有向环境中泄漏谷氨酸的能力（15）不分解利用谷氨酸,并能耐高浓度的谷氨酸,产生谷氨酸5以上74二.国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸发酵已有40年历史.目前使用的菌株主要有:北京棒杆菌(AS.1299)7338S-941WTH-1钝齿棒杆菌(AS1.542)、HU7251、B9B9-17-36F-263天津短杆菌(T6-13)FM-8207FM-415U-9CMTC6282TG-3TG-866D85等菌株多数厂家常用:B9T6-137338等75（一）、北京棒杆菌（7338）与钝

42、齿棒杆菌（B9）的比较在实际生产中，7338菌株与B9菌株的主要区别如下：细胞大小与细胞形态B9的细胞明显大于7338菌在发酵液提取GA上容易与菌分离，提取容易，发酵稳定。而7338因菌体细胞小，相对受噬菌体污染稍轻。B9菌在发酵过程中有明显的菌体形态变化，菌体发生伸长膨大，而7338菌在发酵过程中的形态变化，相对不够明显。76菌体本身的等电点不同7388在PH4.2-3.0。特别3.5-3.0菌大量沉降，同GA等电点菌分离困难，而B9不在此范围，易分离菌落颜色7338乳白色B9为草黄色发酵过程分泌色素少77脲酶7388B9活力低耐受力强活力高耐受低初尿可达1.8-2.0初尿0.8流尿2-3次

43、流尿4-6次生物素用量要求范围狭窄4-5ug/l较粗放5-8ug/l（由初糖定）生长因子都以生物素为必需生长因子，7388还需要硫胺素78发酵周期7388后劲足，而前期却不明显，周期稍长噬菌体类型不同，不交叉感染，可相调换酯酶谱带蛋白酶谱带，代谢产物都不尽相同。79天津短杆菌（T6-13）与纯齿棒杆菌（B9）的比较细胞大小：小且多，泡沫稍大提取比B9困难菌体形态斜面淡白色草黄色发酵中形态变化比B9大前期细胞比较短，圆滚滚，16h后拉长3倍以上发酵温度前32-34前30-32中后36-38中后34-35（有利于夏天降温条件差的工厂）80脲酶活力更强初尿0.5-0.6宜少量多次生物素用量比B9低2

44、0左右糖酸转化率不同45%以上40-45%噬菌体类型相同胶体量分泌胶体较多会干扰等电点GA结晶和菌体分离菌体本身等电点接近谷氨酸等电点提取收率较高为4.2-3.0之间81三、谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化在生产中发现GA生产菌发酵过程中会发现明显的菌体形态的变化。在发酵过程中发现菌体形态有明显的变化时，正是产GA的激增时间。但在发酵培养基含有过剩生物素的培养条件下，菌体形态则没有明显变化，却呈现耗糖长菌不产谷氨酸的异常发酵。82种子的菌体形态将斜面和一、二级种子培养的菌体，用结晶紫染色，经显微观察，发现B9菌，在一、二级种子和斜面种子培养的不同培养条件下，细胞形态基本形似，稍有差异。斜面菌

45、稍小，一、二级种子菌体大而粗壮，革兰氏染色深。0.7-0.91.03.4um折断分裂成V字形，为谷氨酸非积累型细胞。83谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态生物素为VB的一种，也叫做或辅酶R，参与脂肪酸生物合成限速反应的关键酶，乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸合成。通过控制生物素亚适量，使发酵7-10h后，生物素处于贫乏状态。16-20h后，生物素消耗完，完成谷氨酸非积累型细胞向积累型细胞转化，表现为OD值稳定，GA产量直线上升，直至发酵结束。84从GA发酵中菌形态变化来看，可分为三个时期：以发酵30-36h的正常GA发酵为例：发酵0-8h或0-10h为长菌型细胞，形态与二级种子相似短杆至棒状菌呈单

46、个、成对或“V”字型发酵8-18h或10-20h为转移期细胞，此阶段细胞形态急剧变化。细胞开始伸长、膨大。从GA非积累型细胞向GA积累型细胞（产酸型细胞）转化，转移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞，产酸速度逐渐加快。85发酵16-20h后为产酸型细胞，细胞为含磷脂不足的异常形态，呈现伸长、膨大、不规则，缺乏“V”字型排列，有的呈弯曲形，边缘颜色浅，稍模糊，有的边缘折绉及至残缺不齐，但菌体形态基本清楚。在发酵后期，细胞较长，多呈现有明显的横隔（1-3个或更多）的多节细胞，类似花生状，产酸高，在糖酸转化率高时尤甚。86GA发酵感染噬菌体后的形态感染噬菌体形态也会发生改变。感染噬菌体时期不同改变也不同

47、1.前期染噬菌体镜检可见细胞明显减少，细胞不规则、发圆、发胖、缺乏“V”字形排列视野中有明显的细胞碎片，严重时出现蛛丝、拉网，互相堆在一起。几乎找不到完整的菌体细胞，类似蛛网或鱼鳞状，生产上表现为排气口CO2迅速下降，相继出现OD值下跌PH上升或不上升，耗糖缓慢等异常发酵，应立即停止发酵进行救治。872、发酵中、后期感染噬菌体的菌体形态菌体细胞形态不规则，边缘不整齐有的边缘似乎有许多毛刺状的东西。有细胞碎片，不同于正常发酵的产酸细胞。一般说在生产上中、后期感染噬菌体，OD值虽下降，也常伴有泡沫多、黏度大、耗糖缓慢等异常现象，但及时补加适量营养物，一般仍可完成发酵，产酸在4左右，但需注意，由于噬

48、菌体侵染细胞后会使细胞内GA溢出，有时产酸会反而偏高，会使噬菌体忽视，这很危险。仍需注意采取措施加以防治。88四谷氨酸发酵的代谢控制育种1.日常菌种工作定期分纯小剂量诱变刺激：可淘汰生长微弱的菌株。高产菌制做安培瓶。2.选育耐高渗透压菌株耐高糖选育在20-30葡萄糖的平板上生长好的突变株。耐高谷氨酸选育在15-20味精的平板上生长好的突变株。耐高糖、高谷氨酸选育在20葡萄糖，加15味精的平板上生长好的突变株。893.选育不分解利用谷氨酸的突变株使用不分解利用GA，切断继续向下氧化的反应，即选育以谷氨酸为唯一碳源，菌体不长或生长微弱的突变株。平板法：选育不长或生长微弱的菌。摇瓶法：选育OD值净增

49、极少的菌。904.选育细胞膜渗透性好的突变株抗VP类衍生物选育溶菌酶敏感性突变株选育二氨基庚二酸缺陷型突变株二氨基庚二酸为细胞壁的组成成分选育温度敏感突变株915.选育强化CO2固定反应的突变株选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株选育氟丙酮酸敏感性突变株氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，菌种对氟丙酮酸越敏感，说明菌种丙酮酸向乙酰CoA的转化反应越弱，相对地固定反应占的比例也就越大。926选育减弱乙醛酸循环的突变株四碳二羧酸是由CO2固定反应和乙醛酸循环所提供的，减弱乙醛酸循环，固定反应所占的比例就会增大，谷氨酸的产率就高选育琥珀酸敏感型突变型琥珀酸是乙醛酸循环关键酶异柠檬酸裂解酶的阻

50、遏物，菌体对琥珀酸越敏感，异柠檬酸裂解酶的合成能力就越弱，乙醛酸循环就越弱。选育不利用醋酸的突变株。937.选育强化TCA中从柠檬酸到代谢的突变株选育柠檬酸合成酶强的突变株柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，强化该酶能加强GA的生物合成。选育抗氟乙酸、氟化钠、氮杂丝氨酸、氟柠檬酸等突变株这些物质都是乌头酸酶的抑制剂，抗这些物质的突变株，可强化乌头酸酶的活力948.选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株谷氨酸比天冬氨酸优先合成选育酮基丙二酸抗性突变株选育耐高谷氨酸突变株选育抗谷氨酸结构类似物突变株选育抗谷氨酰胺的突变株959.选育强化能量代谢的突变株GA高产菌的两个显著的特点是继续向下氧化的