(16)--6-重组DNA的筛选与鉴定生物技术制药.ppt

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1、基因工程菌的构建-重组DNA的筛选与鉴定重组DNA“质检”学习目标理解重组DNA筛选鉴定的三种水平掌握不同水平对重组DNA进行筛选和鉴定的方法1个体水平进行重组DNA筛选鉴定方法2分子水平进行重组DNA筛选鉴定方法3蛋白水平进行重组DNA筛选鉴定方法目录CONTENTS个体水平筛选鉴定方法载体遗传标记法l又称为载体表型选择法l在载体DNA分子中组装一种或两种选择标记基因，重组DNA分子在宿主细胞内表达后，会呈现出特殊的表型或遗传学特性抗生素抗性筛选法-互补筛选法营养缺陷性筛选法噬菌斑筛选法抗生素抗性筛选法抗生素抗性基因编码基因导入导入未导入未导入l将含有特异抗生素抗性基因的载体DNA转入宿主细

2、胞后，将细胞在含有相应抗生素的培养集中培养，带有抗生素抗性基因的细胞能够生长，而没有转入DNA的细胞不能存活，从而达到筛选的目的含相应抗生素培养基上培养可生长不可生长-互补筛选法-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色含有多克隆位点的片段编码序列外源基因载体载体导入细菌导入细菌细菌在含细菌在含Xgal和和IPTG的培养板上培养的培养板上培养细菌染色体DNA编码片段的序列蓝色菌落含空载体白色菌落含重组载体-互补筛选法营养缺陷性筛选法l宿主细胞因基因突变而不能合成生长所必须的营养物质，载体携带合成这些营养成分的一些编码基因

3、，只有含载体DNA的菌落或者细胞才能够在缺少该营养物质的培养基上生长从而实现筛选。受体菌：受体菌：Leu-外源基因：外源基因：Leu+在不含亮氨酸的培养基中生在不含亮氨酸的培养基中生长l噬菌体筛选法：当重组DNA的长度达到野生型的75%105%时，噬菌体才能包装成具有感染活性的颗粒，转化子在固体培养板上出现清晰的噬菌斑噬菌体筛选法l噬菌体有一个重要特性是对包装时的DNA的大小有严格要求l当重组DNA的长度达到野生型的75%105%时，噬菌体才能包装成具有感染活性的颗粒，转化子在固体培养板上出现清晰的噬菌斑l不含外源DNA的空载体因长度过小而不能装配成噬菌体颗粒，不能感染宿主细胞形成噬菌斑分子水

4、平筛选鉴定方法核酸分子杂交法限制性内切酶谱法DNA序列测定法PCR方法菌落原位杂交DNA印迹分析分子水平筛选鉴定方法菌落原位杂交l探针原位杂交法l设计并制备与目的基因某一个区域互补的探针，根据核酸杂交原理，探针序列可以与目的基因序列形成互补碱基配对，然后产生特异的信号。加硝酸纤维素滤膜大肠杆菌菌落转移至硝酸纤维素滤膜 溶菌碱变性除细胞碎片固定变性DNA杂交放射性自显影显示阳性菌落的底片分子水平筛选鉴定方法核酸分子杂交法限制性内切酶谱法DNA序列测定法PCR方法菌落原位杂交DNA印迹分析分子水平筛选鉴定方法（Southern印迹法）印迹法）只能鉴定外源载体DNA和目的基因的存在与否，无法判断插入序列的正确性双脱氧链终止法双脱氧链终止法、化学测序法化学测序法蛋白水平筛选鉴定方法Ab1Ab2-荧光Ab1-酶基团底物Ab1Ab2-酶基团l通过检测编码蛋白表达水平或生物活性筛选、鉴定重组子l酶联免疫吸附分析、免疫组化分析（抗原-抗体反应原理，使用酶、化学发光基团等进行信号放大）Ab1-荧光 总结常见筛选鉴定方法?分别属于什么水平？最准确的筛选方法？基因工程重组DNA筛选与鉴定感谢聆听