苯唑西林耐药金黄色葡萄球分子流行病学调查及糖肽类抗生素对葡萄球菌体外活性研究.ppt

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1、苯唑西林耐药金黄色葡萄球分子流行病学调查苯唑西林耐药金黄色葡萄球分子流行病学调查及及糖肽类抗生素对葡萄球菌体外活性研究糖肽类抗生素对葡萄球菌体外活性研究 孙宏莉王 辉 陈民钧1研究背景研究背景2S.aureusPenicillin1944Penicillin-resistantS.aureusEvolution of Drug Resistance in S.aureusMethicillin1962Methicillin-resistantS.aureus(MRSA)Vancomycin-resistantenterococci(VRE)Vancomycin1990s1997Vancomyc

2、inintermediateS.aureus(VISA)2002Vancomycin-resistantS.aureusCDC,MMWR2002;51(26):565-567研究背景研究背景研究背景研究背景3苯唑西林耐药的金黄色葡萄球（MRSA）是引起医院感染的主要病因，常发生于免疫力低下的住院患者。世界首例MRSA：1961年，英国目前在许多国家仍在增长：研究背景研究背景研究背景研究背景4世界约世界约100,000人人/年感染年感染MRSA国疾病控制和预防中心国疾病控制和预防中心（CDC）统计统计研究背景研究背景研究背景研究背景5欧洲部分国家欧洲部分国家MRSA发生率比较发生率比较%Tiem

3、ersma EW,et al.MRSA in Europe 1999-2002.Emerging infetious Diseases,2004,10(9)1627-1634研究背景61989-2001年美国年美国ICU病房病房MRSA发病率发病率 美国国家医院感染监测中心（美国国家医院感染监测中心（美国国家医院感染监测中心（美国国家医院感染监测中心（NNISNNISNNISNNIS）提供提供提供提供研究背景研究背景研究背景研究背景72001-2003年协和医院年协和医院MRSA发生率比较发生率比较研究背景8内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌的作用机制 青霉素结合蛋白（PBP）是参与细胞壁肽聚糖成

4、分合成的酶。-内酰胺类抗生素能与细菌胞膜的PBP结合使其失活，从而细胞壁合成受到抑制，导致细菌死亡研究背景研究背景研究背景研究背景9对对 内酰胺类抗生素（如苯唑西林）耐药机制内酰胺类抗生素（如苯唑西林）耐药机制：低水平耐药：产生过量的内酰胺酶、PBPs过量表达、PBP与苯唑西林亲和力下降；高水平耐药：产生由mecA基因编码的PBP2a，可替代其它PBP合成细胞壁，但与内酰胺类抗生素亲和力差，而产生耐药。对其它抗生素耐药机制对其它抗生素耐药机制：mecA基因位于一个可移动元件SCCmecDNA，该元件由不同的整合子、转座子等组成，分别编码不同抗生素的耐药基因。MRSA耐药机制耐药机制研究背景研究

5、背景研究背景研究背景10MRSA治疗上的困难治疗上的困难 多重耐药有效治疗药物：万古霉素、替考拉宁、利萘唑烷、链阳霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氯霉素等已出现对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌：多为MRSA 在住院患者间易传播，造成爆发流行研究背景研究背景研究背景研究背景11MRSA耐药性及流行病学研究对于正确治耐药性及流行病学研究对于正确治疗其引起的感染、防止其播散有重要意义。疗其引起的感染、防止其播散有重要意义。研究意义研究意义研究意义研究意义12技术路线技术路线13 从协和医院2002年住院患者分离212株MRSA（表型测定）MRSA的确证（苯唑西林盐琼脂筛选法 mecA-femB 双重

6、PCR法)ICU、RCU病房的MRSA 耐药性检测 回顾性分子流行病学调查（琼脂稀释法；抗生素纸片琼脂扩散法）（脉冲场凝胶电泳）替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性 技术路线技术路线为临床正确防治并减少MRSA的感染提供参考依据同源性分析，跟踪爆发流行趋势，区分新生感染/复发感染、污染菌/病原菌14MRSA的筛选及耐药性检测MRSA医院流行病学调查MRSA感染病例临床资料分析 Part 1Part 2Part 315第一部分：第一部分：MRSA的筛选及耐药性检测的筛选及耐药性检测16MRSAMRSA的表型鉴定的表型鉴定的表型鉴定的表型鉴定MRSAMRSA的确证试

7、验的确证试验的确证试验的确证试验,平板平板平板平板/PCRPCRMRSAMRSA耐药性检测耐药性检测耐药性检测耐药性检测药敏结果数据分析及处理药敏结果数据分析及处理药敏结果数据分析及处理药敏结果数据分析及处理17 一、MRSA的表型鉴定的表型鉴定 待测菌株 革兰氏染色 触酶试验（）（阳性且呈双、链、葡萄状球菌）胶乳凝集试验（测凝集因子、蛋白A）（）疑难菌：API系统和VITEK系统鉴定 苯唑西林药敏试验 （抑菌圈直径 10mm）18二、二、MRSA的确证试验的确证试验mecAfemB双重PCR法苯唑西林-盐琼脂筛选法19苯唑西林盐琼脂筛选试验检测苯唑西林盐琼脂筛选试验检测MRSA方法：（参照N

8、CCLS M100-S13文件中的规定）待测新鲜菌悬液（0.5号比浊管浊度）点种于苯唑西林盐琼脂筛选平皿 （含4%NaCl、6g/ml 苯唑西林的M-H平皿）空气，35孵育24-48小时 生长菌落数1检测结果：212株中有165株金葡菌在筛选平皿生长MRSAMRSA检测检测检测检测20mecAmecAfemBfemB 双重双重PCRPCR法检测法检测MRSAMRSA（原理及方法）原理及方法）mecAmecA：编码编码PBP2aPBP2a，苯唑西林耐药的决定子。苯唑西林耐药的决定子。femBfemB：某些葡萄球菌属染色体辅助基因，编码某些葡萄球菌属染色体辅助基因，编码细胞壁合成所需的一种重要酶。

9、细胞壁合成所需的一种重要酶。MRSAMRSA检测检测检测检测21mecAmecAfemBfemB 双重双重PCRPCR法检测法检测MRSAMRSA（原理及方法）原理及方法）mecA、femB基因在不同种类葡萄球菌中的表达*MRSA MSSA MRSCoN MSSCoN mecA femB 注：MRSA苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌；MRSCoN苯唑西林耐药的凝固酶阴性葡萄球菌 MSSA苯唑西林敏感的金黄色葡萄球菌；MSSCoN苯唑西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌 *JCM.May 2002,P.1821-1823MRSAMRSA检测检测检测检测22 mecAmecAfemBfemB 双重双重PCRP

10、CR法检测法检测MRSAMRSA（原理及方法）原理及方法）PCR PCR PCR PCR扩增扩增扩增扩增mecAmecAmecAmecA和和和和femBfemBfemBfemB基因所用引物基因所用引物基因所用引物基因所用引物*引物名 引物序列 扩增片段长度 MecA1 5-GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A 3 310bp MecA2 5-CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A-3 FemB1 5-TTA CAG AGT TAA CTG TTA CC-3 651bp FemB2 5-ATA CAA ATC CAG CAC GCT CT

11、-3 PCR产物产物310bp、651b处出现荧光条带为阳性处出现荧光条带为阳性 *Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1999,18:643-647.MRSAMRSA检测检测检测检测23mecAmecAfemBfemB 双重双重PCRPCR法检测法检测MRSAMRSA（结果）结果）结果）结果）165株筛选平皿确证的MRSA经双重PCR法进一步确证，均为MRSA。M:marker;16:PCR producs of MRSA;7:ATCC25923（MSSA）MRSAMRSA检测检测检测检测M 1 2 3 4 5 6 724 三、三、MRSA的耐药性检测（方法）的耐

12、药性检测（方法）抗生素纸片琼脂扩散法：万古霉素、替考拉宁、复方新诺明、四环素 琼脂稀释法：万古霉素、替考拉宁、苯唑西林、庆大霉素、左氧氟沙星、红霉素、氯霉素参照NCCLS M100-S13文件：待测菌悬液：0.5号比浊管浊度 药敏培养基：M-H平皿 培养条件：35，空气，孵育24小时 判读结果：按NCCLS M100-S13文件规定的标准数据分析及处理：WHONET-5.3软件MRSAMRSA检测检测检测检测25MRSA的耐药性检测的耐药性检测（结果（结果1）165165种种种种MRSAMRSA对对对对9 9种抗生素的药敏结果：种抗生素的药敏结果：种抗生素的药敏结果：种抗生素的药敏结果：抗生素

13、R%I%S%MIC50MIC90MIC值范围苯唑西林10000646432-64替考拉宁00100220.5-8万古霉素001000.510.25-2庆大霉素1000025651232-512红霉素93.91.84.2128128125-128氯霉素0.60.698.8884-64左氧氟沙星 98.21.8016324-128甲氧苄啶3.60.695.8/磺胺甲恶唑四环素96.31.22.5耐药性检测耐药性检测耐药性检测耐药性检测26MRSA的耐药性检测的耐药性检测（结果（结果2）MIC法测定的万古霉素和替考拉宁对165株MRSA的MICs的散点图耐药性检测耐药性检测耐药性检测耐药性检测27第

14、二部分：第二部分：MRSAMRSA医院流行病学调查医院流行病学调查 （ICUICU、RCURCU病房）病房）28脉冲场凝胶电泳（PFGE）耐药表型和基因型比较29 一、一、MRSA的脉冲场凝胶电泳的脉冲场凝胶电泳（原理）（原理）PFGEPFGE5Kb50Kb500Kb30MRSA的脉冲场凝胶电泳的脉冲场凝胶电泳（结果分型（结果分型2 2）1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 2002年ICU及RCU病房MRSA主要流行株(A1亚型)114 lanes:A1亚型（共55株）;M:ladder markerPFGEPFGE31MRSA的脉冲场凝胶电泳的脉冲场凝胶电泳

15、（结果判读）（结果判读）PFGEPFGECDCTenover*等人推荐的方法判读：突变位点数 酶切后DNA片断区别 亲缘关系 基因分型 0 无区别 同型 1 2-3条 亲缘关系密切 同型但不同亚型 2 4-6条 可能存在亲缘关系 同型但不同亚型 3 7条 无亲缘关系 不同型1.*Tenover FC,JCM,1995,33:2233-2239.32MRSA的脉冲场凝胶电泳的脉冲场凝胶电泳（结果分型（结果分型1 1）5种：A（A1、A2）、B（B1、B2、B3）C、D、E型ICU及及RCU病房病房65株株MRSA的的PFGE图谱图谱 M A1 A2 B1 B1 B2 B2 B3 D D C E

16、M PFGEPFGE33 MRSA部分病例调查结果（三）部分病例调查结果（三）A1亚型爆发流行株（55/65株）分离时间遍布2002全年临床资料临床资料34二、二、MRSA的耐药表型和基因型比较的耐药表型和基因型比较不同基因型（不同克隆来源）相同耐药谱表型表型与与基因型基因型35 序号 病房 分离时间 标本类型 耐药谱 PFGE分型 1 RCU 2002-2-1 痰 OGLER A1 2 ICU 2002-8-1 痰 OGLER A1 3 ICU 2002-10-3 痰 OGLER A1 4 ICU 2002-10-8 痰 OGLER A1 5 ICU 2002-10-14 痰 OGLER A

17、1 6 ICU 2002-1-2 血液 OGLER A1 7 ICU 2002-1-8 痰 OGLER A1 8 ICU 2002-2-4 痰 OGLER A1 9 ICU 2002-4-8 痰 OGLER A1 10 ICU 2002-4-10 导管 OGLER A1 11 ICU 2002-10-3 痰 OGLER A2 12 RCU 2002-10-3 痰 OGLER B1 13 RCU 2002-1-14 痰 OGLER B1 14 RCU 2002-6-2 痰 OGLER B2 15 RCU 2002-12-2 痰 OGLER B2 16 ICU 2002-2-5 腹水 OGLER

18、B3 17 RCU 2002-5-10 导尿管 OGLER C 18 RCU 2002-11-10 痰 OGLER D 19 ICU 2002-7-4 痰 OGLER D 20 ICU 2002-3-2 痰 OGLER E表型表型与与基因型基因型注：O苯唑西林、G庆大霉素、L左氧氟沙星、E红霉素、R四环素36MRSA的脉冲场凝胶电泳的脉冲场凝胶电泳（结果小结）（结果小结）ICU和RCU病房2002全年都在流行着A1亚型MRSA。耐药谱分型与PFGE分型可不一致。37 第三部分：临床资料分析第三部分：临床资料分析38本研究MRSA为多重耐药，基因分型同源性高，造成治疗困难。为找到合理使用抗生素策

19、略及爆发流行源头和传播途径，对部分病例进行了回顾性调查分析，结果发现：临床资料临床资料39MRSA部分病例调查结果（一）部分病例调查结果（一）调查项目调查项目调查结果调查结果疾病 严重感染12/30;癌症7/30;多器官功能衰竭6/30;心、肺、肾衰各1/30年龄 20岁以下1/35;20-40岁4/35;40-70岁21/35;70岁以上9/35标本来源 痰51/65;血液4/65;导尿管3/65;支气管刷、洁尿各2/65；其它3/65器械治疗 呼吸机17/30；置管18/30；大手术11/30临床资料临床资料40MRSA部分病例调查结果（二）部分病例调查结果（二）调查项目调查项目调查结果调

20、查结果抗菌素使用史 25/30住院期间使用过第三、四代头孢菌素、氟喹诺酮类、碳青霉烯类等广谱抗生素。改用万古霉素或替考拉宁后转归 MRSA所致感染好转者占23/29；未好转者6/29同一患者不同分离株时间间隔 8/65采集到不止一株MRSA（间隔至少二周，其中一位长达半年）。MRSA分离时间 2002年1月12月间无明显波动临床资料临床资料41第四部分：第四部分：替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测的体外活性检测42替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性检测替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性检测（方法）（方法）测定替考拉宁和万古霉素的MIC及抑菌圈直径 （琼脂稀释

21、法、K-B法）不同种葡萄球菌 （MRSA、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌）不同接种浓度菌液（104 cfu、106 cfu）活性区别 对MIC结果的影响琼脂稀释法与抗生素纸片扩散法药敏结果的相关性43替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌体外活性检测（结替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌体外活性检测（结果果1 1）不同接种浓度菌液对二种抗生素外活性影响二种抗生素对不同葡萄球菌的活性区别菌名（各10株）接种浓度（cfu）VanMIC(ug/ml)TeiMIC(ug/ml)平均值 MIC值范围平均值 MIC值范围溶血葡萄球菌1041.61-211.62-321065.42-846.416-64表皮葡萄球菌1041.2

22、0.5-22.270.125-161062.150.5-417.850.5-64MRSA1040.850.5-11.450.25-41061.71-27.82-1644替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测（结果（结果2 2）TEC、VAN对葡萄球菌的MIC法与纸片扩散法之间的相关性菌种 标本类型TECVANK-B(mm)MIC(ug/ml)K-B(mm)MIC(ug/ml)Etest法琼脂稀释法Etest法琼脂稀释法判读折点10-148-328-32154-324-32溶葡痰8r24i16i18s3s2s溶葡脑脊液8r24i16i19s2s1s溶

23、葡痰8r24i16i18s3s2s溶葡痰10r12i16i18s4s2s溶葡脓液10r8s8s18s1.5s2s溶葡血液10.5i12s8s18.5s1.5s1.s表葡脓肿12i4s4s18.5s2s2s溶葡脓液8r32r16i19s3s1s溶葡分泌物13i12i32r19s3s2s溶葡血液11i24i16i18.5s4s2s表葡脓液13i8s16i20s2s1s45替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测（结果小结）万古霉素替考拉宁MRSA表葡溶葡MRSA表葡溶葡活性区别（MIC）接种浓度升高，MIC升高幅度MIC法与K-B法相符性较好不好46讨讨

24、论论47 MRSA引起的医院感染与治疗（一）引起的医院感染与治疗（一）是医院感染主要病因，常发生抵抗力低下的住院患者。可引起住院患者的长期感染，不易消除。爆发流行主要途径：共用的医疗器械（如呼吸机）、MRSA携带者 （患者、医护人员等）讨论48MRSA引起的医院感染与治疗（二）引起的医院感染与治疗（二）抗生素选择压力下的后果。使用或改用合理抗生素治疗：多数病人迅速好转；抗生素治疗无效组：病人身体状况太差，药物很难到达有效部位或到达有效部位的抗生素浓度不足，不能完全杀灭耐药菌。讨论49替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外抗菌替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外抗菌活性活性替考拉宁受多种因素影响：在琼

25、脂中扩散系数接种菌量以K-B法检测的替考拉宁耐药菌株，应进一步测定其MIC。通常敏感株 金黄色葡萄球菌 不稳定敏感株 凝固酶阴性葡萄球菌（如溶血葡萄球菌）：细胞膜39kD的蛋白质，阻碍替考拉宁与靶位的结合。万古霉素 对葡萄球菌活性较稳定，但对肠球菌活性较差。讨论50结论结论MRSA耐药性特点万古霉素和替考拉宁高敏100复方新诺明和氯霉素敏感率较高 其它所测抗生素多重高耐2002年ICU、RCU病房发生了A1基因型MRSA流行 MRSA流行病学调查 51治疗及预防MRSA感染及爆发流行的关键：合理使用抗生素合理使用抗生素加强消毒隔离观念加强消毒隔离观念正确的药敏实验正确的药敏实验52MRSA的检测53MRSA：homoMRSA MIC100mg/l hetero-MRSA MIC 1-100mg/l 生长缓慢，常规检测易漏检 54PBP2a的表达 mecA FOX：better inductor of mecA OXA：weak inductor of mecA55 OXA(1ug)FOX(30ug)MRSA 30 100%100%35 93.3%94.7%MRCNS 30 100%100%35 100%100%最佳检测方法FOX(30ug)30 56FOX（K-B)筛选MRSA20mmMRSA20-23mm中度敏感 PCR、乳胶凝集试验 24mmMSSA5758