未培养和极端微生物课件.ppt

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1、未培养微生物和极端微生物未培养微生物和极端微生物的研究进展的研究进展未培养微生物的研究和应用第一部分经典分类方法：以形态学及其生化特征分类，不足是不能提供进化和自然的关系；经典分类的进展：以16SrRNA序列相似性为代表，序列同源性97以上定义为一个种；经典培养方法：纯培养方法不足：约有50-100万种原核微生物，目前记载不足5000种经典微生物分类与培养黄石公园Obsidian Pool的故事75 95 OC,富含Fe(II)、H2S、H2、CO2Ward采用采用16SrRNA方法进行了研究，发现方法进行了研究，发现同源性只有同源性只有94.7%Nanoarchaeum equitans来自

2、冰岛海底热溢口的怪异新古菌球菌：直径约为400 nm基因组：500 kb与一特异古菌宿主共生极端嗜热（90）特殊rRNA：古菌中新的一界N.equitansIgnicoccus99%的微生物尚属未知 Amann,Ludwig&Schleifer,Microbiol.Rev.59:143(1995)一个“看不见”的事实微生物：分布最广 界定生物圈范围 生物量最大 占总生物量的 60%物种及代谢多样性最为丰富一个重要的认识一个重要的认识 自然界中已知微生物仅占总数的不到1%。“未知微生物或许是地球上最大的尚未开发的自然资源。”James Stanley未培养微生物未培养微生物（uncultured

3、 microorganisms):无法采用现有常规方法在实验室里培养的微生物。常规方法：温度范围：10-70；压力范围：常压条件；pH范围：2-10；耐盐范围：低盐范围 共同协作的自然生存方式的崩溃共同协作的自然生存方式的崩溃互养和共代谢，共栖、互生与共生；互养和共代谢，共栖、互生与共生；急剧改变的生态位急剧改变的生态位大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需要提供其群落中的小生态环境，即生态位；要提供其群落中的小生态环境，即生态位；1、未培养微生物存在的生态原因、未培养微生物存在的生态原因生长环境的极度营养变化生长环境的极度营养变化对环境资源高亲和性的

4、对环境资源高亲和性的K型，适应低营养含量型，适应低营养含量和极低的生长率；和极低的生长率；潜在外源活性物质的缺乏潜在外源活性物质的缺乏纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活性物质；性物质；1、未培养微生物存在的生态原因、未培养微生物存在的生态原因2.1 2.1 宏基因组技术宏基因组技术 基本思路是直接提取环境微生物的总基因组基本思路是直接提取环境微生物的总基因组DNA,用用核酸内切酶进行部分消化核酸内切酶进行部分消化,再与载体连接再与载体连接,转入宿主细胞转入宿主细胞,构建基因文库，通过筛选文库来寻找目的基因的阳性克构建基因文库，通过筛选文库来寻找目的

5、基因的阳性克隆；隆；优点优点：不受已知基因的同源性序列的限制不受已知基因的同源性序列的限制,因而所获得的基因而所获得的基因往往结构很新颖；因往往结构很新颖；2、未培养微生物的分子生物学研究方法、未培养微生物的分子生物学研究方法实实例例Rondon等以细菌人工染色体作为载体构建了两个土等以细菌人工染色体作为载体构建了两个土壤未培养微生物基因组文库，筛选到壤未培养微生物基因组文库，筛选到41个分别编码脂肪个分别编码脂肪酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，DNA序列与已知序列有很大的差异，其中一个编码的抗序列与已知序列有很大的差异，其中一个

6、编码的抗菌肽结构属于新的基因家族菌肽结构属于新的基因家族；传统培养和宏基因组流程比较2.2 2.2 遗传指纹图谱技术遗传指纹图谱技术核酸指纹图谱技术即核酸指纹图谱技术即DNA指纹图谱法是指纹图谱法是1985年由年由Jeffreys等等提出，它是通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针杂交提出，它是通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针杂交取得不同大小的取得不同大小的DNA片段的多点区带图谱，并与另一个片段的多点区带图谱，并与另一个DNA图图谱比较以评价其相似性的技术。谱比较以评价其相似性的技术。优点优点：不受显隐性关系、环境和发育阶段的影响，允许同时进行多不受显隐性关系、环境和发育阶段的影响

7、，允许同时进行多样本分析；样本分析；缺点缺点：过于依赖内切酶的选用过于依赖内切酶的选用，且，且方法繁杂方法繁杂、周期长周期长、实验条件高实验条件高等缺陷而无法大范围推广等缺陷而无法大范围推广；方法方法：梯度凝胶电泳技术，核酸杂交技术等梯度凝胶电泳技术，核酸杂交技术等3.1 3.1 用低浓度的培养基来进行分离培养用低浓度的培养基来进行分离培养 一般认为一般认为,传统的培养基营养太丰富传统的培养基营养太丰富,不适合于那些原先生长不适合于那些原先生长在缺乏营养的环境中的微生物在缺乏营养的环境中的微生物,如海洋微生物；如海洋微生物；实例实例1：Connon等用比实验室中常用的培养基营养低等用比实验室中

8、常用的培养基营养低3个数量级个数量级,小小体积、低营养的培养基来分离海洋中的微生物。从体积、低营养的培养基来分离海洋中的微生物。从11个样品中个样品中分离出分离出20500个培养物，其中有个培养物，其中有4个单细胞系是以前从未培养过、个单细胞系是以前从未培养过、也从未描述过的。通过这种方法，使海洋样品中浮游细菌的可也从未描述过的。通过这种方法，使海洋样品中浮游细菌的可培养率提高到培养率提高到14%，比以前提高了，比以前提高了141400倍。倍。3、未培养微生物的可培养方法、未培养微生物的可培养方法 让培养条件尽量模拟成原先的自然状态，如用土壤浸让培养条件尽量模拟成原先的自然状态，如用土壤浸提物

9、和海水滤过液来制作培养基提物和海水滤过液来制作培养基,该方法已趋成熟该方法已趋成熟；实例2：ZenglerK等设计了一个非常精妙的方法等设计了一个非常精妙的方法，将细胞包埋在将细胞包埋在凝胶微滴板中凝胶微滴板中，在低营养的流动培养液中进行培养在低营养的流动培养液中进行培养，再用流再用流动血细胞计数法检测微滴板上有多少个微克隆动血细胞计数法检测微滴板上有多少个微克隆。这是一个开这是一个开放流动的系统放流动的系统，微生物间的代谢产物及信号分子可在凝胶空微生物间的代谢产物及信号分子可在凝胶空隙中进行扩散而被其他菌利用。这与自然环境有很多的相似隙中进行扩散而被其他菌利用。这与自然环境有很多的相似之处之

10、处，因而新培养出来的微生物种类也大大增加。因而新培养出来的微生物种类也大大增加。这种方法可用于包括土壤和海水的各种环境这种方法可用于包括土壤和海水的各种环境；3.2根据微生物特性根据微生物特性特异添加营养成分变成可培养特异添加营养成分变成可培养实例实例1：Kashefi等根据嗜高热微生物利用等根据嗜高热微生物利用Fe(III)作为终端电子受作为终端电子受体这一高度保守的特性体这一高度保守的特性，在培养基中添加非常微量的在培养基中添加非常微量的Fe(III)氧化物。氧化物。该该方法的前提是对微生物特性有一定的了解方法的前提是对微生物特性有一定的了解。实例实例2：Santini等从澳大利亚金矿中分

11、出以亚砷酸为电子供体，氧等从澳大利亚金矿中分出以亚砷酸为电子供体，氧为受体，以为受体，以CO2为唯一碳源的化能自养菌（为唯一碳源的化能自养菌（NT-26）。）。16SrDNA序列分析表明，序列分析表明，NT-26属于属于-Proteobacteria土壤土壤杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种。杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种。环境样品混合基因组DNADNA文库目标基因/基因簇细胞破碎、DNA提取克隆活性筛选同源筛选未培养微生物基因资源的开发基于培养非依赖（culture-independent）技术的尝试克隆酶生物活性物质PCR1.环境样品DNA的提取和纯化细胞收集法Agarose plug

12、直接裂解法物理法：研磨、超声波、冻融、bead beating化学法：溶菌酶、Proteinase K、SDS、酚等DNA提取DNA纯化 CTAB、PVPP CsCl密度梯度离心、电洗脱、柱层析等2.文库筛选测序/基因注释活性筛选常规活性检测基于BAC的功能基因组学平台同源筛选PCR方法、分子杂交微排列技术、DNA芯片DNA产量和回收率产量和回收率国内研究实例国内研究实例1王啸波等，微生物学报，王啸波等，微生物学报，20012001，4141（2 2）：）：133-140133-140Restriction digestion of three purified environmental D

13、NA samples分离自环境样品的纯化DNA的酶切试验Size distribution of inserts in randomly selected clones腾冲热泉试验文库：库容约1 Mb；插入片段为3-8 kb环境样品DNA文库构建环境样品DNA文库的初步评估Gene annotation of partial DNA sequences derived from inserts in randomly selected clones20个随机克隆插入片段 12个可预测功能开放阅读框 序列均未见报道研究结果简要分析研究结果简要分析20个测序样品中，14个为新序列；14个序列中12

14、个含可预测功能的基因；样品e6含编码硫氧蛋白还原酶基因一部分；样品9918含蛋白二硫键异构酶基因一部分；为相关酶的性能改造提供基础Davies的工作(1997)土壤样品混合基因组DNAPolyketide synthase基因PCR国外研究实例1J.Davies(1997)从土壤中直接获得全长KSb基因的策略J.Davies(1997)KSa和KSb基因产物的系统发育学关系Handelsman和Goodman的工作(1998)土壤样品混合基因组DNA元基因组文库（BAC文库）酶、小分子活性物质元基因组（metagenome):环境中所有微生物基因组的总和。国外研究实例2 Handelsman&

15、Goodman(1998)两个土壤元基因组文库（库容：1 Gbp）Handelsman&Goodman(1998)Handelsman&Goodman(1998)未培养微生物系统发育学分析与生物学分析的偶联基因簇的克隆 Handelsman&Goodman(1998)Osburne et al.(2000)抗细菌活性的筛选Diversa公司(1995-)未培养微生物基因资源大规模开发的先驱采集全球各种生态环境样品高效筛选新基因、基因簇针对不同应用需要优化基因及基因簇获得高效、高稳定性酶和小分子生物活性物质5,000 genomes109 clones108109 clone.assays/da

16、yDiversa产品“酶订购计划”数百种新酶ThermalAce DNA polymerase(由Invitrogen销售）Replicase微生物世界的淘金者DiversaARIAD Pharmaceuticals,Inc.TerraGen Discovery,Inc.Khosan Biosciences,Inc.Maxygen,Inc.新世纪的挑战新世纪的挑战任务：了解自然界中微生物的种类、相互作任务：了解自然界中微生物的种类、相互作用、对环境的影响；开发微生物资源用、对环境的影响；开发微生物资源解决方案解决方案代表性生态环境的系统生态学研究代表性生态环境的系统生态学研究发展新的富集培养和

17、分离策略，结合采用分子发展新的富集培养和分离策略，结合采用分子生物学和培养依赖方法，研究未培养微生物生物学和培养依赖方法，研究未培养微生物微生物系统科学：微生物系统科学：技术集成、学科集成技术集成、学科集成极端微生物及其生物技术价值极端微生物及其生物技术价值第二部分第二部分一、极端微生物的概念研究的需求：研究的需求：许许多多工工业业过过程程需需要要高高压压、高高温温、低低温温、高高盐盐碱碱或或耐耐辐辐射射条条件件，一一般般生生物物催催化化剂剂难难以以胜胜任任苛苛刻条件下的工作刻条件下的工作；定义：定义：是是依依赖赖于于一一种种或或多多种种极极端端物物化化因因子子的的极极端端生生命命形形式式，在

18、在100100以以上上或或00以以下下、近近饱饱和和的的盐盐度度、pH10pH10或或pH2pH2、高高压压和和放放射射条条件件等等极极端端环环境下的极端生命形式境下的极端生命形式.二、极端微生物的类型嗜热菌嗜热菌(thermophiles)(thermophiles)嗜冷菌嗜冷菌(psychrophiles)(psychrophiles)嗜碱菌嗜碱菌(alkaliphiles)(alkaliphiles)嗜酸菌嗜酸菌(acidophiles)(acidophiles)嗜盐菌嗜盐菌(halophiles)(halophiles)嗜压菌嗜压菌(barophiles)(barophiles)三、极

19、端微生物的应用潜力PCRPCR技术中的高温技术中的高温Tag DNATag DNA聚合酶；聚合酶；洗涤剂洗涤剂中的高温蛋白酶和脂肪酶、碱性蛋白和脂肪酶；中的高温蛋白酶和脂肪酶、碱性蛋白和脂肪酶；极极端端嗜嗜盐盐菌菌生生产产PHBPHB、核核苷苷酸酸，将将大大大大简简化化后后处处理理工工艺，降低生产成本；艺，降低生产成本；油油田田的的油油层层多多为为极极端端环环境境（高高温温、高高压压、高高盐盐、厌厌氧氧），一一般般微微生生物物难难以以发发挥挥作作用用，极极端端微微生生物物将将会会带带来来采采油技术的一场革命油技术的一场革命极端微生物的应用潜力在在含含硫硫的的低低品品位位矿矿床床中中，硫硫杆杆菌

20、菌可可产产生生大大量量硫硫酸酸，使使pHpH降降得得很很低低，溶溶出出很很多多贵贵重重金金属属。对对极极端端嗜嗜酸酸菌菌特别是嗜酸嗜热菌的深入研究，已实现了湿法冶金；特别是嗜酸嗜热菌的深入研究，已实现了湿法冶金；污污染染环环境境中中，盐盐碱碱度度高高、毒毒物物浓浓度度高高、环环境境温温度度低低，普普通通的的生生物物技技术术治治理理难难有有作作为为，而而极极端端微微生生物物可可在在高高盐盐碱碱、低低温温条条件件下下行行使使最最佳佳功功能能，在在环环境境整整治治中中将大有作为。将大有作为。极端微生物的应用潜力极极端端微微生生物物具具有有多多样样的的代代谢谢类类型型，通通过过对对代代谢谢途途径径的的

21、认认识识与与改改造造，极极端端微微生生物物可可过过量量积积累累有有机机酸酸、氨基酸等，实现超级生产；氨基酸等，实现超级生产；嗜嗜热热微微生生物物可可实实现现酒酒精精的的真真正正高高温温发发酵酵，实实现现酒酒精精在在发发酵酵过过程程中中的的分分离离蒸蒸馏馏，引引发发酒酒精精生生产产工工艺艺的划时代变革；的划时代变革；极端微生物的应用潜力农农产产品品加加工工中中，一一般般生生物物过过程程无无法法实实现现对对纤纤维维素素、半半纤纤维维素素的的有有效效转转化化。在在极极端端条条件件下下行行使使功功能能的的极极端端微微生生物物及及其其极极端端酶酶可可在在高高温温、酸酸、碱碱等等条条件件下下对对秸秸杆杆、

22、废废渣渣等等进进行行处处理理，为为解解决决资资源源的的有有效效转转化化利利用提供新途径。用提供新途径。极极端端微微生生物物已已经经适适应应了了各各种种各各样样的的极极端端环环境境，因因而而提提供供了了一一个个特特有有的的遗遗传传信信息息来来源源，从从中中发发掘掘新新型型产产物极具潜力物极具潜力.四、极端微生物的国内外研究进展美美国国近近年年来来非非常常注注重重极极端端微微生生物物的的研研究究，不不仅仅在在基基础础研研究究方方面面开开展展了了系系统统的的工工作作，在在极极端端微微生生物物的的生生物物技技术术利利用用方方面面已已经经开开始始实实用用化化，高高温温DNADNA聚聚合合酶酶、碱碱性性酶

23、酶及及极极端端采采油油菌菌已已在在产产业业上上产产生生了了重重要要影影响响，为为推推动动整整个个生生物物技技术术领领域域的的发发展展、协协调调环环境境与与可可持持续续发发展展等等方方面面作作出出了了重重要要贡贡献献。在在基基因因芯芯片片、新新材材料料、新新药药等等方方面面，对对极极端端微微生生物物的的作作用用也也有有很很高高的的期望。期望。极端微生物的国内外研究进展欧欧洲洲是是开开展展极极端端微微生生物物研研究究较较早早的的地地区区，他他们们主主要要研研究究极极端端微微生生物物生生命命机机理理的的分分子子基基础础及及新新酶酶、新新产产物物的的开开发发。欧欧盟盟于于9797年年启启动动一一个个耗

24、耗资资12001200万万美美元元的的计计划划“极极端端细细胞胞工工厂厂”，探探索索极极端端微微生生物物在在不不同同工工业业中中的的可可能能用用途途，已已于于9999年年1111月月结结束束。作作为为欧欧盟盟的的整整体体策策略略，极极端端微微生生物物项项目目的的目目的的是是“利利用用生生物物技技术术改改造造现现在在的的化化学学工工业业过过程程”，项项目目协协调调人人AntrinikanAntrinikan教教授授认认为为，极极端端微微生生物物工工业业的时代已经到来。的时代已经到来。极端微生物的国内外研究进展日日本本对对极极端端微微生生物物研研究究起起始始于于19681968年年，K.K.Hor

25、ikoshiHorikoshi教教授授有有极极端端微微生生物物研研究究之之父父之之称称，正正是是他他的的工工作作使使人人们们认认识识到到了了极极端端微微生生物物的的价价值值。他他们们开开发发了了大大量量的的嗜嗜碱碱菌菌及及其其碱碱性性酶酶，获获得得了了2020多多种种碱碱性性酶酶的的专专利利，碱碱性性纤纤维维素素酶酶、环环糊精酶、蛋白酶等都在工业中得到了实际应用。糊精酶、蛋白酶等都在工业中得到了实际应用。19911991年年 日日 本本 开开 始始 实实 施施 了了 著著 名名 的的 深深 海海 之之 星星（Deep-starDeep-star）计计划划，耗耗资资5050亿亿日日元元进进行行为

26、为期期5 5年年深深海海极极端端微微生生物物的的研研究究，现现在在每每年年仍仍维维持持300300万万美美元元的的资资助助，从从深深海海中中获获得得了了10001000多多株株嗜嗜压压、嗜嗜冷冷、嗜嗜热热、嗜嗜碱碱及及耐耐有有机机溶溶剂剂的的多多类类型型的的极极端端微微生生物物，最最引引人人注注目目的的则则是是耐耐有有机机溶溶剂菌，可耐受的溶剂浓度可达剂菌，可耐受的溶剂浓度可达5050。极端微生物的国内外研究进展极端微生物菌株发现极端微生物菌株发现获获得得了了产产生生耐耐热热、盐盐、碱碱、酸酸的的酯酯酶酶、蛋蛋白白酶酶、纤纤维维素素酶酶、半半纤纤维维素素酶酶、淀淀粉粉酶酶、过过氧氧化化氢氢酶酶

27、等等酶酶的的极端微生物237株，完完成成了了其其中中183株菌的系统发育学分析，获得新的分类单位。发发现现了了一一些些极极端端微微生生物物类类群群与与产产酶酶关关系系,如如 首 次 证证 明明 了了 Halomonas和和 Bacillus rRNA第第7类类群群是是碱碱湖湖中中主主要要的的多多糖糖水水解酶产生者解酶产生者.我国的研究进展实例我国的研究进展实例盐盐湖湖分分离离的的部部分分嗜嗜盐盐古古菌菌产产酶酶分分析析淀粉酶：淀粉酶：35 35 株株,酯酶：酯酶：6565株株,蛋白酶：蛋白酶：2424株株产产水水解解酶酶嗜嗜碱碱菌菌的的系系统统发发育育分分析析n 建立环境基因文库建立环境基因文

28、库168Mn 环境基因文库构建技术和高通量筛选技术环境基因文库构建技术和高通量筛选技术n 分离新酶基因分离新酶基因6个个环境基因文库构建与酶基因筛选环境基因文库构建与酶基因筛选环境基因文库环境基因文库LibrarySourceVectorE.ColiHoststrainNo.clonesInsertsizeTC1,TC3 TC5 TC7&TC9Chinese geothermalpCRT7/CT-TOPOTop 10 F60,0000.5 kbTC1,TC3 TC5 TC7&TC9Chinese geothermalpCRT7/CT-TOPOBL 21(DE3)pLySs60,0000.5 k

29、bLP3,TC1,TC5,TC7,TC9Chinese geothermalpCRT7/CT-TOPOTop 10 F4003 kbEN2Chinese halophile pCRT7/CT-TOPOTop 10 F70002 kb 热泉样品热泉样品DNADNA文库文库120Mb120Mb 载体为载体为pCRT7/CT-TOPOpCRT7/CT-TOPOLibraryE.coli HostcloningvectorNo.ofclones1HT-EcoRITOP10pUC19-EcoRI1.0002HT-HindIIITOP10pUC19-HindIII2.0003TC11TOP10pUC19-

30、HindIII5.0004TC12isolateDH5apUC1840.000 盐碱湖样品盐碱湖样品DNADNA文库文库48Mb48Mb 载体为载体为pUC19pUC19，插入片段插入片段2-6kb2-6kb1.1 kb2.8 kb11.5 kb5.0 kb1，高温高温alpha-glucosidasegene：2.2kb,与其它酶的相似性小于与其它酶的相似性小于51，2，碱性，碱性-mannanasegene，1479bp,与其它酶的相似性小于与其它酶的相似性小于593，碱性碱性-amylasegene：1761bp,与其它酶基因相似性小于与其它酶基因相似性小于304，高温，高温6-phos

31、phate-beta-glucosidase2.4kb,与其它酶的相似性小于与其它酶的相似性小于515，酸热，酸热-mannanasegene，27%partlytoendo-1,4-beta-mannocidase6，碱热酯酶基因，碱热酯酶基因新基因新基因获得6个新基因极端酶纯化表征与结构功能极端酶纯化表征与结构功能碱性过氧化氢酶碱性过氧化氢酶 分子量分子量140kd 140kd 温度温度20-4020-40,pH11,pH11碱性淀粉酶碱性淀粉酶 分子量分子量 60kD 60kD 温度温度5050 ，pH10pH10碱性甘露聚糖酶碱性甘露聚糖酶 分子量分子量 50kD 50kD 温度温度7

32、070 ，pH9.5pH9.5酸性甘露聚糖酶酸性甘露聚糖酶 分子量分子量 38kD 38kD 温度温度6565 ，pH5.5 pH5.5 高温葡萄糖苷酶高温葡萄糖苷酶 分子量分子量 92kD 92kD 温度温度6565 ，pH5.7pH5.7 分子量分子量102kD 102kD 温度温度9090 ，pH6pH6结构与功能研究结构与功能研究位点突变与酶特性的关系位点突变与酶特性的关系野生型甘露聚糖酶及其突变型特性比较野生型甘露聚糖酶及其突变型特性比较 野生型甘露聚糖酶及其突变型预测的三维结构的比较野生型甘露聚糖酶及其突变型预测的三维结构的比较已获得结晶，为揭示酶结构与功能、酶多样性的已获得结晶，

33、为揭示酶结构与功能、酶多样性的结构机制奠定了基础。结构机制奠定了基础。收集不同种收集不同种属的海绵属的海绵5 5种种 从繁茂膜海绵分离的放线菌，大部分属于链霉菌属从繁茂膜海绵分离的放线菌，大部分属于链霉菌属StreptomycesStreptomyces，一些分属，一些分属6 6个稀有放线菌属。其中一株与个稀有放线菌属。其中一株与Actinoalloteichus Actinoalloteichus cyanogriseuscyanogriseus，相似度为，相似度为96.7%96.7%，可能是一新种，可能是一新种。放线菌放线菌300300株株细菌细菌100100株株真菌真菌100100株株甲

34、壳素降解酶甲壳素降解酶过氧化物酶过氧化物酶海洋微生物多样性海洋微生物多样性Effectoforganicsolvents（50）ontheactivityofYP1Aprotease50%(V/V)organic solvent,40 C,200 rpm for 2 h.The tube with the addition of buffer instead of solvents was used as control.Effect of organic solvents on substrate specificity of YP1A proteaseDMFDMSO异丙醇异丙醇L-Glut

35、amicacid-（4-nitroanilide）N95.3NL-Alanine-4-nitroanilidehydtochloride4.22.70.0L-Leucine-nitroanilide20.612.533.7L-Lysine-nitroanilidedihydrobromide1.20.033.7Z-L-Phe-nitroanilide0.00.0100NundissolvedThe YP1A protease showed different substrate specificity responding with the different solventsEffect o

36、f organic solvents on the activity of LP8 lipase Anovellipasewithhighactivityinorganicsolvents fromPseudomonas aeruginosa YJ0125%(V/V)organic solvent,40 C,140 rpm for 3 h五、极端微生物的商业应用19971997年年GenecorGenecor公公司司推推出出了了碱碱性性纤纤维维素素酶酶103103作作为为洗洗涤涤剂剂的的添添加加剂剂，预预计计该该酶酶的的年年市市场场销销售售额额可达到可达到6 6亿美元。亿美元。美美国国Dive

37、rsaDiversa公公司司自自19941994年年底底成成立立以以来来，已已获获得得340340多多种种新新型型极极端端克克隆隆酶酶。这这些些酶酶具具有有在在某某些些极极端端条条件件下下（高高温温、低低温温、极极端端pHpH、高高盐盐、有有机机溶溶剂剂等等）稳稳定定的的特特性性，因因而而可可以以满满足足某某些些工业应用的特殊需要。工业应用的特殊需要。六、极端微生物的研究进展6060年年代代主主要要研研究究极极端端环环境境微微生生物物生生态态、新新菌菌种种的的分分离离鉴定、理化特性及酶的筛选应用；鉴定、理化特性及酶的筛选应用；9090年年代代后后期期，极极端端微微生生物物的的研研究究蓬蓬勃勃发

38、发展展，对对极极端端微微生生物物的的系系统统分分类类、生生态态、生生理理、生生化化、遗遗传传以以及及生生物物技术利用开展了系统的研究；技术利用开展了系统的研究；研研究究主主要要类类群群包包括括低低温温、高高温温菌菌，嗜嗜盐盐菌菌，嗜嗜碱碱菌菌、嗜嗜酸酸菌菌，嗜嗜压压菌菌，及及有有机机溶溶剂剂、辐辐射射等等因因素素相相关关的的其其它极端菌。它极端菌。1、嗜热微生物的研究发现的嗜热菌已有发现的嗜热菌已有2020多个属，包括古菌及细菌，多个属，包括古菌及细菌，一般最适生长温度在一般最适生长温度在9090以上的微生物，温度的以上的微生物，温度的上限已到上限已到113113 C C，在系统进化、蛋白质结

39、构与功，在系统进化、蛋白质结构与功能及热稳定酶的应用等方面的贡献突出；能及热稳定酶的应用等方面的贡献突出；如斯坦福大学学者发现的古细菌，最适生长温度如斯坦福大学学者发现的古细菌，最适生长温度为为100100，降到，降到8080以下即失活；以下即失活；美国的巴罗斯发现一些从火山口分离出的细菌可美国的巴罗斯发现一些从火山口分离出的细菌可以生活在以生活在250250的环境中；的环境中；嗜热菌的适应机理蛋白质的稳定性高蛋白质的稳定性高：氨基酸组成以氨基酸组成以LeuLeu、Pro Pro、GluGlu和和ArgArg为主，具有较高荷电氨基酸组成和平均疏水性，有为主，具有较高荷电氨基酸组成和平均疏水性，

40、有利于高温下蛋白质结构的稳定性；另稍长的螺旋结构、利于高温下蛋白质结构的稳定性；另稍长的螺旋结构、三股链组成的三股链组成的折叠结构、以及折叠结构、以及C C末端和末端和N N末端氨基酸末端氨基酸残基间的离子作用，有利于形成紧密而有韧性的结构；残基间的离子作用，有利于形成紧密而有韧性的结构；细胞被膜结构细胞被膜结构：除具有肽聚糖外还有六角形排列的外：除具有肽聚糖外还有六角形排列的外膜蛋白组成的类似鞘的外层结构，如能在膜蛋白组成的类似鞘的外层结构，如能在110110生长的生长的细菌具有蛋白表面层（细菌具有蛋白表面层（PSPS）或糖蛋白表面层（）或糖蛋白表面层（GPSGPS）组）组成，其中成，其中G

41、PSGPS在碱性在碱性2%2%的的SDSSDS煮沸下都不破坏，可保持煮沸下都不破坏，可保持细胞的形态；细胞的形态；嗜热菌的适应机理不同的代谢途径：不同的代谢途径：嗜热脂肪芽孢杆菌中的磷酸甘嗜热脂肪芽孢杆菌中的磷酸甘油脱氢酶在油脱氢酶在9090仍稳定；仍稳定；菌体内特有酶菌体内特有酶：超嗜热古细菌含有一种逆促旋酶，：超嗜热古细菌含有一种逆促旋酶，9090活性最高，形成的正性超螺旋能增加活性最高，形成的正性超螺旋能增加DNADNA分子分子双链的拓扑环数目，有助于双链的拓扑环数目，有助于DNADNA在特殊高温下维持在特殊高温下维持状态，避免变性；状态，避免变性；2、嗜冷微生物的研究嗜冷菌的研究远不如

42、嗜热菌那样广泛，主要分布嗜冷菌的研究远不如嗜热菌那样广泛，主要分布在南北极、高山、土壤及深海微生物中；在南北极、高山、土壤及深海微生物中；嗜冷微生物主要有：真细菌、蓝细菌、酵母菌等；嗜冷微生物主要有：真细菌、蓝细菌、酵母菌等；生长温度：嗜冷型生长温度：嗜冷型0-150-15，耐冷型，耐冷型0-50-5，高于，高于1010无法生长；无法生长；嗜冷菌的适应机理膜组分的变化膜组分的变化：脂类组成脂肪酸随温度变化，不脂类组成脂肪酸随温度变化，不饱和脂肪酸在低温下向饱和脂肪酸转变；饱和脂肪酸在低温下向饱和脂肪酸转变；重要代谢产物的生成重要代谢产物的生成：细胞质内海藻糖含量变化：细胞质内海藻糖含量变化可增

43、强失水生存能力，避免因温度降低而导致胞可增强失水生存能力，避免因温度降低而导致胞内形成冰晶；同时糖类的羟基与磷脂的磷酸基形内形成冰晶；同时糖类的羟基与磷脂的磷酸基形成氢键，阻止膜失水融合，并降低相变温度，不成氢键，阻止膜失水融合，并降低相变温度，不易向凝胶相转变，从而增加膜的流动性，提高抗易向凝胶相转变，从而增加膜的流动性，提高抗冷能力；冷能力；嗜冷菌的适应机理具有大量带负电的氨基酸残基：具有大量带负电的氨基酸残基：底物易接近活性底物易接近活性中心，具有相对柔韧性和小的功能域；酶分子松中心，具有相对柔韧性和小的功能域；酶分子松散，有较大可变性；散，有较大可变性；菌体内特有酶菌体内特有酶：部分酶

44、对温度敏感，属冷活性酶：部分酶对温度敏感，属冷活性酶类；类；冷休克蛋白冷休克蛋白：增强微生物的低温限制；：增强微生物的低温限制；嗜嗜盐盐古古菌菌已已有有9 9个个属属,在在区区系系生生态态方方面面，死死海海、非非洲盐碱湖的研究当属典型，获得了大量资源洲盐碱湖的研究当属典型，获得了大量资源;从从死死海海、死死谷谷，我我国国的的新新疆疆和和内内蒙蒙古古的的盐盐碱碱湖湖中中分离得到，一般生活在分离得到，一般生活在10-20%10-20%的盐溶液中；的盐溶液中；嗜嗜盐盐菌菌的的生生理理、生生化化及及遗遗传传是是极极端端微微生生物物学学科科中中的的传传统统内内容容，由由于于嗜嗜盐盐菌菌的的产产物物不不易

45、易在在普普通通受受体体系系统统中中表表达达活活性性，嗜嗜盐盐菌菌的的遗遗传传系系统统也也是是人人们们热热心的内容心的内容;嗜嗜盐盐菌菌的的应应用用潜潜力力表表现现在在相相似似性性溶溶质质、酶酶、多多聚聚物、脂质体、医药以及环境整治等方面。物、脂质体、医药以及环境整治等方面。3、嗜盐极端微生物的研究嗜盐菌的适应机理膜组分的变化：膜组分的变化：在高盐低氧环境中主要以细菌视紫质在高盐低氧环境中主要以细菌视紫质（如视紫醛蛋白）为代表，这种光驱（如视紫醛蛋白）为代表，这种光驱“质子泵质子泵”可弥补可弥补高盐下底物有氧氧化的能量不足；高盐下底物有氧氧化的能量不足；重要代谢产物的生成重要代谢产物的生成：细胞

46、内能积累高浓度钾离子或钠：细胞内能积累高浓度钾离子或钠离子（离子（4-5mol/L)4-5mol/L)；或胞内积累大量小分子极性物质，；或胞内积累大量小分子极性物质，如甘油、单糖等，均可帮助细胞从高盐环境中吸取水分如甘油、单糖等，均可帮助细胞从高盐环境中吸取水分细胞壁成分不同：细胞壁成分不同：不含肽聚糖而以脂蛋白为主；不含肽聚糖而以脂蛋白为主；菌体内特有酶菌体内特有酶：部分酶含有较高酸性氨基酸比率，使酶：部分酶含有较高酸性氨基酸比率，使酶分子表面具有水保持层，从而阻止酶分子的相互凝集；分子表面具有水保持层，从而阻止酶分子的相互凝集；4、嗜碱微生物的研究多多数数生生活活在在盐盐碱碱湖湖、碱碱湖湖

47、或或碱碱池池中中，生生活活pH11.5pH11.5以上，最适以上，最适pH8-10pH8-10；嗜嗜碱碱菌菌的的生生理理学学知知识识仅仅建建立立在在兼兼性性嗜嗜碱碱芽芽孢孢杆杆菌菌OF4OF4及及C125C125研研究究的的基基础础上上，嗜嗜碱碱菌菌真真正正的的生生理理机机制还是个谜制还是个谜;嗜嗜碱碱菌菌的的蛋蛋白白不不能能在在普普通通受受体体中中表表达达或或正正确确折折叠叠，但对嗜碱菌的受体系统还没有任何努力但对嗜碱菌的受体系统还没有任何努力;嗜嗜碱碱菌菌及及其其酶酶的的应应用用潜潜力力极极大大，商商业业期期望望值值最最高高，仅仅用用于于洗洗涤涤剂剂的的碱碱性性纤纤维维素素酶酶的的预预计计

48、市市场场为为6 6亿亿美元；美元；5、其他类型极端微生物的研究嗜嗜酸酸微微生生物物主主要要生生长长在在酸酸性性环环境境：硫硫矿矿、金金属属硫硫化化酸酸性性矿矿水水、含含硫硫的的酸酸性性土土壤壤和和煤煤矿矿排排出出水水等等；生长生长pHpH一般为一般为1-51-5；嗜嗜酸酸微微生生物物的的适适应应机机制制主主要要有有：泵泵说说、屏屏蔽蔽说说和和柯南平衡说，主要以屏蔽说为主；柯南平衡说，主要以屏蔽说为主；嗜嗜压压微微生生物物一一般般生生活活在在深深海海底底，多多数数生生长长在在0.7-0.7-0.8MPa,0.8MPa,有有的的高高达达1.04MPa1.04MPa以以上上；但但具具体体的的适适应应

49、机机制不十分清楚；制不十分清楚；5、其他类型极端微生物的研究嗜嗜辐辐射射微微生生物物能能在在紫紫外外光光、电电离离辐辐射射和和部部分分可可见见光光的的辐辐射射环环境境下下生生存存，主主要要是是微微生生物物体体内内具具备备相相应应的的DNADNA光光修修复复系系统统和和自自由由基基清清除除酶酶，来来适适应应环环境；境；寡寡营营养养菌菌、高高渗渗菌菌和和毒毒物物耐耐受受菌菌等等亦亦进进行行了了研研究究，同同时时人人们们也也在在寻寻找找其其它它更更奇奇怪怪的的类类群群，并并向向空空间间及其它星系发展；及其它星系发展；5、其他类型极端微生物的研究关关于于嗜嗜酸酸、嗜嗜压压特特性性的的研研究究常常被被嗜

50、嗜热热菌菌、嗜嗜冷冷菌菌的的研研究究所所掩掩盖盖，实实际际上上了了解解不不多多，而而其其价价值值与潜力已被人们所注意；与潜力已被人们所注意；寡寡营营养养菌菌、高高渗渗菌菌、毒毒物物耐耐受受菌菌、高高辐辐射射菌菌、深深海海深深地地高高压压菌菌等等亦亦进进行行了了研研究究，同同时时人人们们也也在在寻寻找找其其它它更更奇奇怪怪的的类类群群，并并向向空空间间及及其其它它星星系发展；系发展；七、极端微生物的研究发展趋势由由于于极极端端微微生生物物生生理理上上的的特特殊殊性性，其其筛筛选选、保保藏藏、培培养养等等过过程程都都需需要要开开发发和和采采用用新新的的方方法法和和技术；技术；对对极极端端微微生生物