连接2011年分子生物学实验.ppt

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1、实实 验验 三三DNADNA片段的回收片段的回收（续）（续）取上一实验回收的无水乙醇沉淀的取上一实验回收的无水乙醇沉淀的DNA管。管。12000rpm离心离心10mins，弃上清。弃上清。用用75%乙醇乙醇0.5ml洗涤沉淀，洗涤沉淀，12000rpm离心离心2mins，弃上清。弃上清。空气干燥空气干燥10mins加入加入10uL TE 溶解回收产物。溶解回收产物。分别标记组号，注明分别标记组号，注明5.3kb 或或0.7kb电泳定量电泳定量沉淀和溶解沉淀和溶解电泳分析定量电泳分析定量计算定量结果：计算定量结果：确认回收片段，测定浓度并计算回收量。确认回收片段，测定浓度并计算回收量。制胶制胶:

2、四人一块胶四人一块胶，1 1%琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶，20ml20ml上样电泳上样电泳:1.1.Marker 5uL Marker 5uL（0.75ug0.75ug）2.5.3Kb 2uL 2.5.3Kb 2uL 3.0.7Kb 4 3.0.7Kb 4uLuL（注意：样品加入（注意：样品加入10 x loading buffer10 x loading buffer混匀后再上样混匀后再上样)2.2.4 2.2.4 观察结果观察结果计算公式计算公式:待测样品的待测样品的DNADNA量量(ngng)=Marker Marker DNADNA总质量总质量同等亮度条带的同等亮度条带的MarkerMar

3、ker的的bpbp数数MarkerMarker各条各条带带bpbp数总和数总和XDNADNA片段的重组片段的重组（连接反应）（连接反应）实实 验验 四四背景理论知识背景理论知识Section 1BamHINotIpET28a5.37kbBamHI（661）NotI（1398）pEGFP-N34.7kbEGFP(720bp)EGFP(720bp)-BamHI-NotIpET28a(5.3kb)-BamHI-NotILigation4.1.1 4.1.1 实实 验验 目目 的的1.1.学习克隆工作中常用的单、双酶切，载体学习克隆工作中常用的单、双酶切，载体去磷酸化处理等连接方法去磷酸化处理等连接方

4、法2.2.了解反应中各因素对连接效率的影响了解反应中各因素对连接效率的影响4.1.2【实验原理】DNA重组：在DNA连接酶的作用下,在含有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接,获得重组DNA分子。T4DNAT4DNA连接酶：连接酶：ATPATP是是辅助因子；辅助因子；大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶NAD+NAD+是辅助因子。是辅助因子。DNADNA连接酶连接酶将具有相同粘性末端或平端的将具有相同粘性末端或平端的DNADNA分子分子连接起来。连接起来。DNADNA连接酶只能作用于双链连接酶只能作用于双链DNADNA分子而不能分子而不能将二

5、个单链将二个单链DNADNA分子连接。分子连接。T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接带粘性末端连接酶连接带粘性末端DNADNA分分子的效率远高于连接平末端的子的效率远高于连接平末端的DNADNA分子分子4.1.2【实验原理】特点：特点：催化催化DNA 5磷酸基与磷酸基与3羟基之间（切口）羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。切口切口(nick)：DNA分子糖分子糖-磷酸主键的破坏。磷酸主键的破坏。缺口缺口(gap)：DNA分子中核苷酸缺失。分子中核苷酸缺失。4.1.2【实验原理】DNADNA连接酶连接酶：T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶（可连接平末端双链连接酶（可连接平末

6、端双链DNADNA）大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶连接酶单位：连接酶单位：WeissWeiss单位（单位（ppippi单位）：单位）：3737 C C、2020分钟内分钟内将将1nm1nm的的3232P P从焦磷酸根上置换到从焦磷酸根上置换到ATPATP分子上分子上.个个Weiss单位相当于单位相当于60个粘端单位个粘端单位反应温度：反应温度：最佳温度最佳温度37C 一般采用一般采用4-16 C4.1.3 4.1.3 影响连接反应的影响连接反应的因素因素反应温度反应温度连接酶的用量连接酶的用量DNA末端的性质末端的性质DNA浓度及两种浓度及两种DNA分子数的比例分子数的比例外源外源D

7、NADNA末端的性质末端的性质带有不同突出末端的片段带有不同突出末端的片段 双酶切：末端不同；可定向连接双酶切：末端不同；可定向连接带有相同突出末端的片段带有相同突出末端的片段 单酶切：末端相同单酶切：末端相同;大量无效连接产物大量无效连接产物 如载体自环化，引起转化子高本底如载体自环化，引起转化子高本底 解决办法：解决办法：5 5末端去磷酸化末端去磷酸化 （CIPCIP小牛肠碱性磷酸酶）小牛肠碱性磷酸酶）定向克隆定向克隆返回返回利用利用CIP防止载体防止载体DNA的重新环化的重新环化4.1.44.1.4载体、供体浓度及比例载体、供体浓度及比例q通过控制插入片段与载体之间的比例以达到最通过控制

8、插入片段与载体之间的比例以达到最大效率的重组连接。大效率的重组连接。q最佳比例是由构造及末端的类型决定的。最佳比例是由构造及末端的类型决定的。q一般需要较高的插入片段与载体的摩尔比例。一般需要较高的插入片段与载体的摩尔比例。如如2 2：1 1 甚至甚至4 4：1 1，今天我们采用，今天我们采用3 3：1 1q插入片段与载体的插入片段与载体的DNADNA的最适总浓度：一般载的最适总浓度：一般载体用体用100ng,100ng,插入片段用量根据比例计算确定。插入片段用量根据比例计算确定。4.1.44.1.4载体、供体浓度及比例载体、供体浓度及比例重组重组DNADNA片段摩尔比例的换算：片段摩尔比例的

9、换算：100ng pET28a(5.3kb)100ng pET28a(5.3kb)：100ng eGFP(0.7kb100ng eGFP(0.7kb）=？1:7.51:7.5实验操作实验操作Section 24.2.1实验材料pET28a BamHI-NotI 酶切质粒载体片段。eGFP BamHI-NotI 酶切目的片段。T4DNA连接酶其它将插入片段与载体片段按3:1的比例 载体 2l(100ng)目的片段(1.4kb)?l(100ng)6l T4连接酶缓冲液 1l T4连接酶 1l ddH2O 0l 反应总体积 10l混合于EP管(标记)中且混匀,Short离心4.2.2【实验步骤】16 C保温保温14 小时小时,若不马上转化若不马上转化,-20 C保存保存该连接产物是下次实验材料思思 考考 题题单酶切重组单酶切重组DNADNA有哪些弊端，如何避免？有哪些弊端，如何避免？在不计算在不计算DNADNA片段浓度的情况下，如何快片段浓度的情况下，如何快速简便的速简便的估算估算连接片段的比例？连接片段的比例？下下 次次 实实 验验感受态细胞的制备感受态细胞的制备与重组与重组DNADNA的转化的转化开始工作吧！开始工作吧！LETS BEGIN NOW！