基因重组与基因工程培训教材znu.pptx

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1、基因重组与基因工程基因重组与基因工程Genetic Recombination and Gene cloning第六章第六章DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称遗传重组或或基因重排。组合称遗传重组或或基因重排。重组产物称为重组体。重组产物称为重组体。基因重组主要发生在减数分裂时同源染色基因重组主要发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。（形式多样）体之间的交换。（形式多样）重组与进化关系密切，增加群体的遗传多重组与进化关系密切，增加群体的遗传多样性，利于突变的优化组合。样性，利于突变的优化组合。DNA重组重组接合作用接合作用(conjugation)转化作

2、用转化作用(transformation)转导作用转导作用(transduction)#转转 座座(transposition)#同源重组同源重组(homologous recombination)#位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)异常重组异常重组发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同同源源重重组组(homologous recombination)，又又称称基基本本重重组组。是是最最基基本本的的DNA重重组组方方式式，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间间进进行行单单链或双

3、链片段的交换。链或双链片段的交换。以以E.coli的的同同源源重重组组为为例例，了了解解同同源源重重组组机制的机制的Holliday模型。模型。6.1、同源重组、同源重组Holliday模型中，同源重组主要模型中，同源重组主要4个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链对应的链连接，形成连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA（立体异构）（立体异构）Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体中间体切开并修复，形成两个双链重组体D

4、NA，分别为：，分别为：片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant)片段重组体片段重组体：切开的链与原来断裂切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其有一段异源双链区，其两两侧侧来自同一亲本来自同一亲本DNA。拼接重组体拼接重组体：切开的链并非原来断切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链裂的链，重组体异源双链区的区的两侧两侧来自不同亲本来自不同亲本DNA。5555333355553333 内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内

5、切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体中间体53535353目目 录录片段重组体片段重组体 （见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNADNA。拼接重组体拼接重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本双链区的两侧来自不同亲本DNAD

6、NA。5353535353535353Holiday中间体中间体535353535355533355553333555533335555333355553333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目目 录录分支移动的过程伴随着DNA的修复同源重组是减数分裂的原因。同源重组是由于碱基间的精确配对实现的异源双链与基因交换同源重组时会产生异源双链，从而发生基因交换。减数分裂后分离：（对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因校正过程称作基因转换）基因转换频率在非对称异源双链区较高。基因转换也可以在有丝分裂时姐妹

7、染色体的等位基因间、有丝分裂与减数分裂时同一条染色单体上非等位重复基因之间发生Holliday模型提出了同源重组的基本模式，但对于基因重组具体细节，异源双链的形成细节不清楚。在Holliday基础上提出了单链断裂模型和双链断裂模型，两个模型的区别在于解释重组期间DNA的修复的具体过程不一样。有供体受体之分。（受体：发生链断裂的分子P138-139）细菌的基因转移与重组低等生物也可以以转化、转导、结合等多种方式实现细胞间的基因转移。具体方式：接合、转化、转导、细胞融合。外源基因的命运：降解、暂时保留、与内源基因置换、整合。一、接合作用（一、接合作用（conjugation)当细胞与细胞、或细菌通

8、过菌毛相互接当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。转移称为接合作用。F因子编码表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA转移通道蛋白等、F因子可以与细菌染色体发生交叉连接而重组整合入细菌染色体二、转化作用（二、转化作用（transformation)通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。感受态细胞高浓度钙可以诱导感受态例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA

9、片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。三、三、转导作用（转导作用（transduction)当病毒从被感染的细胞（供体）当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间时，发生在供体细胞与受体细胞之间的的DNADNA转移及基因重组。转移及基因重组。溶溶 菌菌感感 染染重重 组组感感 染染细细 菌菌噬菌体噬菌体图图 15-3 转导作用转导作用转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞 之间的之间的DNA转移及基因重组转移及基因重组转导转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，

10、再次当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的间的DNA转移及基因重组即为转导作用转移及基因重组即为转导作用转导(transduction)*转染(transfection)l转染是染是转化的一种特殊形式。化的一种特殊形式。由transformation（转化）和infection（感染）两词构成。l原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。l通通过感染方式将外来将外来DNA引入宿主引入宿主细胞，并胞，并导致致宿主宿主细胞胞遗传性状改变的的过程称程称为转染。染。l将任何类型DNA转移

11、至动物细胞内的过程均可叫转染。细菌的细胞融合由于细胞质膜融合导致的基因转移和重组。（原生质体融合）细菌的同源重组的酶学机制1、RecBCD（外切核酸酶（外切核酸酶）和）和 Chi 位点位点具有解旋酶（再旋）活性、具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、活性、核酸外切酶活性、核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性序列特异性的单链内切酶活性单链内切酶活性和解旋酶活性使单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具产生具有游离末端的单链有游离末端的单链 RecA的作用位点的作用位点RecBCD有固定切割位点有固定切割位点原核生物的重组酶学机制已经比较清楚Chi 位点出现几率很高，是位点出现几率很高，

12、是RecBCD的靶位点的靶位点GCTGGTGG3 RecBCD的识别和切割位点的识别和切割位点a、RecBCD结合在结合在DNA的平的平 头末端（产生机制不清楚）头末端（产生机制不清楚）b、外切、外切、解链、移动解链、移动 （ATP）c、兔耳状兔耳状 loop 结构产生结构产生再旋酶活性低于解旋酶活性）再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD 在在 loop 单链区的单链区的 chi 位点位点3方方46NT处切处切 断单链（单链内切酶）断单链（单链内切酶）chi位点：位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点目前发现的重组热点 E.coli 含含 1000 个、个、Euk.e、RecBCD

13、切割产生切割产生3单链末端单链末端 2、RecA 蛋白蛋白（1）活性活性a、RecA 有单、有单、双链双链 DNA 结合活性结合活性 b、RecA 有有 NTPase 活性（底物差异活性）活性（底物差异活性）与单链与单链 DNA 结合时活性最大结合时活性最大-依赖于依赖于 DNAc、RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力，即联会同源的能力，即联会同源 DNA （但其靶（但其靶 DNA 必须有缺口结合必须有缺口结合DNA）RecA入侵单链入侵单链被置换连被置换连RecA引发链侵入模型引发链侵入模型RecA引起的链交引起的链交换和换和Ho

14、lliday结构结构的生成的生成 （2）RecA 蛋白催化双链和单链蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）联会前阶段（缓慢）RecA 与单链结合与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子 Holliday（5侵入）侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA 反应结束时，反应结束时，RecA 结合到双链上结合到双链上 其中其中单链同化有固定的方向单链同化有固定的方向 入侵单链进入的方向是入侵单链进入的方向是53，双链双链 DNA

15、的互补链是的互补链是35 RecBCD 和和 RecA 的共同作用的共同作用RecBCD产生游离单链-RECA因子接到重组反应 3、原核同源重组的其它蛋白、原核同源重组的其它蛋白 需要需要 E.coli 中三个基因中三个基因 ruvA,ruvB 和和 ruvC 的产物的产物 a、RuvA 识别识别 Holliday 结构的连接点结构的连接点b、RuvB 为分枝迁移提供动力（为分枝迁移提供动力（ATPase 1020bp/s）c、RuvC 核酸内切酶核酸内切酶-专一性识别专一性识别 Holliday 结构的连接点结构的连接点 体外切段连接点以拆分重组体体外切段连接点以拆分重组体 E.coli 重

16、组的各阶段重组的各阶段 （损伤修复）（损伤修复）损伤损伤DNADNA复复制产生缺口制产生缺口RecARecA链交换链交换第二次链交换第二次链交换DNApolDNApol通过通过DNADNA合成填满缺口合成填满缺口RuvA,BRuvA,B分枝迁移分枝迁移RuvCRuvC切割切割HollidayHolliday连接点连接点真核生物同源重组机制自学真核生物同源重组机制自学7.2、位点、位点专一性重一性重组（site-specific recombination）1、概念：、概念：发生在生在专一序列而一序列而顺序极少相同的序极少相同的DNA分子分子间 的重的重组（包括一些基因表达调节、发育过程中DNA

17、重排）噬菌体基因噬菌体基因组整合到整合到细菌染色体基因菌染色体基因组中属此种重中属此种重组2、特征：、特征：在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接 -产生精确的产生精确的DNA重排重排 都具有整合作用的两个基本特征都具有整合作用的两个基本特征a、典型的保守性重组典型的保守性重组-交换是相互的和保存原先的交换是相互的和保存原先的DNAb、发生在噬菌体和细菌发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上短同源序列的专一性核苷酸上二、二、phagephage的整合与切除（溶原和裂解状的整合与切除（溶原和裂解状态）1、实现机制：机制：均是通过均是通

18、过-细菌细菌DNADNA和和DNADNA上特定位点之间的重组上特定位点之间的重组2、特定位点、特定位点-附着位点（附着位点（attachment site att）E.coli attB 含含BOB三序列三序列 23bp phage attP 含含 POP三序列三序列 240bp 核心序列核心序列“O”完全一致完全一致 （同源部分）（同源部分）-位点特异性重组发生的地方位点特异性重组发生的地方 B,B,P,P-臂臂3、整合、整合过程程 整合后的附着位点为整合后的附着位点为 attL（BOP）attR（POB）整合位点整合位点-attB、attP 切除位点切除位点-attL、attR 整合过程需

19、要整合过程需要整合酶整合酶 （integrase Int）（）（编码编码）和和寄主的整合宿主因子寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor）共同作用共同作用溶源性细菌溶源性细菌(lysogen)溶菌周期溶菌周期（lysis）原噬菌体原噬菌体4、整合分子机制、整合分子机制 核心序列核心序列O全长全长15bp，富含，富含A-T 发生在发生在O内的重组交换位点相距内的重组交换位点相距 7bp 整合酶的结合位点：整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同两者的作用不同)attP位点的负超螺旋为重组所必须位点的负超螺旋为重组所必须-加强了加

20、强了Int和和IHF的亲和力的亲和力 -高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构 Int结合结合 -核心序列的反向位点（切割位置）核心序列的反向位点（切割位置）-结合在结合在att臂上（臂与核心区靠近）臂上（臂与核心区靠近）intIHFXis 整合体及其作用整合体及其作用 整合体（整合体（intasome）-Int和和IHF结合到结合到attP时的复合物时的复合物 整合体捕获整合体捕获attB 说明说明-a、attB和和attP的的最初识别靠最初识别靠Int 识别两序列的能力识别两序列的能力 b、两序列的同源性两序列的同源性在链交换时为在链交换时为 重要因素重要

21、因素 Int蛋白能蛋白能切断切断DNA，并使它重新，并使它重新连接连接，近而使，近而使holliday结构结构拆分拆分 重组时重组时attP和和attB部位交叉断裂，部位交叉断裂，互补单链末端互补单链末端进行交叉杂交进行交叉杂交例（二）细菌的特异位点重组例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段

22、转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变P1977.3、转座成分概述、转座成分概述1、转座子转座子(元元)或转座元件或转座元件(transposon or transposable element):基因组上不必借助于同源序列就可以移动的基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分

23、确切）：转座元的转移过程（不十分确切）2、发现和发展、发现和发展 1914 A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变玉米果皮、糊粉层花斑突变 玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理 跳跃基因（跳跃基因（jumping gene）1947 冷泉港实验室（美）冷泉港实验室（美）Barbara McClintocka)不依赖不依赖供体序列供体序列与靶位点间序列的同源性与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点热点)Regional preference(

24、在在3kb区域内的随机插入区域内的随机插入)d)某些转座因子（某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复靶序列在转座因子两侧会形成正向重复 f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点、转座重组的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）（插入专一型）二、二、Prok.转座子种类转座子种类 两种类型：两种类型：简单转座子（简单转座子（simple transposon）（插入序列（插入序列 ins

25、ertion sequence IS）复合转座子（复合转座子（composite transposon）共同特征：共同特征：a）两端有）两端有2040bp的的IR(反向重复序列反向重复序列)b）具有编码转座酶（）具有编码转座酶（transposase）的基因）的基因1、插入序列（最简单的转座子称作插入序列）、插入序列（最简单的转座子称作插入序列）最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分 命名：命名：IS编号（鉴定类型）编号（鉴定类型）长度长度 7002000bp 特点：特点：a）两端）两端IR为转座酶的识别位点（突变）为转座酶的识别位点（

26、突变）b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（39bp）IS 可以正反方向插入到可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），（宿主、质粒或某些噬菌体），常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应a)Tn/TnA family l 具有具有IR、转座酶基因、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因调节基因（解离酶）、抗抗生素基因 lTn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(Tet

27、R)2.5 kb 20 kbTn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp转座酶转座酶 regulator-内酰胺酶内酰胺酶2、复合转座子、复合转座子 两种类型两种类型 b）两端重复序列为两端重复序列为IS的复合转座子的复合转座子 e.g.IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子IS ISISISLISR臂臂 中心区中心区 臂臂transposition 当两个当两个IS组件相同组件相同时，其中任一个都可时，其中任一个都可行使转座功能行使转座功能 不同时，主要依靠不同时，主要依靠一个一个 两侧的两侧的IS既可以是既可以是IR，又可以是，

28、又可以是DR状态状态（IR多）多）3 转座噬菌体转座噬菌体 Mu phage（巨型转座子（巨型转座子）C repressor for A,BB 33 kd 与转座有关与转座有关A 70 kd 转座酶转座酶U,S 毒性蛋白毒性蛋白attL,attR 与寄主同源，反向重复，转座必需与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶区倒位酶attLCABSUattR150bp1.5kbG 倒位区倒位区 38kbPgin 以以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）Mu的插入途径的插入途径a）侵入的侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主在溶源化过程中任意插入寄主D

29、NA （两侧各（两侧各5bp的靶位点序列重复）的靶位点序列重复）b）进入进入裂解生长后，复制产生后代裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主几乎全部插入寄主 DNA中，并可继续转座（形成寄主中，并可继续转座（形成寄主DNA和和Mu的共合体），噬的共合体），噬 菌体成熟时，切段共合体包装菌体成熟时，切段共合体包装三、转座子的转作机制及模式三、转座子的转作机制及模式 三种类型：复制型、非复制型和保守型三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座模式、复制型转座模式 实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程 扩增了转

30、座子的拷贝（供、受点）扩增了转座子的拷贝（供、受点）需两种酶：需两种酶：转作酶（作用于原拷贝两末端）转作酶（作用于原拷贝两末端）解离酶（作用于复制后的拷贝）解离酶（作用于复制后的拷贝）模式：模式：两大步两大步 a)共合体形成共合体形成 切口连接复制切口连接复制 b)拆分拆分 靶位点的靶位点的DR形成形成2、非复制型转座模式、非复制型转座模式 供体上最终产生双链断裂供体上最终产生双链断裂 供体位点如不能被修复则有致供体位点如不能被修复则有致 死效应死效应五、转座子的某些遗传学效应五、转座子的某些遗传学效应P157转座可以导致基因变异转座可以导致基因变异插入操纵子位置可以影响操纵子下游基因表达插入

31、操纵子位置可以影响操纵子下游基因表达应用：应用：难以筛选的基因转移难以筛选的基因转移基因定位标记基因定位标记筛选插入突变筛选插入突变构建特殊菌株构建特殊菌株克隆难以进行表型鉴定的基因克隆难以进行表型鉴定的基因7.3.6 真核生物的转座成分真核生物的转座成分P152自学自学 真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类：真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类：a)转座机制与细菌的转座子类似转座机制与细菌的转座子类似需要转座酶、两端的需要转座酶、两端的IR,转座靶点序列随机，转座靶点序列随机，遗传信息：遗传信息：DNADNA转座酶、转座因子两端的转座酶、转座因子两端的IR序序列，列，玉米的玉米的

32、Ac-Ds元件、果蝇的元件、果蝇的P元件和元件和FB元件等元件等 b)转作机制类似逆转录病毒转作机制类似逆转录病毒 真核生物特有的转座机制（逆转录转座）真核生物特有的转座机制（逆转录转座）遗传信息：遗传信息：DNARNADNA 逆转录子转录成逆转录子转录成RNA,然后反转录然后反转录成成DNA,插入基因组，类似于逆转录病毒的作用插入基因组，类似于逆转录病毒的作用 如：逆转录病毒、果蝇的如：逆转录病毒、果蝇的copia元件、酵母的元件、酵母的Ty元件元件逆转录酶和整合酶，P208逆转录酶生物学意义：影响其他基因表达，介导基因重排，促进基因的流动第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNA Re

33、combination Technique 重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术技术制造医学上重要的药物。制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰技术生

34、产胰岛素的工厂岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉一、相关概念一、相关概念DNA克隆克隆工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体二、基本原理及操作步骤二、基本原理及操作步骤 本节主要内容本节主要内容一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖。无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗

35、遗传传物物质质与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称基因克隆或重组称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。酶工程、细胞工程等。目的目的 分离获得某一目的基因或分离获得某一目的基因或DNA 获得目的基因的表达产物（蛋白质）获

36、得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组重组DNA技术。技术。（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基

37、和3羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DN

38、A聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)识别识别DNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H作用：作用：与

39、与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA，保保护护自自身身DNA。分类：分类：、类类（基因工程技术中常用的是基因工程技术中常用的是类类）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序HHaemophilus aemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株流

40、感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点：类酶识别序列特点：回文结构回文结构(palindrome)切口：切口：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍伍

41、未未端端(compatible end)。Bam Bam H HBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A（三）目的基因（三）目的基因 cDNA(complementary DNA)基因组基因组DNA(genomic DNA)（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vecto

42、r)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意设计的载体称为意设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成多肽链而特意设计的载体称为成多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。载体的选择标准载体的选择标准能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子

43、量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.质粒质粒(plasmid)特点特点:能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传信息传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。细菌染色体外细菌染色体外的小型环状双链的小型环状双链DNADNA分子。分子。噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pU

44、C系列系列Multiple Cloning Sites3.柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)pJB8的物理图谱的物理图谱酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体腺病毒载体腺病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体杆状病毒载体杆状病毒载体其他其他二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理目的基因的获取目的基因的获取重组重组DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为

45、载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)1.化学合成法化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片段基因片段克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子

46、分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌存在于转化细菌内存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2.基因组基因组DNA文库文库限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源

47、 DNA 片段片段 基因文库基因文库mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制3.3.cDNAcDNA文库文库 逆转录酶逆转录酶A A A AT T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解T T T T是一种在体外利用酶促反应大量获是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组得特异序列的基因组DNA或或cDNA的专的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。门技术，又称为无细胞的分子克隆。4.聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）模板模板DNA引物引物4种种dNTPTaq DNA聚合

48、酶聚合酶含含Mg2+的缓冲液。的缓冲液。PCR的反应体系的反应体系（1）变性变性，加热至，加热至95，使模板，使模板DNA解开成单链；解开成单链；（2）退火退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸延伸，温度升至，温度升至72 ，DNA聚合酶以聚合酶以4种种dNTP为底物，在引物的为底物，在引物的3-OH上，合成与模板互上，合成与模板互补的补的DNA新链。新链。PCR的基本反应步骤及原理的基本反应步骤及原理PCR反应条件反应条件变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR反应的基本原理反应的基本原理（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因

49、与载体的连接1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶

50、切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段末端加