生物大分子分离纯化-原理与技术.ppt

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1、12023/5/16生物大分子分离纯化原理与技术22023/5/16内容提要1、层析原理与技术2、凝胶过滤层析3、UNOsphere 离子交换分离技术4、CHT 陶瓷羟基磷灰石分离技术5、疏水相互作用与亲和层析32023/5/16Life is based on proteins and their interactions42023/5/16层析原理与操作52023/5/16 层析的起源和原理 起源-1906 年，俄国植物学家Tsweet 原理-利用物质分配系数不同达到分离目的原理与操作Chromatography层析色谱62023/5/16什么是生物层析 根据生物分子物理化学特性的不同而达

2、到分离 极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP 离子特性：ionic characteristics(charge)IEX 大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF 结构特征与活性位点：shape(ligand binding,affinity)AC 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离原理与操作72023/5/16GelFiltration凝胶过滤IonExchange离子交换HydrophobicInteraction疏水层析反相Affinity亲和层析CHT羟基磷灰石

3、原理与操作82023/5/16 最广泛的蛋白质分离纯化方法 条件温和 维持蛋白质空间结构与活性 基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离 蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离层析原理与操作92023/5/16层析的5 个操作步骤 装柱并平衡 上样 平衡 洗脱 再生上样装填有层析介质的层析柱分离分离组分流出原理与操作102023/5/16层析图原理与操作第一峰,外水体积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质VoVeVt蛋白质含量(A280),由UV 检测器读出，y 轴基线洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉有时这里也显示梯度浓度等检测值时间或体

4、积，x 轴112023/5/16纯化平台的硬件结构 层析工作站 层析介质和层析柱原理与操作122023/5/16层析系统DuoFlow 中高压层析系统LP 低压层析系统Profinia 全自动亲和层析系统手动层析组件132023/5/16DuoFlow 中高压层析系统主要特点：1.3500psi 高压力下梯度模式最大流速可达20ml/min2.连续波长，4 波长同步检测3.方形X、Y 轴组分收集器4.软件直观容易使用142023/5/16BioLogic LP 低压层析系统LP Data View 软件BioLogic LP 系统BioFrac 方形组分收集器主要特点：1.流速精确，0.01m

5、l/min2.检测灵敏度更高,0.001AU3.兼容方形收集器152023/5/16Profinia 蛋白质纯化系统主要特点：1.全自动亲和纯化，包括亲和标签、亲和无标签，抗体等纯化2.双紫外检测器设计3.纯化与脱盐串联一步完成4.结果直接报告目标蛋白的浓度和得率162023/5/16为什么在层析技术中要使用层析仪 介质的要求 实验的精密度和重现性要求 时间的要求172023/5/16纯化平台的硬件结构层析介质与层析柱，原理与技术182023/5/16层析介质 离子交换层析介质UnosphereQ，SMacroPrepHighQ,HighS,DEAE,CM 亲和层析ProfinityIMAC

6、金属螯合介质ProfinityEpoxide 环氧亲和介质Affi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel 蓝胶，DEAE 蓝胶，CM 蓝胶Affi-Prep 多粘菌素介质Affi-Gel 硼胶Affi-Gel 配体固定化活化介质 凝胶过滤层析介质Bio-GelP 系列Bio-BeadsS-X 介质 羟基磷灰石介质（CHT）氟代羟基磷灰石介质（CFT）疏水层析介质Macro-PrepMethylHICMacro-Prept-ButylHICBio-BeadsSM-2 吸附剂192023/5/16层析柱分析柱 离子交换分析柱：UnoQ,SAminex 分析柱分

7、析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分子 羟基磷灰石分析柱：Bio-ScaleCHT-I 凝胶过滤分析柱：Bio-Sil,Bio-SilectHPLC 分析柱 反相层析分析柱：Hi-PoreRP304,Hi-PoreRP318各种层析介质的Cartridges 用于条件摸索UNOsphereMacroPrepCHTHIC202023/5/16层析介质结构原理UnosphereMacroPrep离子交换层析Q，S，DEAE，CM疏水层析-CH3,t-Butyl亲和层析ProteinAIDA Ni多粘菌素凝胶过滤CHT 和CFTUnosphereQ,SMacroPrepHighQ,SM

8、acroPrepDEAE,CMMacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHICProfinityIMACProfinityEpoxideAffi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel,DEAE,CMAffi-PrepPolymixinAffi-Gel 硼胶Affi-Gel 配体固定化活化212023/5/16层析介质及其技术 凝胶过滤层析 离子交换层析 羟基磷灰石层析 疏水层析 亲和层析222023/5/161.Sphericalparticlespackedintoacolumn2.Sampleapplied 3.Bufferm

9、obilephaseandsamplemovethroughcolumn,moleculesdiffuseinandoutofmatrix4.largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorderofsize,moleculeslargerthanthematrixporespassstraightthrough.DiffusionBufferDiffusionintotheporesDiffusionoutoftheporesBuffer凝胶过滤232023/5/16凝胶过滤层析分离纯化原理242023/5/16A

10、goodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water凝胶结构252023/5/16Stericexclusionleadstoearlyelution 按照分子量大小洗脱 大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱262023/5/16 100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2Bio-Gel P4Bio-Gel P6Bio-Gel P10Bio-Gel P30Bio-Gel P60Bio-Gel P1001,800800 4,0001,000 6,000，用于脱盐1,500 20,0002,500 40,0003,000 60,00

11、05,000 100,000100凝胶过滤层析凝胶的选择272023/5/16Bio-GelP4(800-4,000)forseparationdigestedproductsfromIgG凝胶过滤层析凝胶的选择282023/5/16凝胶过滤层析Bio-GelP6(1000-6000)凝胶的选择292023/5/16凝胶过滤层析Bio-GelP10(1500-20,000)凝胶的选择302023/5/16凝胶过滤层析Bio-Scale Mini Bio-Gel P6 脱盐预装柱 操作方便，可连接在DuoFlow、LP、Profinia 和Econo 泵上312023/5/16Bio-Beads

12、 S-X 介质 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体Bio-Beads S-X1Bio-Beads S-X3600Bio-BeadsS-X81,000Bio-BeadsS-X12400高分辨率亲脂性分子排阻色谱2,00014,000中草药和天然产物活性成分分离纯化高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、杂环化合物介质可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有机溶剂凝胶过滤层析322023/5/161、三硬脂酸甘油酯，8912、三肉豆蔻酸甘油酯，7293、三月桂酸甘油酯，6454、三辛酸甘油酯，4775、三己酸甘油酯，3936、十六烷，2267、十一烷，156Bio

13、-Beads S-X8分离效果高分辨率亲脂性分子排阻色谱Bio-Beads S-X 介质凝胶过滤层析332023/5/16 柱长的选择 分离：30120cm 脱盐：30cm 以下 洗脱液 离子强度低 高离子作用 排阻作用（0.1-0.5M)疏水作用 pH中性 流速，根据层析介质的说明，一般很低 样品容量：13CV凝胶过滤层析操作参数选择342023/5/16增加分辨率的方法检测柱效检测分离度减少上样体积降低流速使用更小的介质颗粒的介质连接2 根层析柱352023/5/16 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理

14、论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 2.脱盐凝胶过滤层析凝胶过滤层析的应用362023/5/16凝胶过滤层析凝胶过滤层析的特点：1.层析柱规模很大，实验室1.0-2.530-100cm，工艺10 20200cm，从而设备成本很高；2.上样体积少，必须少于柱床体积的3 才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；3.工艺时间（生产周期）长，甚至24 小时或以上；4.分辨率低；5.不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步去热原，或离子交换上样前的脱盐37202

15、3/5/16cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQ Quaternary amineCMCarboxy-methylSSulfonate离子交换层析离子交换层析类型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-382023/5/16pIstability rangestability range与阳离子交换介质结合+-denaturationdenaturationpH102离子交换层析离子交换层析原理蛋白质滴定曲线蛋白质净电荷与阴离子交换介质结合392023/5/16

16、Products:UNOsphereQ&S,Macro-PrepHighQ&S,CM,DEAE,AGresinsEquilibration SampleApplicationSampleAdsorptionElution Regeneration-+-+-+离子交换层析离子交换层析原理402023/5/16sampleapplicationandwashelution equilibration regeneration-+-anionexchangerbead离子交换过程412023/5/16离子强度 洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl 等.在不同盐浓度（离子强度）及其

17、不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。缓冲液与pH 选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)缓冲液PH 值：阳离子低于pI 一个pH 单位以上 阴离子通常高于pI 一个pH 单位以上 蛋白质在不同pH 下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH 进行摸索，以得到最佳层析条件。离子交换层析离子交换层析操作参数选择422023/5/16pI 5.5+-pH 10 2离子交换层析缓冲液与pHpI 7.5阳离子交换阴离子交换碱性蛋白，采用阳离子交换酸性蛋白，采用阴离子交换蛋白质净电荷pH4.0 pH9.0蛋白质稳定性范围432023/5/16pH 7.0pH 8.0pH 8.9pH 6.0pH6.0pH7.0pH 8.0pH 8.9缓冲液与pH 的影响阴离子交换离子交换层析离子交换层析操作参数选择442023/5/16离子交换层析离子交换层析操作参数选择盐溶液梯度的影响