核酸提取及常见问题分析优秀课件.ppt

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1、核酸提取及常见问题分析核酸提取及常见问题分析第1页，本讲稿共49页第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第2页，本讲稿共49页核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。前言前言第3页，本讲稿共49页第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第一部分：

2、DNA提取方法简介第4页，本讲稿共49页DNA提取的几种方法提取的几种方法q基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它第5页，本讲稿共49页DNA提取的几种方法提取的几种方法q非基因组DNA的提取质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法第6页，本讲稿共49页基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有

3、机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。第7页，本讲稿共49页qCTAB提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加）使用前加入入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破

4、坏；）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组基因组DNA CTAB法法第8页，本讲稿共49页qCTAB提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl C

5、TAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组基因组DNA CTAB法法第9页，本讲稿共49页qCTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组基因组DNA CTAB法法第10页，本讲稿共49页q SDS法原理基因组基因组DNASDS法法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（55

6、65）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使使染染色色体体离析，蛋白变性，释放出核酸；离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂杂质质沉沉淀，离心后除去沉淀；淀，离心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法DNA提取缓冲液第11页，本讲稿共49页q SDS法流程图（以动物组

7、织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组基因组DNASDS法法第12页，本讲稿共49页基因组基因组DNA其它方法其它方法物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：第13页，本讲稿共49页基因组基因组DNA其它方法其它方法吸附材料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料阴离子交换树脂磁珠高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低p

8、H值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。第14页，本讲稿共49页基因组基因组DNA其它方法其它方法浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物第15页，本讲稿共49页质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒D

9、NA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第16页，本讲稿共49页质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液第17页，本讲稿共49页质粒质粒DNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；

10、变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第18页，本讲稿共49页细胞器细胞器DNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。第19页，本讲稿共49页第一部分：DNA提取方法简介

11、第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第20页，本讲稿共49页DNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中第21页，本讲稿共49页材料准备材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基

12、因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）第22页，本讲稿共49页细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA

13、的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁第23页，本讲稿共49页核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取第24页，本讲稿共49页核酸分离、纯化核酸分离、纯化q蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性

14、（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理第25页，本讲稿共49页q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体积的体积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积)，氯苯可以与多糖，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入2

15、00l 200l 20%PEG20%PEG8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl)，冰浴，冰浴20min20min。核酸分离、纯化核酸分离、纯化第26页，本讲稿共49页q多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它们与，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合核酸分离、纯化核酸分

16、离、纯化q盐离子的去除：70的乙醇洗涤第27页，本讲稿共49页核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取质粒DNA的提取第28页，本讲稿共49页1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子

17、1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）DNA提取常见问题提取常见问题q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策第29页，本讲稿共49页1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，

18、耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA提取常见问题提取常见问题q问题二：DNA降解。对策 原因第30页，本讲稿共49页1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒DNA提取常见问题提取常见问题q问题三：DNA提取量少。对策 原因第31页，本讲稿共49页第一部分：DNA提取方法简介第二部分：

19、DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第32页，本讲稿共49页RNA提取的通用方法提取的通用方法q异硫氰酸胍/苯酚法 原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。RNA提取的通用方法提取的通用方法第33页，本讲稿共49页q异硫氰酸胍/苯酚法 步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，

20、巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。RNA提取的通用方法提取的通用方法第34页，本讲稿共49页影响影响RNA提取的因素提取的因素q 材料材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzolTRIzol或样品贮存液中

21、，于或样品贮存液中，于7070或或2020保存保存如要多次提取，请分成多份保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，液氮长期保存，7070短期保存短期保存影响影响RNA提取的因素提取的因素第35页，本讲稿共49页影响影响RNA提取的因素提取的因素q 样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量影响影响RNA提取的因素提取的因素第36页，本讲

22、稿共49页q 纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响影响RNA提取的因素提取的因素第37页，本讲稿共49页第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第38页，本讲稿共49页RNA提取常见问题提取常见问题q

23、 RNA 的降解 q OD260/OD280 比值偏低q 电泳带型异常q 下游实验效果不佳第39页，本讲稿共49页RNA降解降解q 新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。第40页，本讲稿共49页RNA降解降解q 冷冻样品：冷冻样品：样样品品取取材材后后应应立立即即置置于于液液氮氮中中速速冻冻，然然后后可可以以移移至至-70-70冰冰箱箱保存。样品要相对小一点；保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；先用液氮研磨，再加裂

24、解液匀浆；样样品品与与裂裂解解液液充充分分接接触触前前避避免免融融化化，研研磨磨用用具具必必须须预预冷冷，碾碾磨过程中及时补充液氮。磨过程中及时补充液氮。第41页，本讲稿共49页ODOD260260/OD/OD280280 比值偏低比值偏低q 蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第42页，本讲稿共49页ODOD260260/OD/OD2802

25、80 比值偏低比值偏低q 抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。q 设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10-0.50 之间。此范围线性最好。q 用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。第43页，本讲稿共49页电泳带型异常电泳带型异常q 非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。q 变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样

26、量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。第44页，本讲稿共49页下游实验效果不佳下游实验效果不佳q RNA 降解 q 抽提试剂的残留 75%乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 q DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA 第45页，本讲稿共49页RTRT常见问题分析和解决方案常见问题分析和解决方案问题一：少量或没有RT-PCR产物RNARNA降解降解分离无污染，高质量的分离无污染，高质量的RNARNA；防止；防止RNARNA降解降解RNARNA中含逆转录酶抑制剂中含逆转录酶抑制剂7070（v/vv/v）乙醇清洗）乙醇清洗RNARNA

27、沉淀，除去抑制剂沉淀，除去抑制剂起始起始RNARNA量太低量太低增加增加RNARNA的量的量 多糖同多糖同RNARNA共沉淀共沉淀用氯化锂沉淀用氯化锂沉淀RNARNA以除去多糖以除去多糖合成合成cDNAcDNA第一链合成的引物第一链合成的引物退火失败退火失败确定退火温度适合所用的引物确定退火温度适合所用的引物RNARNA模板存在较多二级结构模板存在较多二级结构将将RNARNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，退火，提高逆转录反应温度提高逆转录反应温度反转录成功，反转录成功，PCRPCR失败失败PCRPCR步骤中使用超过步骤中使用超过1/51/5的逆转录反应

28、产物的逆转录反应产物可能原因解决方案第46页，本讲稿共49页RTRT常见问题分析和解决方案常见问题分析和解决方案问题二：有非特异性带q 引物和模板的非特异性退火 q 基因特异性引物设计较差 q RNA中有基因组DNA的污染 q 形成引物二聚体 q 镁离子浓度太高 提高反应的温度和特异性提高反应的温度和特异性提高引物的特异性提高引物的特异性使用扩增级使用扩增级DNaseDNase处理处理RNA RNA 设计在设计在33端没有互补序列的引物端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度优化镁离子浓度可能原因解决方案第47页，本讲稿共49页RTRT常见问题分析和解决方案常见问题分析和解决方案问题三：产生弥散（smear）条带 q 第一链产物的含量过高 q PCR反应中引物过多 q 循环数过多 q 退火温度过低 q 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增 常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量 减少PCR的循环次数 提高退火温度 提取高质量RNA，防止被DNA污染 可能原因解决方案第48页，本讲稿共49页谢谢！北京天为时代科技有限公司http/www.tw- 本公司产品江苏地区特约代理商南京天为生物科技有限公司联系电话：025-86073713 84705301 8470150124小时订货热线：13057585177 联系人：王彤免费技术支持：800 810 2177第49页，本讲稿共49页