33核酸类药物sns.pptx

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1、第三章 生化药物制造工艺（核酸类药物）第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 一、RNA与DNA的提取与制备（一）RNA的提取与制备 1、工业用RNA的提取（1）RNA及其工业来源从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体青霉素，制霉菌素等菌体。通常在细菌中RNA占525，在酵母中占2.715，在霉菌中占0.7%28。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收

2、率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。（2）高RNA含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering 稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使

3、RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNAMr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 保持34h破坏酶)。浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。（3）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取R

4、NA的很好的资源。取 100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20以下缓慢搅拌30分钟。用6molLHCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10以下，6molLHCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNAl.8g（纯度80）。（二）DNA的提取与制备 1工业用DNA的提取取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100，保温15分钟，迅速冷却至2025，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA

5、，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA5060。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering2、具有生物活性DNA的制备动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心

6、30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌23小时，在02500r/min离心，在上层液中加入等体积的冷95乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5十二烷基磺酸钠达110体积，搅拌1小时，经5000rpm离心1小时，清液中加入NaCl达1molL，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在03操作）。LINYI UNIVERSITYDep

7、artment of Pharmaceutical Engineering二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸1、酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5-磷酸二脂酶红酵母产生3-磷酸二脂酶LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering2、酶解法制备戊糖核苷酸我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生

8、产的。酶解法生产5单核苷酸工艺流程LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG）呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（IG），用核酸酶Pl降解RNA可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。4菌体自溶法生产核苷酸磷酸二酯酶

9、在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸。（1）菌体自溶法生产核莆酸工艺流程：LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering5碱水解法生产2，3-混合核苷酸 RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2，3-混合核苷酸。取 RNA配成 3 3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3molL浓度，升温至38，保温1620小时，用6molL盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2，3-核苷酸的降解率达95以上，将2，

10、3-混合核苷酸制成每片含50100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering（二）发酵法生产核苷酸1发酵法生产肌苷酸（IMP）肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加2%，鲜度可增加3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸发酵

11、机制:LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering 积累IMP的主要前提：（1）阻断SAMP合成酶:即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长；（2）保持 PRA 合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步反应；（3）要使IMP渗出胞外，选育对Mn+不敏感菌株；（4）生成的IMP不被降解，恰好原菌株该酶活力低。2、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸（自学）LINYI UNIVERSI

12、TYDepartment of Pharmaceutical Engineering（三）半合成法制备核苷酸由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5-核苷酸收率可达90%。例一：肌苷2mmolL悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmolL，反应2h，5-IMP摩尔产率达91。例二：鸟苷2mmolL悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmo/L，反应6h，5-GMP摩尔产率达90%。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmac

13、eutical Engineering三、核苷的制备核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。（1）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种；（2）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位；（3）核苷的发酵水平大大高于核苷酸，所以常做后者的前体物质。本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering（）RNA化学水解法制备核苷1核苷生产工艺流程RNA经甲酰胺化学水解制备核苷LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engin

14、eeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering核苷生产工艺流程（二）发酵法生产核苷 发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点：它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌为诱变出发菌株；它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的诱变菌；它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。原菌株：（1）AMP强烈抑制PRPP转酰胺酶的活性，控制总代谢途径；（2）AMP抑制S

15、AMP合成酶；（3）GMP抑制IMP脱氢酶LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering生产菌株：（1）酶6、7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP-肌苷（肝炎辅助药）；（2）酶4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XMP-黄苷；（3）酶5缺失积累鸟苷。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering1.发酵法生产肌苷（1）肌苷产生均的选育经过：见图（2）发酵工艺条件：

16、碳源为葡萄糖 保证充足的氮源 磷酸盐的影响 Mg+、Ca+有促进作用 生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量 最适发酵温度为30-34，pH6.06.2 需大风量,高溶氧和低CO2LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering2.发酵法生产鸟苷和黄苷 鸟苷产生菌的特征：（1）嘌呤核苷酸分解酶活力强；（2）SAMP合成酶，GMP还原酶缺失；（3）解除AMP、GMP对PRPP转酰胺酶，肌苷酸脱氢酶和GMP合成酶的反馈抑制；LINY

17、I UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering3.发酵法生产腺苷以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变基础菌株。诱变结果：（1）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失；（2）黄嘌呤缺陷型，GMP还原酶缺失；（3）抗8杂氮黄嘌呤解除对PRPP转酰胺酶的抑制；（4）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失与回复（菌种传代中）。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering第二节 核酸类

18、药物 分为两大类：1、具天然结构的核酸类物质 是生物合成的原料，或是蛋白质、脂肪、糖生物合成、降解及能量代谢的辅酶。作用是：改善机体物质代谢和能量供给，克服组织缺氧，加速组织修复。来 源：提取或发酵特 点：毒副作用小如：ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、CTP、UTP、腺苷、辅酶I等。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering2、自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合物作用是：治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。来 源：核酸类物质为前提的化学合成或酶法的“半合成”。特 点：毒性较大。如：LI

19、NYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineeringl反义药物的特点：靶基因mRNA序列已知 反义寡核苷酸与靶基因特异性结合而调节基因表达 天然的寡核苷酸难以进入细胞，难直接用于治疗。l核酸疫苗 是将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA)直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharm

20、aceutical Engineering一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）（一）结构与性质 AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药。AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3-叠氮-2-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。（二）生产工艺此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从DNA水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复杂，成本很高。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering 已见报道的胸苷合成方

21、法还有两条途径：从2-脱氧胞苷或2-脱氧鸟苷或2-脱氧腺苷与胸腺嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸苷。从鸟苷（300mmolL）与胸腺嘧啶（300mmolL）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5-甲基尿苷，然后经化学法合成胸苷。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering二、阿糖腺苷Adenine arabinoside（一）结构与性质 阿糖腺苷的化学名称为9

22、-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美国用Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，1972年日本用Streptomyceshebacecus4334菌株发酵法分别制备了阿糖腺苷。1979年用从EColi中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法将阿糖脲苷转化为阿糖腺苷。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering（二）生产工艺1、酶-化学合成法最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化学合成法：用尿苷为原料经氧氯化磷和二甲基甲

23、酰胺反应，生成氧桥化合物，在碱性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后利用阿糖尿苷中的阿拉伯糖经酶法转化成阿糖腺苷。经选育从阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的优秀菌株是产气肠杆菌（Enterbacteraerogens），这株菌能产生尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），用这个菌株的休止细胞作为酶源，从阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可制成固定化细胞进行连续生产。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engine

24、ering2、以5-AMP为原料的化学合成（三）作用与用途 阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹、型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用。目前认为，阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。阿糖腺苷在体内受激酶作用生成的阿糖腺三磷，是脱氧腺三磷（dATP）的拮抗物，从而阻抑了以dATP为底物的病毒DNA聚合酶的活力。而且阿糖腺三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高选择性。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering 三、三

25、氮唑核苷（一）结构与性质三氮唑核苷商品名病毒唑，对DNA病毒，RNA病毒都有广泛作用。本品为白色结晶，熔点174176，易溶于水。这个化合物经X线解析，它的立体结构与腺苷、鸟苷非常类似，在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脱氢酶阻断鸟苷酸的生物合成，从而抑制病毒DNA合成。它的另一特点是对病毒作用点多，不易使病毒产生抗药性。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering（二）生产工艺酶合成法 使用产气肠杆菌，以（尿苷）肌苷和TCA为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷LINYI UNIVERSITYDepartment of

26、Pharmaceutical Engineering采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。四、阿糖胞苷（Cytarabine，Cytosine arabinoside，Arabinosyl Cytosine，Aracytidine）（一）结构与性质阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷从而抑制DNA的合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。只能注射。LINYI UNIVERSIT

27、YDepartment of Pharmaceutical Engineering（二）生产工艺 1以5CMP为原料的合成法（1）工艺路线：LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering2、工艺过程：水解：并加入处理好的6.5L氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L，升温至90，在不断搅拌下，于pH9下进行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2mL凝胶溶液，离心分离，取上清液5至10l，pH9.2电泳分析，检查水解程度。氧桥化：

28、氧桥化后总 OD光谱高峰位置移至264nm（pH2）氨解：使氧桥断裂3，5-乙酰基脱落。成盐：2盐酸-甲醇LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering2、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering五、聚 肌 胞 苷 酸（聚 肌 胞）（Poyinosinic，Polycytidylic Acid，Poly1：C）（一）结构与性质1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，

29、系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于0.85氯化钠溶液。（二）生产工艺70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：1、底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。3、PolyI：C制备（1）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。（2）酶促反应：（每毫升反应液含molL数）IDP或CDP15；Tris150；MgC126；LINYI UNIVERSITYDepa

30、rtment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringEDTA1；聚合酶5单位，pH9.0，37，34小时。用盐酸调pH1.52.0，使PolyI（或PolyC）沉淀，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔PolyI与PolyC混合，生成产品。（三）作用与用途 本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰素。临床已试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎及痘类毒性感染等多种疾患。LINYI UNIVERSITYDepartmen

31、t of Pharmaceutical Engineering六、胞二磷胆碱（CDP-胆碱）（Citico line，CDPcholine，Cytidine diphosphocholine）（一）结构与性质胞二磷胆碱其化学名称为胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐本品为白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。1水溶液pH2.53.5，注射液pH7.0。（二）生产工艺1、酶合成法 胞二磷胆碱由微生物菌体所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸胆碱而合成，国内使用啤酒生产中废弃的酵母，反应体系为：磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液（pH8.0）200molml，CMP 20molml，磷酰

32、胆碱30molml，葡萄糖1000molml，MgSO4.7H2O20molml，酵母泥550mgm1。上述反应体系于28保温20小时，胞二磷胆碱对胞苷酸的收率为80。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering2粘性红酵母发酵法国外发现一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱。菌体培养基（gL）：葡萄糖50；多胨5；酵母膏2；KH2PO4 2；（NH4）2HPO42；MgSO4.7H2O1；pH6.0，经28，22h培养，收集菌体，菌体经0.2molL磷酸缓冲液pH7.0洗涤，备用。产生胞二磷胆碱的反应体系（gL）：葡萄糖140；Mg

33、SO4.7H2O6；5CMPNa220；磷酸胆碱20；析干菌体 50；反应体系中保持磷酸缓冲缓 pH7.0、0.2molL，30，28小时产胞二磷胆碱9.8gL，对5-CMP收率92.5。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical EngineeringLINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering提取工艺：反应液离心除去菌体，用0.5molLKOH调pH8.5，上dowex12（酸型）树脂，水洗后用甲酸梯度洗脱，在0.04molL甲酸洗脱液中收集产品，含胞二磷胆碱溶液上活性炭柱，丙

34、酮-氨水溶液洗脱，减压浓缩，乙醇中结晶。（三）作用与用途胞二磷胆碱是卵磷脂生物合成的前体。当脑功能下降时，脑组织内卵磷脂含量显著减少。本品能促进卵磷脂生物合成，兴奋脑干网状结构，特别是上行网状联系，提高觉醒反应，降低“肌放电”阈值，恢复神经组织机能，增加脑血流量和脑耗氧量，从而改善脑循环和脑代谢，大大提高患者的意识水平。临床用于减轻严重脑外伤和脑手术伴随的意识障碍，治疗帕金森氏症，抑郁症等精神疾患。由于胞二磷胆碱是在ATP存在下参与磷脂的合成反应，故合用ATP可提高本品疗效；用于脑外伤，脑出血患者可合用止血剂和防水肿药；用于震颤麻痹可合用L-多巴；用于精神病可合用镇静药。LINYI UNIVERSITYDepartment of Pharmaceutical Engineering谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH