12基因工程的基本操作程序(共85张PPT)eej.pptx

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1、人教版选修三1.2 基因工程的基本操作程序基因工程培育抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建一、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？将含有某种生物不同基

2、因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库 基因组文库部分基因文库（cDNA文库）基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较补：原核细胞的基因结构非编码区 非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子 终止子 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能 编码

3、蛋白质 编码区非编码区原核细胞的 基因结构有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。非编码区 非编码区 编码区编码区上游 编码区下游 启动子 终止子补：真核细胞的基因结构编码区 非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子：外显子：真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子结构基因

4、外显子内含子转录、加工修饰mRNA原核细胞 真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_ _ 和具有调控作用的_ 区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码基因表达的计算 在真核生物中，对应的是 的碱基数DNA mRNA蛋白质转录 翻译6 3 1氨基酸数 碱基数基因中外显子基因组文库与部分基因文库的关系基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以

5、基因文库与基因库 基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因文库与基因克隆基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。基因组文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存基因2.基因文库的构建方法（1）鸟枪法（2）反转录法（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 人工合成法（真核生物）多用于原核生物直接分离法（1）鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)（2）反转录法（cDNA文库的构建方法）以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的

6、催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点 缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最

7、强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；基因翻译产物蛋白质等特性。注意：u基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因1 2 3 4 522557294时间（min）温度（）PCR反应 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA

8、加倍模板DNA95PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点72第2轮结束 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。前提条件：_；原料：_、_、_、_。原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次

9、数）结果：聚合酶链式反应体外 特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶指数 2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNAn 过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从

10、 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。氢键 单链DNA双链DNA链思考？1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为循环次数)（24-1）2=30n模板DNAn 特异性引物n耐热DNA聚合酶n dNTPsn Mg2+PCR体系基本组成成分一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补PCR总结：PCR的基本反应步骤变性90-95 C延伸70-75C退火55-60CPCR总结：Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20PCR技术扩增与DNA复制的比较

11、PCR技术 DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制 细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段 形成整个DNA分子 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（三）化学方法人工合成目的基因人工合成(基因比较小)DNA合成仪从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取

12、目的基因的方法 用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。用_切断目 的基因，使其产生_ _。将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶1.过程:二、构建表达载体 核心质粒 DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒

13、中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资 料:思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文

14、库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因调节基 因操纵基 因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶 酶 酶 RNA聚

15、合酶启动子RNA聚合酶启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。思考1：表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。思考2：终止子的作用是什么？终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分D

16、NA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。基因工程技术路线三、将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（一）转化：目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定 表达（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将

17、目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞1.将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法（1）农杆菌转化法特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入 植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发

18、后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于 适用于被子植物 被子植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基

19、因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2处理，增加细菌细胞壁的通透性受体生物 植物 动物 微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵 细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中四、目的基因的检测与鉴定 检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译

20、 鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱

21、基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分 子 杂 交方法:抗原-抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫

22、基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达类型 步骤 检测内容 方法 结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。v 目的基因的表达和检测提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂

23、交；抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因u 从基因文库u 利用PCRu 化学方法人工合成2.构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞u 转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）4.目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可

24、以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆

25、菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中 4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。演讲完毕，谢谢观看！