脂质体制备技术精品文稿.ppt

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1、脂质体制备技术第1 页，本讲稿共43 页 Chapter：脂质体制备技术 第一节：概述 脂质体（Liposomes)最初由Eng.学者Bargham 和Standrsh将磷脂分散在水中，进行电镜观察时发现的。他们发现磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层，囊泡中央和各层之间被水隔开，双分子层厚度约为4nm。一、脂质体定义 系指将药物包封于类脂质双分子层内形成的微型泡囊（veside)二、目前研究状况 目前主要集中在三个领域：1）膜模拟 2）药物的控释与靶向 3）体外细胞的生物大分子转移 在应用上：1988年，U.S.A 第一个脂质体药物进入临床试验，至目前已有10家公司向FDA

2、 申请了14个此类药物，已获准临床试验，已有部分产品上市。如：TLC 公司的阿霉素脂质体，顺铂脂质体，施贵宝与TLC 合作的两性霉素脂质体，还有正完霉素，柔红霉素脂质体，etc，还有空白脂质体上市，在服用或使用前加药物振摇即可应用。第2 页，本讲稿共43 页 目前脂质体在生物技术，免疫调节，遗传工程,etc 各领域之间相互渗透，特别在生物医学领域中将会有更大突破。由于脂质体药物的治疗指数高，并能降低药物毒性和减少副作用，减少药物剂量，因此在药学领域将会有广泛的应用。第二节：脂质体的作用特点 脂质体（Liposome)是一种定向药物载体，属于靶向给药系统（trageting drug deliv

3、ery system)的一种新剂型，它具有类细胞结构，进入体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变药物在体内的分布，使药物主要在肝，脾，肺，骨髓等组织器官中聚积，从而提高其治疗指数。一、脂质体剂型的特点1、制剂工艺简单，一般药物都较容易包封2、水溶性和脂溶性药物可包裹于同一脂质中，药物的包封率主 要与药物本身的脂-水分配系数有关，与膜材性质有关。3、在体内使药物具有靶向性特征。4、药物在脂质体中，以非共价键结合。第3 页，本讲稿共43 页 5、能降低药物的消除速率，增加稳定性。6、可制备多种用途的剂型，eg：注射，口服，局部给药etc7、靶向性，主要进入网状内皮系统和血单核细

4、胞，进入细胞间质少8、毒性降低，药效增强。药物消除率降低，增加药物体内稳定性。（前体药物应用时应考虑的因素）二、脂质体的靶向性（一）被动靶向性（天然靶向性）这是脂质体静脉给药的基本特征，是由于脂质体进入体内即被巨噬细胞作为异物处理。一般的脂质体主要被肝，脾中网状细胞(phagocytic cells)吞噬，是治疗肝寄生虫，利什曼病等网状内皮系统疾病的理想药物载体。特别在治疗肝，脾肿瘤，防止肿瘤转移，扩散具有广阔的前景。肌内或皮下注射及腹腔注射后，首先进入局部淋巴系统中，对淋巴系统疾病的治疗，也有很好的靶向作用。（二）物理和化学靶向性 此种靶向性是设计中利用某种物理性因素或化学因素的改变，如局部

5、的PH 值，温度（病变部位）的改变而明显改变脂质体膜的通第4 页，本讲稿共43 页透性引起脂质体，选择性释放药物。For example:温敏感脂质体（temperature-sensitive liposome)，它使用具有一定的相变温度的脂质混合物作为膜材或使用相变温度为41-42C的合成磷脂为膜材，在热疗机对肿瘤局部的作用下，当脂质体药物进入肿瘤的毛细管床时，脂质体达到液晶态相变温度，导致脂质体迅速完全地释放药物，使血管内外的药物浓度迅速达到平衡，这种脂质体的物理靶向性不需要脂质体离开毛细血管。Eg:3H-TMX(标记甲氨蝶呤）在局部升温的肿瘤区的摄起量可增大10倍以上，并抑制肿瘤生长。

6、PH 敏感脂质体：利用某些弱离子性药物包封在脂质体中，当其进入体内，在肿瘤的低PH 局部或区域，可以选择性地释放药物。（三）转移靶向性 这种靶向性是采用预先封闭或减少网状内皮系统的摄取，然后再给药物脂质体。For example:先用胶体粒子阻断网状内皮系统的吞噬作用或先注射空白脂质体，使肝，脾摄取脂质体呈饱和状态，然后再给药物脂质体以增加非网状内皮系统的摄取。第5 页，本讲稿共43 页（四）主动靶向性 这种靶向性是在脂质体上联接一种识别分子，即配体，通过配体特异性专一地与靶细胞表面的互补分子相互作用，而使脂质体在靶区释放药物。多糖（或糖蛋白）植物凝血素 配体 肽类激素 抗原，小半抗原 抗体（

7、单克隆抗体）For example:放线菌素D 脂质体-IgM 型单克隆抗体治疗CH3/He 小鼠乳腺癌，显示出比单纯使用放线菌素D 高得多的抗癌效果。有人将癌细胞移植于小鼠腹腔内，次日注射该脂质体，给药剂量是游离剂量的1/10 以下，结果完全治愈。三、脂质体的长效作用 选择脂质体的组分和类型直接与药物释放有关，一方面，药物释放出脂质体是缓慢进行的，另一方面，还可设计不同半衰期的脂质体，作为长效药物的载体。第6 页，本讲稿共43 页For example:Rahman 采用阿霉素和阿霉素脂质体作药动学试验，剂量6mg/ug，静注。血药浓度峰值 1h后的血药浓度 t1/2游离阿霉素 1.7ug/

8、ml 0.3ug/ml 17.3h阿霉素脂质体 20.9ug/ml 10ug/ml 69.3hDSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)-胆固醇脂质体做成的药物,t1/2更长.四、脂质体降低药物的毒性 一般的靶向制剂，主要被肝，脾，骨髓等网状内皮细胞丰富的器官摄取绝大部份，而在心，肾中的积累量比游离药物低很多。五、脂质体保护被包封药物1）体外阻止药物的氧化或水解；2）体内阻止酶的分解；3）在靶区中，脂质体和细胞相互作用，或内吞进入细胞后，经溶酶体的作用而其解体释放出药物。第7 页，本讲稿共43 页 第三节 脂质体的组成，类型和理化性质一、脂质体的组成和结构（见图）脂质体=膜材料+附加剂 在磷脂的单分子结构

9、中，具有两条疏水链和一条亲水链，在卵磷脂-胆固醇结构中，磷脂分子构成一种“手杖”状态，亲水基相互靠拢，具有两个亲油基。（如上图）二、脂质体的类型（一）按脂质体结构和粒径分类 SUV 粒径200nm 1、单室脂质体 LUV 粒径2001000nm note:SUV在循环系统停留较长,靶性强,包封容积小,包封率低 LUV 膜不够稳定 2、多室脂质体MLV 3、多相脂质体Note:1）多室脂质体也称多层脂质体（MLV），粒径5um,药物溶 液被几层脂质双分子层所隔开形成不均匀的聚集体.第8 页，本讲稿共43 页2)MLV 包封率高,稳定性好,容易制备3)依制备方法,1、Bangham 薄膜法制备的M

10、LV MLV 分类 2、Szoka 逆相蒸发法制备的REV-MLV 表示 3、Gruner 改良逆相蒸发法制备的MLV 为SMLV（稳定型多层脂质体）4)多室脂质体，含有表面活性剂，是以单室或者多室脂质体为主及 少量的O/W 或W/O/W 型乳剂共混悬在水相的多相分散系。其主要优点可避免单室和多室脂质体，对脂溶性药物包封不全而呈较大油珠，符合静脉给药。1、一般脂质体 热敏脂质体（二）按功能分类 PH 敏脂质体 2、特殊性能脂质体 多糖被复脂质体 免疫脂质体（IL）超声，光敏，磁性脂质体Note：1）多糖为糖脂类物质，2）IL 中被抗体修饰 第9 页，本讲稿共43 页（三）按脂质体电荷性分类 中

11、性脂质体 脂质体 负电脂质体 正电脂质体（四）按脂质体用途和给药途径分类 1、气雾化脂质体 6、外用，经皮给药脂质体 2、静脉注射脂质体 7、肌注、局部注射脂质体 3、口服给药脂质体 8、免疫诊断脂质体 4、眼部用药脂质体 9、基因工程，生物工程用脂质体 5、粘膜给药脂质体 10、其他用途，etc 三 脂质体的理化性质（一）相变温度（Phase transition temperature)脂质体脂的物理性质与介质的温度密切相关，当温度升高时，双分子层中酰基侧链从有序变为无序，引起脂膜的物理性质的一系列变化，可由“胶晶”态变为“液晶”态，双分子层厚度减小，膜流动性增加，这种转变时的温度称为相变

12、温度。它取决于脂质第10 页，本讲稿共43 页体膜的磷脂的种类，与侧链R-C-基团的长短，酰基越长，则相变 O温度越高，反之则越低。在相变温度时，脂质体内的药物具有最大释放速率。eg:二肉豆寇磷脂酰胆碱 24C 二棕榈酸磷脂酰胆碱 41C 二硬脂酰磷脂酰胆碱 58C 胆固醇具有调节膜流动性的作用，当在脂质体膜中加入50%（质量分数），可使膜相变消失。Papahad joponlos 称“胆固醇为流动性缓冲剂”（fluidity buffen）研究发现低于相变温度时，磷脂中加胆固醇则可使膜减少有序排列增加膜流动性，高于相变温度时加胆固醇则可增加膜的有序排列而减少流动性。脂质体的膜材常由两种以上磷

13、脂组成，它们各有特定的相变温度，在一定的环境下，它们可以同时存在不同的相，称之为相分离。（phase separations）Sackmann 曾用自旋共振光谱证明磷酯酰胆碱：磷脂酸（1：1）混合 第11 页，本讲稿共43 页膜中，加多粘菌素其多粘菌素可与磷脂酸结合而诱发脂膜形成区块结构（Clomain structure)（二）脂质体的荷电性 脂质体含酸性脂质组分多时，荷负电。Eg:PA PS 含碱基（胺）荷正电 不含离子的脂质体，显电中性 其检测方法：荧光法 显微电泳法 荷电性直接与脂质体，包封率，稳定性，靶器分布，靶细胞作用有关（三）脂质体，粒径和粒度分布 采用显微镜，电镜，Coulte

14、r 计数法，激光散射法，微孔滤膜-吸光度法 对脂质体粒径和粒度分布的影响，主要受制备方法和类脂用量的影响 超声法 制备 小单室脂质体SUV 乙醇注入法第12 页，本讲稿共43 页乙醚注入法 大单室脂质体LUVCa2+融合法LUV 超声 Ca2+融合 LUVMLV SUV MLV 加类脂用量 第四节：脂质体的制备技术 近20 年来，人们对脂质体的制备进行了大量研究，目前制备的方法颇多，这里只介绍常见的几种方法。一，制备方法（一）薄膜法：又称干膜分散法（TFV),最早由Bamgham 报道 加适量CHCl3 薄膜干燥方法：磷脂膜材 脂溶性药物可加溶剂中 薄膜 干膜超声法 缓冲液（含水溶 薄膜振荡分

15、散法 性药物）振摇 薄膜匀化法 大多层脂质体 薄膜挤压法For example:P116,VitB12脂质体，生育酚脂质体制备第13 页，本讲稿共43 页（二）逆相蒸发法 最初由Szoka 提出此法 方法：CHCl3orEt2O 药物水溶液 短时超声 磷脂膜材 溶液 W/O 乳剂 减压蒸发 凝胶色谱 减压蒸发 滴加缓冲液 CHCl3orEt2O 大多层脂质体 混悬液 胶态状物（2001000 nm）离心 旋转蒸发器上旋转 包封率60%本法的关键：在于磷脂：有机溶剂：含药缓冲液三者比例 一般有机相：水相（24：1）较适宜 适合包裹水溶性药物，生物大分子，抗生素etc for example:P1

16、17 1）伯氨喹脂质体制备 2）胰岛素脂质体制备（三）复乳法 本法首先是由Matsumoto 报道 第14 页，本讲稿共43 页方法：乳化 减压除部分溶剂 加大量水相少量水相+多量磷脂油相 W/O 反相胶团 也可不除溶剂 乳化 蒸发有机溶剂 W/O/W 复乳 脂质体（包封率20%80%）For example:甲氨喋呤脂质体的制备 P117类似的方法有改良复乳法，Kin复乳法。P117其中Kin法制备的脂质体是一种优良的生物模型（四）熔融法 此法首先由顾学裘等报道方法：少量水相溶解 65C 水相 磷脂+表面活性剂 油相 脂质体 熔融 保温 胆固醇 该法不同有机溶剂，适合于工业生产 for ex

17、ample:1395（高三尖杉酯碱）脂质体制备P118第15 页，本讲稿共43 页（五）注入法 此法最早由Deamer 发表 方法：Et2O 或EtOH 类脂质+脂溶性药物 油相 乳匀或 搅拌 脂质体 混悬液 水相（或含水溶性药物）超声 挥尽有机溶剂（有机溶剂沸点以上）Note:乙醚注入法 乙醇注入法（大于乙醇法）0.25um for example:唐松草新碱脂质体制备 P118（六）冷冻干燥法（七）表面活性剂处理法 本法来自重组膜技术，特别适合于类脂的混合物和包封酶及 生物分子。胆酸盐，脱氧胆酸盐 脂质膜，多层脂质体或单层脂质体 处理后混合胶团 离心或凝胶过滤或透析 单层脂质体（30180

18、nm)第16 页，本讲稿共43 页 本法关键技术：从混合胶团中除表面活性剂，并自发形成单层脂质体。蛋白质类药物嵌入双层脂膜中间，包封率可高达100%。此外还有钙融合法，加压剂出法。Etc二、脂质体的分离技术 透析法：注意洗涤液与脂质体混悬液应等渗 离心法 凝胶过滤法：脂质体先下，游离药后下来三、脂质体制备方法的评价（1）载药量（2）稳定性（3）形态完整性第17 页，本讲稿共43 页 第五节：脂质体制剂的质量评价 脂质体是一个发展中的新剂型，其质量评定标准尚在逐步完善中，根据其特点应从下面几个方面来进行控制。一、形态，粒径及其分布 采用显微镜，电镜技术，电感应，光感应技术及激光散射或激光移度法，

19、测定粒径及分布状况。二、包封率的测定 脂质体中的药量 包封率=100%介质中药量+脂质体中药量 表示方法：Qw：重量包封率（%）反映包入药物量与总投量的关系 Qv：体积包封率（L/mol)反映脂质体体积与总粒子的体积比 Ew：药脂包封比，反映了药物与辅料关系 W包 W总-W游 Qw%=100%or Qw%=100%W总 W总第18 页，本讲稿共43 页 V 脂质体 W总-W游Qv%=100%Ew%=100%V总脂质体 W类脂质体三、渗漏率的测定 脂质体在液态介质中渗漏状况 贮存一段时间后渗漏到介质中的药量 渗漏率=100%贮存前包封的药量四、药物体外释放度测定 Visking 透析管法 方法

20、试管离心法五、药物体内分布的测定 为药代动力学内容，通常以小鼠为受试对象，将脂质体 静注，测t-血药浓度，t1/2，脏器组织的药物滞留量等。六、主药含量七、制剂通则 第19 页，本讲稿共43 页磷脂的氧化程度 1、氧化指数：是双键偶合的指标 氧化指数=A233nm/A215nm2、氧化产物：丙二醛及溶血磷脂3、有机溶剂残留附：类脂质体 类脂质体亦称泡囊（niosomes)，系指用非离子型表面活性剂为囊材制成的单层囊泡（nonionic surfactant vesicles)，其特点是稳定性高于脂质体，可克服脂质体因磷脂氧化而带来的毒性，近年来受到过内外的关注，成为很有前途的新型药物的传递系统

21、。类脂质体的制法与脂质体相近。如由薄膜分散法制得的卡铂泡囊与异烟肼炮囊等，均具有缓释与肺靶向的双重性质，可提高药效，降低毒副作用。第20 页，本讲稿共43 页 第六节：脂质体作用机制给药途径 脂质体属于胶体系统，具有靶向和缓释作用，从而提高疗效，降低不良反应，能显著增强细胞摄起，延缓或克服耐药性，甚至可使药理作用小或无活性的物质（eg:油酸）成为显著作用的药物。脂质体在体内组织处置及在细胞水平上的作用机制有吸附，交换，融合，内吞，渗透和扩散等。一、脂质体与细胞的相互作用1、吸附 在接近或低于相变温度时，流动性低的脂质体可稳定吸 附到培养的细胞表面，属于普通物理吸附现象。2、脂交换 脂质体的脂类

22、与细胞膜上脂类发生交换，此过程在细 胞表面蛋白的介导下，仅发生在脂质体双分子层中外部单分子 层和细胞膜外部的单分子层之间，而脂质体内含物并未进入培 养细胞。脂质体与血浆中各组织细胞也可能发生交换。3、内吞 内吞是脂质体主要作用机制，是非渗透性载体穿过细胞 的最普通形式，内吞后进入溶酶体中或在溶酶体外作用。结果 融合 消化 裂解释药4、融合 膜体的膜与细胞膜融合，载药入细胞内。第21 页，本讲稿共43 页5、渗漏 当受纤维cell，肝Ca-cell 及肝，胆囊cell 等诱导，脂质 体内含物漏出，与细胞表面蛋白有关。6、扩散 皮肤用脂质体，凝胶制剂的机制7、磷脂酯酶消化 脂质体磷脂膜消化与体内磷

23、酸酯酶含量成正 比，肿瘤组织中此酶水平较高，因此脂质体在肿瘤组织中更 易释药。二、脂质体给药途径（一）静脉注射（二）肌注，皮下注射（三）口服（四）眼部给药（五）肺部给药（六）皮肤给药第22 页，本讲稿共43 页 综 述 长 循 环 脂 质 体 的 研 究 概 况一、历史及机理二、衍生化脂材料三、制备方法四、现状与进展参考文献第23 页，本讲稿共43 页 长循环脂质体（Long Circulating Liposomes,LCL)是指可逃避单核吞噬细胞系统（Mononuclear Phagocyte System,MPS,即通常所说的网状内皮系统，RES）的识别及捕获，长时间停留在循环系统中的脂

24、质体。从广义上讲，长循环脂质体包括：1）高温相变中性磷脂制成的小单室脂质体2）空间稳定脂质体（Sterically Stablized Liposomes,SSL)或称隐形脂质体(Stealth Liposomes,SL)，后者实际上是美国脂质体技术公司（现名SEQUUS 公司，已并入ALZA 公司）的商标名称。文献中长循环脂质体往往指后者。与普通脂质体相比，长循环脂质体具有以下优点：1）循环半衰期长，隐形脂质体人体内t1/2可长达45 小时。2）减少被MPS 摄取的速度和程度，降低对机体这一重要防御系统的伤害，保证其正常生理功能的行使。3）空间稳定脂质体可实现免疫脂质体的体内靶向性。4）增加

25、靶部位如肿瘤组织及感染部位的吸收量，原理是穿过病理状态下高通透的毛细血管间隙，进入组织内部。5）空间稳定脂质体体内过程可具有线性药动学特征，而普通脂质第24 页，本讲稿共43 页体体内过程一般为剂量依赖性的非线性过程。一、历史及机理 1965 年Bangham 发现脂质体，70 年代Gregoriadis 首先将脂质体用于药物传递。70 年代后期至80 年代初期对脂质体的研究达到高潮，大量文献发表，SEQUUS 等公司先后成立。但是当时以卵磷脂（大多自行提取，纯度不高）制备的普通脂质体体内外稳定性差，体外放置稳定不超过二星期，静注后易于被单核吞噬细胞系统捕获，集中富集于肝脾，其他组织分布少，体

26、内半衰期不超过1 小时，难以到达其他靶位，极大地限制了临床应用。研究领域内出现了明显的失望情绪，80 年代中期文献量显著下降。但由于脂质体天然具有的优点，制备用材料与细胞膜脂成分相同，可与细胞融合；生物相容性高，无毒性。研究者们没有放弃努力，在提高天然磷脂纯度，应用合成磷脂、减小粒径（SUV 的t1/2长于LUV 和MLV)，选择抗氧剂，制成冻干脂质体和前体脂质体等方面进行了不懈的探索，解决了体外稳定性问题，由高温相变中性磷脂（如二脂酰磷脂酰胆碱或神经鞘磷脂）第25 页，本讲稿共43 页和高比例胆固醇制成的小单室脂质体使循环时间有相当程度的延长，成功的例子如DaunlXome，其机理是粒径小，

27、表面积小，生温度下，脂质体呈胶态，血浆中的蛋白成分不易粘附，脂蛋白的破坏作用和免疫调理受到抑制；研究者们从红细胞长时间停留在循环系统中得到启发，模拟其膜脂组成制备脂质体，体内外稳定性大大改善，静注后循环时间大大延长。1987 年Allen 等首先报道了在脂材料中掺入单唾液酸神经节苷酯（GMI）的长循环脂质体；1988年Gabizon 等报道了在脂材料中掺入氢化磷脂酰肌醇（HSPI）的长循环脂质体。但是单唾液酸神经节苷酯及氢化磷脂酰肌醇提取和合成困难，来源有限，只适用于高温相变磷脂，不利于规模化应用。研究中，人们从分子水平掌握了空间稳定的机理。掺入神经节苷酯和氢化磷脂酰肌醇，其分子的亲脂性部分保

28、留于脂质双分子层中，亲水部分伸展于外，形成空间屏障（StericalBarrier），阻止血中各种蛋白成分，尤其是具调理作用的成分如补体C3等，粘附膜表面，防止调理化，从而抑制经典和替代免疫途径的启动，避免单核吞噬细胞系统的吞噬。这一机理指明了寻找替代品的方向，即亲水性高分子衍生化第26 页，本讲稿共43 页的脂材料，1989 年Allen 和Klibanov 等先后报道了使用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇衍生物（PEG-DSPE）制备的长循环脂质体。从此长循环脂质体研究进入了快速发展阶段。长循环脂质体的发展是仿生学的成果。长循环脂质体的出现，促进了整个脂质体领域的复兴；长循环脂质体的研究，形

29、成了脂质体研究史上的第二高潮（八十年代末至今）。其标志就是1989年JOVRNAL OF LIPOSOME RESEARCH 创刊.二、衍生化脂材料 为达到长循环的目的，衍生化脂材料所需要的结构特征：1）脂部分亲脂性足够强，保证其长时间保留于脂质体膜中，不被血流机械剥脱；2）亲水性高分子部分链长适宜，以PEG 为例，分子量不得小于7503）偶联键在体内稳定，不易水解导致脱保护。衍生化脂材料以脂部分组成可分为三类：1）磷脂衍生物，如磷脂酰乙醇胺衍生物、磷脂酰甘油衍生物。2）甾醇衍生物，最早由Allen 等使用，近年主要为日本研究者用，由于合成相对困难和对双分子层结构的稳定不利，应用较少。第27

30、页，本讲稿共43 页3）类脂衍生物，如吐温80，十八胺的聚乙二醇衍生物 从前述条件来看1）类优于2）3）类。亲水性高分子部分则主要使用聚乙二醇（PEG）；研究表明PEG2000-DSPE 较右旋糖苷、聚乳酸、聚乙烯醇、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、普朗尼克衍生物甚至同类的PEG2000-DPPE 效果更好，这是由于：1）PEG 亲水性 聚乙二醇具有强亲水性（高分子量聚乙二醇生化提取时可用作蛋白脱水剂）。单纯PEG2000 以任意线圈构象存在时，每个分子能结合1364 个水分子，而以Brush 构象存在的DHP-PEG2000分子能结合2106 个水分子。随PEG-脂质复合物浓度增加至约7mol%时，脂

31、质体双分子层绝热压缩系数增加，提示脂质头基区水分子减少，使脂质体表层脂质双分子层缺如降低，磷脂酰基链侧面包蔽增加。PEG 水合作用与脂质头基区去水合作用对含有5-7mol%PEG-脂质复合物的脂质体热力学稳定性均有正向作用，而当PEG-脂质复合物浓度进一步增加时，由于PEG 侧面排斥作用，脂质头基区水合增加，双分子层包蔽弱化，脂质体稳定性反而降低。2）PEG 柔顺性 聚乙二醇为链状分子，无环系结构，分子结构第28 页，本讲稿共43 页可自由扭转，可使脂质体表面聚合物层出现一个构象云，使之在相对较低的浓度时也能阻止溶质渗透，如0.2%摩尔的PEG4400 已有保护作用，从高分子溶液的简单统计模型

32、可以粗略解释：把高分子溶液视为一个三维网络，每格均被一个聚合单元或溶剂（水）分子所占据。聚合物分子柔顺性 越好，聚合单元相对于邻近单元的运动就越独立，这样它可能构象的总数就越多，从一个构象转变为另一个构象的速率就越快，结果是水溶性使高分子所有可能的构象分布成为一种统计“云”而存在。高分子的柔顺性 使其在溶液中占据许多格，可瞬时把水分子挤出，故使需要自由的水分子进行扩散的蛋白质不可通过。因此，少量的具有水溶液性和高柔顺性的聚合物分子就能在脂质体表面形成足够密的“构象云”，从而保护脂质体不受破坏或发生修饰作用。如果固定在脂质体上的聚合物有一刚性链，其可能性构象很少，构象之间转变很慢，这就导致其“构

33、象云”密度很低且不均匀，其在网络模型中，表现为存在足够多的水分子空间，使得血浆蛋白能扩散到达脂质体表面。Torchilin 应用计算机模拟方法，将固定在脂质体表面的聚合物空间分布用一个三维随机飞行模型来模拟，发展了柔顺性高分子在 第29 页，本讲稿共43 页粒子表面的行为模型。假定聚合物由能围绕链段连接点自由转动且刚性的链段组成，其长度是柔顺型的5倍。计算机分析结果表明：柔顺型聚合物形成高密度“构象云”。而同样长度刚性聚合物则形成宽松可渗透“云”。该模型的另一结论是PEG 在不饱和浓度时，脂质体表面可有两种反应活性中心，一种是未被PEG 占据的部分，性质与普通脂质体表面相同，另一种是被PEG

34、占据的部分，能阻碍修饰作用发生。但这一模型忽视了构象云之间的影响以及蛋白质与脂质膜间吸引力对构象云的影响。普通磷脂酰基链碳数随来源不同而有差异，14-22 之间不等，即PEG-DPPE 中棕榈酰碳数；PEG-DSPE 中硬脂酰碳数为18，使得PEG 链充分伸展于双分子层外，相同链长下构象云覆盖范围更大，保护作用更强。3）与脂膜结合紧密程度 通常认为，血液中脂质体的破坏是由于高密度脂蛋白（HDL）等亲脂性蛋白把磷脂分子从双分子层中转移出来，破坏了脂质双分子层的紧密程度，使其通透性增加，导致脂质体包封物泄漏。单纯Me-PEG 或PEG-硬脂酸不能降低RES对脂质体的摄取，因为这些化合物与脂质体连接

35、很弱；PEG-二棕榈酰甘油酯和PEG-胆固醇使脂质体循环延长的作用大于Me-PEG第30 页，本讲稿共43 页和PEG-硬脂酸而小于DSPE-PEG，其较易被HDL 从脂质体中转移或交换出来，或与PEG 相连的键断裂，使PEG 衍生物或PEG 离开脂质体，导致脂质体被破坏而清除；DSPE-PEG 有两个饱和十八碳酰基链，与脂质体连接最牢，保护作用最强，与GMI 相比，PEG-DSPE 除用量较少外，其优点还表现在：易于合成，无毒，无免疫原性，能使粒径范围较宽的脂质体循环延长，同时，DSPE-PEG 适用于与高或低温相转变的磷脂配伍，而GMI 只适用于高温相转变磷脂。4）PEG 链长和浓度 随P

36、EG-磷脂酰乙醇胺浓度增加，PEG 链加长，其抑制脂质体凝集程度也增大。在10mol%时，PEG750-磷脂酰乙醇胺，PEG2000-磷脂酰乙醇胺，PEG5000-磷脂酰乙醇胺对脂质体凝集抑制程度分别为14%、55%和100%。当浓度处于0-10mol%时，PEG750-磷脂酰乙醇胺抑制RES 摄取的作用呈线性增加，半衰期呈线性延长；而对PEG2000-磷脂酰乙醇胺和PEG5000-磷脂酰乙醇胺而言，当浓度增加到5mol%时，这种抑制作用达到坪期。脂质体凝聚结构从层状转变到胶束状会经历一个双层平盘中间态，一旦转变为开放结构，其第31 页，本讲稿共43 页药物包裹能力丧失。因此掺入到脂质体中的P

37、EG-脂质复合物的上限取决于形成双层平盘的浓度，而不是混合胶束形成的浓度。该浓度受PEG 链长和磷脂链长影响，而磷脂饱和度和胆固醇的存在与否并不影响。所以目前为止最常用的衍生化脂材料是PEG 衍生化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE），常用量5-10%mol，大于20%双分子层不稳定。三、制备方法 对于第一类长循环脂质体，制备与普通脂质体相同；而第二类-空间稳定脂质体则有：1、常规法 将衍生化脂材料与普通脂材料混合或共溶于溶剂中，按脂质体制备方法，如逆相蒸发法等进行，最为常用。2、掺入法 将制成的脂质体与衍生化脂材料混合，温育而成。优点：衍生脂分子主要定位于脂双分子层外层，避免了对内部空

38、间的占用，实际包封体积大。第32 页，本讲稿共43 页缺点：1）增加操作步骤 2）衍生脂负载量无保证3、偶联法 将制成的脂质体与亲水性高分子化学偶联而成。优点：同上，同时可通过控制反应来控制负载量 缺点：1）操作复杂 2）适用范围窄，若药物可参与反应，使用不便四、现状与进展（一）长循环脂质体的靶向给药 靶向给药的概念是本世纪初由Ehrlich 提出的，主要是为了提 高药物在体内的选择性并降低毒副作用。研究对象主要是抗癌药 等细胞毒性药物。至今，围绕这一目标所取得的进展不大，主要 集中于长循环药物传输系统方面。长循环脂质体适于靶向治疗应 用，特别是它能选择性地趋向肿瘤组织并保持较高的药物浓度（大

39、于注射剂量的10%），使得这种类型脂质体在治疗癌症方面应 用前景广阔。它在循环中的半衰期可达几十小时，肿瘤组织生长 时，其内部会生长出新的血管，并且可以通过血管壁上固有的孔 第33 页，本讲稿共43 页隙为肿瘤组织提供其生长所需的氧和氮。长循环脂质体被吸收进入肿瘤组织机制与以下两个因素有关：1）在肿瘤血管生成过程中其渗透性的增加使长循环脂质体能从毛细血管末端渗漏出来，并集中于肿瘤组织的内部间隙。2）长循环脂质体与普通脂质体相比具有血管渗透系数增加的特性，使得它能更容易透过毛细血管，然后可能通过细胞间的途径，到达肿瘤细胞间隙。长循环脂质体能集中于感染部位的能力可能是在疾病过程中感染组织生长时，毛

40、细血管渗透性增加的结果。在人体内的药动学试验表明，长循环脂质体与游离药物或普通脂质体相比具有更小的血浆清除率、表观分布容积以及更大的药-时曲线下面积，而且所包封的药物在人体内的半衰期达45 小时。当前进展集中于结合其它脂质体类型的研究，主要有：1）长循环免疫脂质体 长循环脂质体终究属于被动靶向制剂，在某些情况下，它并不会特别有效，例如，根除循环系统中的 白血病细胞或转移到血液或淋巴系统中的癌细胞；因此需要主 动靶向的免疫脂质体（immunoliposome)。但和其他抗体介导 的常规靶向给药制剂一样，普通免疫脂质体在体内无效，这主第34 页，本讲稿共43 页要是因为普通脂质体在体内能很快被单核

41、吞噬细胞系统吞噬，表面结合抗体的普通免疫脂质体因其免疫激活作用进一步增强吞噬而导致其失效。所以要实现脂质体的体内特异性靶向，开发长循环的空间稳定脂质体是必要的。空间稳定的免疫脂质体（stericallyStabilized immunoliposome,S-immunoliposome)是一种表面结合有特异抗体的空间稳定脂质体，可在循环中长时间存在使得其有充分的机会寻找靶位并与之结合而进一步提高治疗指数。Allen 等制备了阿霉素靶向脂质体，在鼠体内较非靶向脂质体对人类B 型淋巴瘤更有效。在抗体和PEG 链同时结合在脂质体表面的情况下，使用高分子量的PEG（5000Da）时，空间位阻使抗体与靶

42、位的结合受到阻碍；而使用低分子质量的PEG（如750Da)时，将会使脂质体在循环中的半衰期变短；中等分子量的PEG 则可兼顾靶向性和长循环性，但对于小分子配体如叶酸则难以奏效。从1993 年开始，一种新的结合技术使抗体或配体结合到脂质体表面上的PEG链的末端上，而避免了PEG 链对靶位识别的干扰。Blume 等使用这种技术合成了PEG-DSPE 的羧基衍生物（COOH-PEG-DSPE），将一种蛋白质（胞质素），结合到PEG 的末端，体内试验证实，第35 页，本讲稿共43 页脂质体仍保持着长循环性，而且对靶体纤维蛋白的结合能力没有变化；用类似方法，Zalipsky 合成了PEG-DSPE 的酰

43、肼衍生物，Maruyama 合成了PEG-DSPE 的马来酰亚胺衍生物（Mal-PEG-DSPE），将抗体结合到脂质体PEG 的末端，同样具有长循环性和靶向识别能力。为减小免疫原性，近年采用所谓“小型化抗体”，即去除Fc段的Fab片段，与抗原亲和力无明显下降。2）长循环PH 敏感脂质体 脂质体包封的药物若经内吞进入溶酶体，则不易进入胞浆，产生作用，Adlakha-Hutcheon 等制备了米托蒽醌PFV（Programmable Fusogenic Vesicles），到达低PH 的肿瘤部位后，二油酰磷脂酰乙醇胺无法稳定地以双分子层存在，脂质体解体，药物爆发性释放；动物模型实验表明其疗效优于普

44、通长循环脂质体。（二）衍生材料的发展和长循环脂质体的推广应用 研究证明，磷脂酰乙醇胺聚甲基/乙基唑啉衍生物与磷脂酰乙醇胺聚乙二醇衍生物作用相当；一种称为Fleximer 的聚合物也与PEG 相当。然而可高比例使用或选择性降解的衍生材料并未见于报道。脾脏摄取作用主要是与粒径相关的滤过机制，而肝脏摄取则主第36 页，本讲稿共43 页要受各类受体介导；开发可大比例使用的衍生脂材料，有助于实现特异性的脾靶向，并可制备更大粒径的长循环脂质体。长循环脂质体应用于基因治疗，可保护治疗基因和反义核苷酸免受血液中的酶解和内皮网状系统的破坏，降低阳离子脂质的组织毒性；但到达靶位后，表面的亲水性高分子层不利于脂质体

45、与靶细胞的融合，从而妨碍治疗基因的表达和反义核苷酸对目标基因的阻断；开发可选择性降解的衍生脂材料，有助于实现高效的非病毒介导基因治疗和更精确的靶向给药。现在，SEQUUS 公司的阿霉素隐形脂质体Doxil 和NEXSTAR公司的柔红霉素长循环脂质体DaunoXome 以液体制剂形式获得FDA最后批准，应用于爱滋病（HIV）并发的难治性卡波济氏肉瘤（KS）；NEXSTAR 公司的血管造影脂质体Indium 获得FDA 最后批准；美国脂质体公司的阿霉素长循环脂质体TLC-D99 已在欧洲得最终批准用于乳腺癌治疗。人们有理由相信，随着研究的进一步深入，必将会有更多的长循环脂质体制剂投入临床。第37

46、页，本讲稿共43 页中药脂质体制备的研究进展l 1 中药脂质体的制备方法l 1.1薄膜分散法l 紫杉醇和人参皂苷脂质体的制备l 1.2薄膜超声波分散法l 大黄素纳米脂质体，黄连素脂质体，猪苓多糖脂质体的制备l 1.3融熔法l 黄芪多糖脂质体和高三尖脂碱多相脂质体的制备第38 页，本讲稿共43 页2.4 冻干法 备蓖麻毒素脂质体 2.5 冻融法 骆驼蓬总碱和丹参酮脂质体 2.6 注入法 唐松草新碱脂质体、雷公藤内酯酮多相脂质体、去氢骆驼蓬碱脂质体和小檗碱脂质体 第39 页，本讲稿共43 页2.7 逆相蒸发法 补骨脂素脂质体、香菇多糖脂质体、天麻素脂质体、冬虫夏草多糖脂质体和紫杉醇磁性长循环脂质体。2.8 复乳法 制备高三尖杉酯碱脂质体 第40 页，本讲稿共43 页2.9 前脂质体法 丹参酮前脂质体 2.10 匀化法 制备汉防己甲素脂质体 2.11 其他 第41 页，本讲稿共43 页3 中药脂质体的应用3.1 抗癌药物 3.2 免疫制剂 3.3 抗菌、抗病毒药物 3.4 其他药物 第42 页，本讲稿共43 页4 评价与展望 4.1 脂质体的稳定性不够 4.2 脂质体内容物的泄漏 4.3 脂质体的包封率和载药量 4.4 制备工艺难以工业化 第43 页，本讲稿共43 页