流式细胞术的原理和临床优秀课件.ppt

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1、流式细胞术的原理和临床第1 页，本讲稿共41 页n n 溴脱氧脲嘧啶核苷替代胸腺嘧啶脱氧核苷参与DNA 的合成，测定DNA 的合成速率。n n 异染性荧光染料AO，同染DNA、RNA 识别G0/G1 期。第2 页，本讲稿共41 页n n 二 测 定 细 胞 周 期 蛋 白、癌 基 因 及 抗 癌基因蛋白对 细 胞 周 期 调 节 机 理 研 究 进 展 较 快，真 核 细 胞 的 增 殖 是 控 制 在 细 胞 周 期 的 特定 阶 段，特 别 是 在G1 到S 期 以 及G2 到M期 移 行 部 位。Cyclin（周 期 蛋 白）作 为Cyclin 依 赖 性cdk 复 合 体 的 调 节

2、亚 单 位，对细胞周期起重要的调节作用。第3 页，本讲稿共41 页n n Cyclin 家族中有8种CyclinA、B、C、D、E、F、J、H。CyclinA、B、F 及E 在细胞周期中不间断的表达。这些蛋白质合成及降解构成了细胞周期的特征性。n n 增殖细胞核抗原PCNA 是一稳定的细胞周期相关性核蛋白，在G1 期和S 早期，PCNA 水平升高23 倍，在G2 期保持低值。n n Ki-67 核抗原可见细胞周期全过程，而静止期G0 无表达。第4 页，本讲稿共41 页n n C-erB-2，产物是分子量为190KD 跨膜糖蛋白，其结构类似于表皮生长因子受体，过表达C-erb 常常与肿瘤细胞较快

3、增生及病人预后有关，使用FCM 可测定C-erb-2在乳腺癌等中的表达，并可进而分析与病人预后的关系。第5 页，本讲稿共41 页n n MYC 基 因 家 族 由 C-MYC、N-MYC 及 L-MYC 构 成，也 是 与 细 胞 增 殖 有 关 的 癌 基因，最 近 的 研 究 提 示MYC 基 因 与 凋 亡 的诱导有关。n n P53 已被认为是一种抗癌基因。野生型P53 蛋白是一种细胞生长抑制物，能阻断细胞周期循环。人类的许多恶性肿瘤中，可见P53 突变，用FCM 可以测定P53 在癌细胞内表达，从而评估诊断和预后。第6 页，本讲稿共41 页P53TumourSuppressorGen

4、e第7 页，本讲稿共41 页Humanp53ProteinAntibodyMappingSites Humanp53ProteinAntibodyMappingSites第8 页，本讲稿共41 页n n 三细胞内PH 及Ca2+测定Ca2+除 了 作 为 细 胞 内 许 多 关 键 和 功 能蛋 白 的 辅 基 之 外，还 是 重 要 的 细 胞 内 信使，测 定 细 胞 内Ca2+的 变 化，对 于 了 解 细胞 内 信 息 传 递，细 胞 调 亡 等 都 有 一 定 的意 义。使 用Ca2+特 异 的Fluo3 染 料 标 记细胞可用FCM 测定Ca2+的变化。用SNARF1 标 记 细

5、胞，用FCM 可 测定 细 胞 内PH，例 如 癌 细 胞 在 受 到 加 热 或化疗细胞内PH 下降。第9 页，本讲稿共41 页n n 四细胞凋亡研究上的应用细胞死亡在多细胞生物通过两种机理而产生，即凋亡和坏死。凋亡不仅与个体形成等基本生命现象有关，而且与癌、AIDS 等多种疾病的发生密切相关。电泳分析可见DNA 呈阶梯状改变。使用FCM 能精确定量凋亡细胞，同时可进行多参数分析。第10 页，本讲稿共41 页n n 原位标记DNA 断裂的方法已用来鉴别凋亡的细胞，使用生物素或地高辛标记的脱氧核苷酸在外源性DNA 聚合酶或TdT作用下，标记3-OH。荧光素标记的二抗与其结合，用流式细胞术检测凋

6、亡细胞。第1 1 页，本讲稿共41 页n n 凋亡蛋白的检测：反映细胞凋亡的早期蛋白AnnexitV其他P53 蛋白、Myc 蛋白、bcl-2 蛋白、Bax 蛋白等等。第12 页，本讲稿共41 页n n 五、多药耐药检测近年来的研究发现癌细胞耐药性与癌细胞内存在耐药基因有关。多药耐药基因（multidrugresistantgene,MDR）的产物为P-糖蛋白（P-GP 或P-170）。P-170是分子量为170KD 的跨膜蛋白，利用ATP的能量将抗癌药物排出细胞外。除在正常细胞上表达外，常常在许多实体肿瘤细胞及白血病中高表达，提示耐药性增高。故对于肿瘤化疗病人，检测P-170 有重要的临床意

7、义，可指导癌症治疗。第13 页，本讲稿共41 页n n 用 抗P-170 抗 体 标 记 肿 瘤 细 胞，用 流 式 细胞 术 可 直 接 测 定P-170 表 达。也 可 用 罗 丹明 荧 光 染 料 作 为 被 测 抗 癌 药 物 在 细 胞 中的 积 聚。在 耐 药 细 胞 有P-170 糖 蛋 白 的 过表 达，使 进 入 细 胞 的 罗 丹 明 荧 光 染 料 可以 被 泵 出 细 胞 外，细 胞 内 的 罗 丹 明 减 少，荧光强度降低，可以用FCM 检测。第14 页，本讲稿共41 页流式细胞术在免疫学中的应用n n 一、细 胞 表 面 标 记 及 抗 原 决 定 簇 性 质 的研

8、究流 式 细 胞 术 在 细 胞 表 面 标 记，特 别是 肿 瘤 细 胞 表 面 标 记 的 研 究 中，以 及 在细 胞 分 类 和 亚 群 的 分 析 上，开 始 了 一 场细 胞 免 疫 学 的 革 命。尤 其 在 细 胞 表 面 标记分析上，占有举足轻重的地位。第15 页，本讲稿共41 页n n 11 血 液 系 统 细 胞 表 面 标 记 的 研 究 可用 于 白 血 病 细 胞 的 免 疫 分 型 和 淋 巴 瘤 的研究。n n 12细胞群体及细胞表面标记变化的检测可以发现体内外细胞表型及细胞亚群的微小变化，有利于发现恶变的肿瘤细胞，或在免疫治疗及宿主排异反应中抗原决定簇发生改变

9、的细胞群体。第16 页，本讲稿共41 页第17 页，本讲稿共41 页n n 13细胞表面抗原决定簇性质研究n n 14 细 胞 表 面 标 记 的 分 子 变 化 的 定 量 分析n n 15细胞抗原表达的研究第18 页，本讲稿共41 页n n 细胞抗原的表达和细胞的其他生物和生化变化一样，是细胞增殖和增殖活动中的一种现象。研究正常和肿瘤细胞增殖、分化及周期活动中抗原表达，对于加深对肿瘤发生、发展、肿瘤细胞及肿瘤实体的异质性，肿瘤入侵转移的认识和它们同肿瘤诊治，耐药性的认识是十分重要的。第19 页，本讲稿共41 页n n一、临床免疫学中的应用一、临床免疫学中的应用n n11、机体免疫状态评估、

10、机体免疫状态评估就用就用FCMFCM及荧光染料标记的特导性单克隆抗体，及荧光染料标记的特导性单克隆抗体，可对细胞表面标记物进行研究。结合细胞分选技可对细胞表面标记物进行研究。结合细胞分选技术，将分选同鉴定结合进行，可分离出所需的细术，将分选同鉴定结合进行，可分离出所需的细胞群体，纯度可达胞群体，纯度可达95%95%以上。现在命名的以上。现在命名的CDCD系列系列已有已有130130种细胞表面分化抗原，可分选、分析出种细胞表面分化抗原，可分选、分析出外周血细胞、亚群及亚群中的亚群，也可以对循外周血细胞、亚群及亚群中的亚群，也可以对循环免疫复合物及其它免疫指标检测。例如，环免疫复合物及其它免疫指标

11、检测。例如，HLA-B27HLA-B27检测，其抗原阳性与强直性脊柱炎及炎症检测，其抗原阳性与强直性脊柱炎及炎症性肠病等有不同程度的正相关。性肠病等有不同程度的正相关。第20 页，本讲稿共41 页用于免疫细胞表型分析的基本抗体IgG1/IgG2IgG1/IgG2CD3/CD8CD3/CD8CD45/CD14CD45/CD14CD3/CD16+56CD3/CD16+56CD3/CD4CD3/CD4CD19CD19第21 页，本讲稿共41 页n n 11免疫缺陷病它是由于机体免疫系统先天发育不全或后天受损所致的一种临床综合症。用FCM 行T 细胞表型分析大多数可用于分类诊断先天性或获得性的免疫缺陷

12、综合症。如大多数伴严重联合免疫缺陷（SCID）的患者血中缺乏成熟的T 细胞，个别病例血中有循环T 细胞，但表型异常。第22 页，本讲稿共41 页n n AIDS，大多数有明显的T4/T8 降低，应用FCM 行T4、T8 细胞计数及T4/T8 比值测定，可作为排除诊断的方法。第23 页，本讲稿共41 页n n 12感染免疫防御的作用之一是抗感染作用。用FCM 分类计数功能，可监测不同感染中淋巴细胞的变化。例如，疱疹病毒感染的特点是：T8+的细胞数目和比例增高，有时可见T8 表面有DR 抗原。另外，在细菌感染中可有T4/T8 增高。第24 页，本讲稿共41 页n n 13肿瘤一 般 认 为 机 体

13、 免 疫 低 不 是 肿 瘤 的 始动 因 素，而 细 胞 一 旦 发 生 癌 变，机 体 免疫 系 统 即 对 癌 细 胞 产 生 应 答，其 结 果 是消 灭 肿 瘤 细 胞，终 止 肿 瘤 的 发 展。应 用FCM 可 检 测 肿 瘤 相 关 抗 原，并 可 对DNA、RNA 的 变 化 及 淋 巴 细 胞 分 类 进 行 监 测，对肿瘤起至监测、预后评估的作用。第25 页，本讲稿共41 页n n113311淋淋巴巴瘤瘤、白白血血病病：可可以以协协助助确确定定细细胞胞来源，协助临床诊断和治疗。来源，协助临床诊断和治疗。n n 1 133 2 2其其它它肿肿瘤瘤：利利用用一一些些特特异异性

14、性的的标标记记物物，可以帮助肿瘤的早期诊断和治疗。可以帮助肿瘤的早期诊断和治疗。总之，利用总之，利用FCMFCM检测表面抗原、细胞内的检测表面抗原、细胞内的DNADNA、RNARNA含量可以发现恶变的肿瘤细胞。另外应含量可以发现恶变的肿瘤细胞。另外应用用FCMFCM 研究正常和肿瘤细胞增殖、分化及周期活动中 研究正常和肿瘤细胞增殖、分化及周期活动中抗原的表达，对认识肿瘤发生、发展、瘤细胞及肿瘤 抗原的表达，对认识肿瘤发生、发展、瘤细胞及肿瘤的异质性，肿瘤转移、诊断、治疗、药物耐药性的关 的异质性，肿瘤转移、诊断、治疗、药物耐药性的关系有重要意义。从而可用于临床肿瘤治疗中的临测，系有重要意义。从

15、而可用于临床肿瘤治疗中的临测，用药指导及预后评估。用药指导及预后评估。第26 页，本讲稿共41 页n n 14自身免疫疾病自 身 免 疫 疾 病 的 根 本 病 因 是 自 身 成 分具 有 抗 原 性 和 自 身 耐 受 性 的 破 坏。用FCM 对 淋 巴 细 胞 亚 群 分 类 计 数、测 定 循环 免 疫 复 合 物 及 某 些 免 疫 指 标，从 而 监测和诊断自身免疫性疾病。第27 页，本讲稿共41 页n n1144免疫抑制剂和免疫增强剂免疫抑制剂和免疫增强剂二者均可对免疫系统进行调节，引起相应的二者均可对免疫系统进行调节，引起相应的免疫细胞水平的变化。前者常用的是：糖皮质激免疫细

16、胞水平的变化。前者常用的是：糖皮质激素、素、CTXCTX、硫唑嘌呤等，后者常用的是：卡介苗、硫唑嘌呤等，后者常用的是：卡介苗、左旋咪唑等。用左旋咪唑等。用FCMFCM可检测到用药后免疫细胞的可检测到用药后免疫细胞的变化。如：糖皮质激素可降低变化。如：糖皮质激素可降低T4+T4+水平，从而可用水平，从而可用于疾病急性期限。环磷酰胺开始用时对于疾病急性期限。环磷酰胺开始用时对TT细胞影响细胞影响小，小，22 月后则出现 月后则出现T8+T8+细胞增高。所以应用 细胞增高。所以应用FCMFCM可通可通过免疫监测来指导用药，在不产生药物副作用的过免疫监测来指导用药，在不产生药物副作用的情况下发挥药物的

17、最大作用。情况下发挥药物的最大作用。第28 页，本讲稿共41 页2.器官移植中的作用n n 2.1移植前监测FCM 在移植前配型中有重要作用。其重要性在于抗体检测的特异性、敏感性和检测结果与移植结果的一致性。用它不仅可以检测ABO 抗原抗体，还可检测抗HLAI 和II 类抗原抗体，保证了供、受体ABO 及HLA 的基本一致性。第29 页，本讲稿共41 页n n 22移植后监测FCM 在监测移植后免疫状态变化及免疫抑制剂、全身免疫抑制剂过程是必不可少的有效手段。另外还可以检测抗异体蛋白，如：抗淋巴细胞IgG 及用于免疫抑制的Mabs 抗体的出现及特异性，从而对是否发生免疫排斥及急性早期排斥有一定

18、意义。第30 页，本讲稿共41 页n n 22临床应用n n 231 肾：现 已 将T 细 胞 亚 群 分 析 作 为监 测 同 种 异 体 肾 移 植 受 者 免 疫 状 态 的 一种方法。骨髓：FCM 的细胞表型分析使免疫重建的监测和对新生的免疫生物学状态的了解成为可能。第31 页，本讲稿共41 页n n 3.免疫治疗：许 多 疾 病 与 免 疫 系 统 功 能 发 生 障 碍有 关，而 某 些 疾 病 则 是 在 病 程 中 出 现能变化。n n 3.1FK-506 及天花粉蛋白两者均为高效免疫抑制剂。已用于临床。用FCM 通过监测人的免疫水平来判断疗效并调整药物及用量。第32 页，本讲

19、稿共41 页n n 3.2IL2n n 它 是 免 疫 系 统 中 重 要 的 细 胞 因 子。用FCM 检 测 可 发 现：IL-2 在 离 体 时 可 诱 导来 源HIV 患 者 外 周 血 的 单 核 细 胞 增 生 分 化。发 现IL-2 治 疗 可 使CD4 细 胞 提 高50%，故可周期性地用于HIV 患者。第33 页，本讲稿共41 页n n 3.3肿瘤免疫治疗近年来有了很大的进步。例如用IL-2活化的LAK 细胞治疗肾癌、黑色素瘤、直肠癌等有一定疗效。用FCM 可以估计治疗前后淋巴细胞亚群的变化以及活化状态，并判断免疫治疗的有效性。第34 页，本讲稿共41 页n n 3.4移植免

20、疫治疗目前临床移植配型以血清和细胞学为主，基因配型亦有发展。FCM 移植配型的临床重要性在于抗体检测的特异性，敏感性以及结果和移植结果的相关一致性。FCM 在监测移植后免疫状态变化和免疫抑制剂的疗效评估中是一项不可缺少的有效手段。第35 页，本讲稿共41 页流式细胞术在肿瘤学中的应用n n 一 一.肿瘤诊断肿瘤诊断包包括括监监测测癌癌前前期期病病变变，肿肿瘤瘤早早期期诊诊断断，交交界界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。DNA DNA非非整整倍倍体体的的出出现现可可能能是是癌癌变变的的一一个个重重要要标标志志，细细胞胞的的增增殖殖能能力力大大小小也也可可反反

21、映映肿肿瘤瘤的的生生物物学学特特性性。因因此此，临临床床上上可可利利用用流流式式细细胞胞术术进进行行细细胞周期分析和胞周期分析和DNADNA倍体分析，辅助肿瘤诊断。倍体分析，辅助肿瘤诊断。第36 页，本讲稿共41 页n n 一.肿瘤预后估计在病理组织学分级，临床分期等指标基础上，肿瘤DNA 倍体可更客观地预测预后。通常，异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率、死亡率都较二倍体肿瘤要高。已有文献报道，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中，异倍体和/或较高的S 期百分比都是不良预后的标志。同样地，在肺、头颈部、卵巢、肾细胞、子宫内膜癌，黑色素瘤、非何杰金淋巴瘤和各种白血病中，亦有类似发现。第37 页，

22、本讲稿共41 页n n 流 式 细 胞 仪 可 以 通 过 特 异 性 的 单 抗监 测 肿 瘤 细 胞 中 癌 基 因 表 达 产 物 的 水 平以研究肿瘤调控因素。n n 凋 亡 受 内 外 环 境 中 各 种 因 素 构 成 的网 络 控 制 和 基 因 控 制。利 用 各 种 调 控 因素 的 作 用，有 目 的 地 诱 导 或 控 制 细 胞 凋亡，可 能 是 增 加 化 疗 效 果，消 灭 肿 瘤 细胞的新途径。n n FCM 通过对凋亡的检测，可以研究调控因素如癌基因，r-射线，温度及化疗药物等对凋亡的影响，最终达到治病的目的。第38 页，本讲稿共41 页流式细胞仪在血液学中的应

23、用n n 一.白血病和淋巴瘤FCM 可 选 择 已 标 记 的CD 系 列 及 其 他单 克 隆 抗 体 对 白 血 病 进 行 免 疫 表 型 分 析，免疫表型分析，提高亚型诊断水平。白 血 病 细 胞 免 疫 分 型 的 特 点，反 映了 其 本 质 上 与 相 应 正 常 骨 髓 细 胞 的 差 异，白 血 病 细 胞 丧 失 了 正 常 细 胞 的 系 列 专 一性 和 分 化 阶 段 规 律 性，此 特 点 有 利 于 鉴别诊断和残存白血病鉴别。第39 页，本讲稿共41 页n n 一.网织红细胞记数FCM 可 以 大 量、快 速、敏 感、自 动化地监测网织红细胞数量变化通 过 对 红 细 胞RNA 量 和 细 胞 大 小 的分析，可了解红细胞生成动力学过程。第40 页，本讲稿共41 页n n 一.血小板疾病诊断BernardSoulier 综 合 征（BSS）GPIB-IX，GPV缺 陷（CD42b-42a），血 小 板 无 力 症GPIIb-IIIa（CD41-CD61）评 价 活 化 血 小 板 程 度 在 血 性 疾 患 和 血前 状 态 发 生 发 展 中 的 作 用。血 小 板 活 化状 态 下 表 达 的 蛋 白：a-颗 粒 蛋 白GMP140（CD62P，CD63）。第41 页，本讲稿共41 页